Введение к работе
Актуальность проблемы.
Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].
Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].
Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий -высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.
Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.
На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра, в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al,
2000; Prichard et.al., 2008]; описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из Gi - периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии Gi в М, в точке, обозначаемой как G2/M [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.
Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их смерти, а также для выбора адекватной терапевтической тактики для новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном их применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.
Цель исследования.
Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией при рождении и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена Сбо; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.
Задачи:
выявить прямые (ДНК и инфекционно активный вирус) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.
установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.
разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования различных методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.
установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.
оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.
изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена Сбо (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.
изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.
оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.
Научная новизна.
Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.
Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её относительное количество.
Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни - инфекционно активный ЦМВ.
Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена С6о- натриевой соли аминокапроновой кислоты
(Сбо-Na-AKK) и натриевой соли аминомасляной кислоты (Cwi-Na-AMK); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для Сбо-Na-AKK равен 260-2600; для Cf,o-Na-AMK - 2500-5450.
Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК; при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.
Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.
Практическая значимость.
На основании полученных данных о распространенности ЦМВ инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях патологии новорожденных.
Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авндности анти-ЦМВ.
Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования до года.
У недоношенных новорожденных, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.
Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.
Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент - ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ.
Впервые на представительном материале в системе мать-плацента-плод выявлены основные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.
Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральныи метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. - Москва, 2008. Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).
Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова г. Москвы.
Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.
Основные положения, выносимые на защиту.
Маркеры ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных с сочетанной врожденной патологией выявляются существенно чаще, чем у доношенных новорожденных. Недоношенные маловесные новорожденные являются группой риска по развитию ЦМВИ на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.
ПЦР in situ - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике герпесвирусных инфекций, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определенным тканям при изучении отпечатков органов. Метод эффективен для диагностики и изучения патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ и ВПГ при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Верификация инфекционных агентов при мертворождении, при выявлении врожденных пороков развития, несовместимых с жизнью, способствует адекватной терапии женщин с мертворождениями в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.
Аминокислотные производные фуллерена С(,о эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.
ЦМВ увеличивает длительность S - периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в
S - периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо
блокируются в метафазе. 5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с
клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез
вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических
митозов. Апробация работы.
Основные положения работы были представлены на 5 международной конференции «Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Glasgow, Шотландия, 2000; Saariselka, Финляндия, 2008); на 11, 12, 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001; 2002; 2003); на 3 Российском научном форуме "Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии" (Москва, 2001), на 3 Международной конференции "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем" (Махачкала, 2001), на 5 Международной конференции "Фуллерены и атомные кластеры" (С.-Петербург, 2002), на 8 Съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002), на Российском конгрессе "Генитальные инфекции и патология шейки матки" (Москва, 2004), на 3, 4 Конгрессе педиатров-инфекционистов "Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей" (Москва, 2004; 2005), на 8 Российском Форуме "Мать и дитя" (Москва, 2005), на 10, 11, 13 Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва, 2006; 2007; 2009), на Международном конгрессе «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Pattaya-Bangkok, Таиланд, 2007), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики" (Москва, 2007), на III Ежегодном конгрессе и VI Съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008).
В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела прикладной вирусологии и иммунологии, Отдела молекулярной вирусологии и лаборатории биохимии института экспериментальной ветеринарии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Учреждения РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 14 сентября 2009 года.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, в том числе 23 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, статей за рубежом - 1, в сборниках международных конгрессов за рубежом - 3, в сборниках материалов международных конгрессов и форумов - 38.
Струю-ура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 6-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 285 страницах текста, иллюстрирована 26 таблицами и 46 рисунками. Список цитированной литературы включает 124 отечественных и 325 иностранных источников.
Степень личного участия автора: разработка дизайна обследования беременных женщин, недоношенных новорожденных и материалов аутопсии; изучение влияния ЦМВ на пролиферативную активность клеток и антивирусной активности АПФ; организация работы на всех этапах: от определения возбудителей ВУИ различными методами до систематизации и анализа, а также статистическая обработка результатов проведены лично автором.
