Содержание к диссертации
Введение
П. Литературный обзор 11
П.1. Деградация мРНК с преждевременным стоп-кодоном 11
П. 1.1. Биологическое значение механизма NMD 11
II. 1.2. Механизм распознавания преждевременного стоп-кодна 15
П. 1.3. Уничтожение мРНК, в которой аппарат NMD обнаружил
преждевременный стоп-кодон 28
П.2. Посттранскрипционное умолкание генов (Posttranscriptional genes silencing, PTGS) 32
11.2.2. Индуцируемый РНК комплексумолкания генов 39
П.2.3. Системноеумолкание генов 40
П. 2.4 РНК-зависимое подавление транскрипции 42
II. 2.5 Вирусные супрессоры УГ. 42
II.3.Взаимодействие механизмов NMD и PTGS 45
III. Методы и материалы 46
III. 1. Реактивы 46
Ш.2. Ферменты и наборы 46
Ш.З. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 46
Ш.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК 48
Ш.4.1. Выделение плазмидной ДНК. 48
111.4.2. Электрофорез в агарозе 49
111.4.3. Рестрикция. Достраивание выступающих концов ДНК. Дефосфорилирование вектора 49
111.4.4. ЛигированиеДНК. 50
111.5. Количественный анализ РНК из высечек листьев N. bentamiana 50
111.5.1. Агроинфильтрация листьев N. bentamiana 50
111.5.2. Выделение РНК. 50
111.5.3. Нозерн-блот гибридизация 51
Ш.5.4. Изготовление одноцепочечного ДНК зонда 52
III. 5.5. Получение кДНК из РНК. 52
111.6. Получение генноинженерных конструкций 53
III.6.1. Клонирование конструкций GFP, Stop! 11, Stop360 и Stopl5 53
III. 6.2. Клонирование конструкций GFP-mRFP, GFPmRFPf. 53
III. 6.3. Клонирование конструкций GFP-X. 54
III6.4. Создание конструкции 35S-HGFP-RFP и 35S-GFP-IRES-RFP 54
111.6.5. Создание конструкцииPVX.GFP-RFP иPVX.GFPRFP/. 55
111.6.6. Клонирование конструкций Stop360рА и Stopl5рА 55
111.6.7. Создание конструкции 35S-GFP-h(MS2)-RFP, 35S-GFP-ash(MS2)-RFP, 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP и 35S-GFP-4Xash(MS2)-RFP 55
111.6.8. Создание конструкции 35S-CP(MS2) и 35S-CP(MS2)PABPf. 56
VI. Результаты и обсуждения 57
VI. 1. Чужеродные «нонсенс-РНК» деградируют в растительной клетке по механизму NMD 57
мРНК с длинными З'-НТО накапливаются с низкой эффективностью и редко встречаются в растительных клетках 60
VI.2. Деградация РНК с протяжённой З'-НТО, как и деградация «нонсенс» РНК, зависит от её трансляции 65
VI.3. Вирусные субгеномные мРНК с протяженной З'-НТО не подвержены NMD в растительной клетке 67
VI.4. В растениях, распознавание преждевременного стоп-кодона определяется его отдаленностью от поли-А хвоста мРНК 70
VI.5. Связывание РАВР с аберрантой мРНК вблизи ПСК стабилизирует
матрицу 72
VI.6. Белок томбусвирусов р19, связывающий siPHK не влияет на процесс специфической деградации аберрантных мРНК в растениях 75
VI.7. Деградация аберрантных мРНК не связана с образованием siPHK .76
VI.8. Деградация мРНК, обладающих длинной З'-НТО не вызывает
разрушение РНК сходной последовательности 77
V. Выводы 81
Список литературы
- Биологическое значение механизма NMD
- Выделение и анализ плазмидной ДНК
- Клонирование конструкций GFP, Stop! 11, Stop360 и Stopl5
- Деградация РНК с протяжённой З'-НТО, как и деградация «нонсенс» РНК, зависит от её трансляции
Введение к работе
Центральная догма молекулярной биологии декларирует, что последовательность нуклеотидов ДНК определяет последовательность нуклеотидов мРНК, которая, в свою очередь определяет последовательность аминокислот белка.
Однако в процессе передачи информации по данной цепочке могут возникать ошибки. Такие ошибки приводят к образованию полипептидов, нередко вредных для клетки. Поэтому в клетке существует ряд механизмов, предотвращающих появление таких "ошибочных" молекул полипептидов.
Если причиной образования такого полипептида явилась случайная ошибка трансляции, появление нескольких таких молекул не является существенным событием для клетки. Скорее всего, такая молекула будет неспособна адекватно свернуться и образовать ядро из гидрофобных участков. Такие молекулы могут обладать нестабильной третичной структурой и нести на своей поверхности гидрофобные участки, которые способствуют слипанию таких молекул. Несвернувшиеся молекулы полипептида подвергаются протеолизу в протеосомах (Gelman and Kopito, 2002).
Если же ошибка произошла в процессе транскрипции или созревания мРНК, это может повлечь за собой образование значительного количества аномальных полипептидов. Для эукариот показано существование специфического механизма "контроля качества" мРНК. Прежде всего, отбор ведётся на уровне экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Матрицы, не обладающие кэп-структурой, поли-А-терминальной последовательностью или обладающие нитронами не экспортируются в цитоплазму.
После выхода из ядра, происходит своеобразная "проверка качества матрицы", которая заключается в проверке соответствия открытой рамки считывания данной мРНК определённым требованиям.
Прежде всего, рамка считывания мРНК должна иметь эффективно распознаваемый аппаратом трансляции стоп-кодон. В случае отсутствия
стоп-кодона, или в случае наличия в рамке только слабо распознаваемого стоп-кодона, такие мРНК подвергаются деградации (Akimitsu, 2008).
В случае наличия распознаваемого рибосомой стоп-кодона, этот кодон должен занимать строго определённое место: должен находиться в конце нативной открытой рамки считывания (то есть области, кодирующей требуемый белок). Если стоп-кодон находиться в середине нативной рамки, он носит название преждевременного стоп-кодона (ПСК). Наличие ПСК свидетельствует либо о возникновении нонсенс-мутации, либо о сбое рамки трансляции. В обоих этих случаях, трансляция матрицы приводит к образованию "ошибочного" полипептида. Для предотвращения трансляции этих мРНК, существует механизм, обнаружения и элиминирования таких матриц. Он получил название нонсенс обусловленного распада (nonsense-mediated decay, NMD) (Maquat et al, 1981; Peltz et al., 1993).
Этот механизм хорошо изучен в животных и дрожжевых клетках. Однако мало что известно о механизме NMD у растений. Показано, что возникновение нонсенс-мутаций и сдвиг рамки считывания приводит к существенному снижению уровня накопления соответствующей мРНК. Это было продемонстрировано в экспериментах с генами ингибитора трипсина (Kti3) сои (Dickey et al., 2004) фитогемагглютинина (РНА) бобов (van Hoof and Green, 1996), ферредоксина-1 (Fed-1) табака (Petracek et al., 2005) и геном waxy риса (Isshiki et al., 1996).
Основной принцип реализации механизма NMD у дрожжей и млекопитающих одинаков: определение корректности расположения стоп-кодона связано со специфическими мотивами в мРНК, которые взаимодействуют со специализированными белковыми комплексами. Такие области мРНК можно обозначить термином "маркеры естественной кодирующей области" (natural ORF markers, NOMs). Если происходит преждевременная терминация синтеза белка, аппарат трансляции оказывается неспособен удалить с матрицы все белковые комплексы,
связанные с NOM. Такие мРНК распознаются механизмом NMD как аберрантные и подвергаются деградации.
В данной работе исследовался вопрос: каким образом механизм NMD растений распознаёт мРНК, содержащие ПСК и насколько от сходен с механизмом, описанным для дрожжей и млекопитающих.
В последнее время появились данные о том, что механизм NMD тесно связан с механизмом умолкания генов (Gazzani et al., 2004). Поскольку механизм умолкания генов хорошо изучен для растений, установление взаимосвязи этих процессов в растениях дало бы возможность приблизиться к пониманию реализации NMD у растений. Поэтому одним из аспектов данной работы было произведено изучение роли РНК- интерференции в специфической деградации мРНК, содержащих ПТС.
Биологическое значение механизма NMD
Матрицы с преждевременным стоп-кодоном могут образовываться по разным причинам, например из-за появления нонсенс-мутации в кодирующей области или мутации, приводящей к сдвигу рамки трансляции. Поскольку размер кодирующей области, как правило, больше области промотора, такие мутации являются причиной нарушения экспрессии генов в значительном числе случаев (Gadjieva et al., 2004).
Белки, синтезируемые с таких матриц, опасны тем, что не способны корректно выполнять все возложенные на них функции. Например, такой укороченный фермент может связывать лиганд, но не может катализировать химическую реакцию. Более опасным может быть вариант, когда образуется фермент не обладающей регуляторным доменом.
Для механизма NMD показана ещё одна важная функция: деградация транскриптов, которые в норме постоянно образуются в клетке, но их трансляция не желательна. Речь, прежде всего, идёт об несплайсированных мРНК, определённых продуктах альтернативного сплайсинга некоторых генов.
Известно, что короткие интроны, как правило, распознаются и вырезаются менее эффективно, чем длинные (Berget, 1995). Появление несплайсированных матриц в цитоплазме может привести к синтезу "ошибочных" полипептидов. Для предотвращения возможности возникновения таких матриц, в процессе эволюции, по всей видимости, происходил отбор на появление в коротких интронах стоп-кодонов, которые попадают в рамку трансляции, в случае неэффективного сплайсинга. Анализ последовательности коротких интронов (60-120 нт) представителей различных царств эукариот показал, что у всех протестированных организмов встречаемость таких стоп-кодонов, выше случайной. При этом частота обнаружения таких стоп-кодонов в длинных интронах близка к случайной. Было выдвинуто предположение, что наличие стоп-кодона в интроне позволяет вызвать деградацию несплайсированной мРНК по механизму NMD. Для проверки этого была получена линия простейшего Paramecium tetraurelia, с нокаутом по одному из факторов NMD, белку UPF1 (подробнее об этом белке см. ниже). Было показано увеличение количества несплайсированных мРНК, содержащих короткие интроны. Интересно, что короткие интроны, не содержащие стоп-кодонов одинаково хорошо вырезались как у простейшего дикого типа, так и у накаутной парамеции. По всей видимости, эти интроны вырезаются достаточно эффективно, поэтому отбор на появление в них стоп-кодонов не происходит (Jaillon et al., 2008).
Помимо отбора несплайсированных мРНК, механизм NMD позволяет производить отбор определённых продуктов альтернативного сплайсинга. Особенно актуален этот механизм для млекопитающих. У представителей этого класса показано наличие альтернативного сплайсинга у 40-80% генов (Modrec et al. 2003). Приблизительно 30% продуктов альтернативного сплайсинга обладает ПСК, и подвергается деградации по механизму NMD (Lewis et al., 2003). Зачастую этот феномен используется для регуляции экспрессии гена. Так, например, было показано, что белок р53 способен подавлять синтез протоонкогена H-ras, воздействуя на сплайсинг его матрицы. В результате активизации р53 происходит изменение активности фактора сплайсинга SC35, участвующего в созревании мРНК H-ras, что приводит к образованию продукта альтернативного сплайсинга, который подвержен деградации по механизму NMD (Barbier et al., 2007).
Известно, что у дрожжей, интроны встречаются достаточно редко, однако и у этих организмов механизм NMD используется не только для отбора мРНК с нонсенс-мутацией или сдвигом рамки. Для дрожжей описано участие NMD в деградации мРНК с аномально длинными З НТО, образующимся вследствие нарушения терминации транскрипции (Muhlrad and Parker, 1999).
Эти функции можно рассматривать как один из аспектов глобальной роли механизма NMD, как главного контролёра качества матриц. Таким образом, NMD является универсальным механизмом, позволяющим оценить как "ошибочные" и матрицы, обладающие ПСК в результате мутаций или нарушения транскрипции, так и мРНК, сплайсинг которых прошёл некорректно.
NMD, как и любой другой механизм, позволяющий разрушать строго определённые мРНК, не затрагивая другие, может быть использован и для регуляции экспрессии определённых генов. Так, помимо деградации "ошибочных" матриц, то есть собственно функции контроля качества, механизм NMD участвует в регуляции экспрессии многих нормальных генов.
Простейший вариант использования механизма NMD для регуляции экспрессии гена состоит в следующем: нормальный стоп-код он гена распознаётся механизмом NMD как преждевременный, таким образом, изначально снижается уровень экспрессии гена. Такой вариант актуален для синтеза белков, количество которых постоянно должно быть невелико. Экспрессия таких генов повышается только в случае нарушения механизма NMD. Однако в этом случае, скорее всего, в клетке будет происходить увеличение количества продуктов трансляции аберрантных матриц, приводящее к гибели клетки. В этом случае для клетки актуально активизировать либо гены белков, участвующих в механизме NMD, либо, способствующих развитию апоптоза для уничтожения клетки, в которой происходит накопление "ошибочных" полипептидов.
Выделение и анализ плазмидной ДНК
ПНР проводили в объеме 50 мкл в следующих условиях: 1-кратный реакционный буфер (10 mM Tris-HCl (рН=8,3), 50 тМ КС1, 1,5 тМ MgC12,) содержал дезокситрифосфаты в конечной концентрации 0,25 тМ, олигонуклеотиды в конечной концентрации 1 пМ и 2-3 ед. Taq-полимеразы; матричная ДНК добавлялась в количестве до 1 мкг. Сверху на пробу наслаивалось 30-40 мкл минерального масла. При работе использовался ДНК-амплификатор "Терцик" фирмы "ДНК-технология" (Россия). Обычно реакция проходила в следующих условиях: плавление ДНК - 94С, 1 мин, отжиг затравок, в зависимости от олигонуклеотида, при 56-60С, 2 мин, элонгация цепей ДНК на 72С, 1-3 мин, исходя из расчета 1 мин. на 1000 нуклеотидов последовательности. Как правило, продолжительность амплификации составляла 25-35 циклов.
Для очистки продуктов ПНР реакционную смесь обрабатывали равными объемами фенола и фенол-хлороформа и переосаждали с 3 объемами 96% этанола и 1/10 объема З М ацетата натрия, промывали 70% этанолом и растворяли в тридистилляте. При клонировании использовались штаммы Е. coli JM-109 и XL-1. Для приготовления компетентных клеток и трансформации бактерий использовали модифицированные методики Ханаана и др. (1988). ШАЛ. Выделение плазмидной ДНК. Бактериальный клон высевали в 2 мл бульона 2YT (Sambrook et al., 1989), содержавшего ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и выращивали в течение ночи при 37С в режиме 185 качаний/мин. Для дальнейших операций использовалась настольная центрифуга фирмы "Eppendorf" (Германия) и пробирки той же фирмы. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин. (5000 об/мин), ресуспендировали в 200 мкл 1 лизирующего раствора (тридистиллированная вода) и добавляли 200 мкл 2 лизирующего раствора (0,2 М NaOH, 1% SDS), осторожно перемешивали и выдерживали 5 мин. во льду. К лизату клеток добавляли 200 мкл 3 лизирующего раствора (З М ацетат натрия, рН 4,8) перемешивали и центрифугировали 10-15 мин. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли равный объем изопропанола, центрифугировали 10-15 мин (14000 об/мин), осадок промывали 70% этанолом, высушивали, а затем растворяли в 50-100 мкл воды. Далее добавляли равный объем 7,5М ацетата аммония (рН 5,0), тщательно перемешивали и выдерживали 20 мин. при -20С. После центрифугирования в течение 10 мин. на 14000 об/мин, супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 2-3 объема этанола и помещали пробирки на 15-20 мин. в кельвинатор (-70 С). После этого ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин. (14000 об/мин), осадок промывали 70% этанолом, высушивали, а затем растворяли в 50-100 мкл воды. РНК или ДНК пробы в буфере, содержащем 10% глицерина и 0,025% бромфенолового синего наносили в 0,8-1,5 % агарозный гель, электрофорез проводили при напряжении 80-100 В в 1-кратном ТАЕ.
Выделение ДНК из агарозы проводили с использованием магнитных частиц фирмы "Силекс-М" (Москва).
Рестрикцию, как правило, проводили в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержала соответствующий 1-кратный буфер, 10-30 единиц рестриктазы, РНКазу в концентрации 0.05 мкг/мкл (в случае рестрикции для транскрипции РНКазу не добавляли), 1-3 мкг ДНК. Рестрикционную смесь инкубировали на 37С в течение 1.5-2 часов.
Для достраивание выступающих концов использовали фрагмент Кленова, 10 единиц которого добавляли в рестрикционную смесь, также добавляли dNTP до 0.25 мМ каждого. Инкубировали 30 мин. на 37С. Фермент инактивировали при температуре 75С в течение 10 мин. Для дефосфорилирования вектора использовали щелочную фосфатазу из желудка телёнка. Инкубировали 30 мин. на 37С. Фермент инактивировали переосаждением.
Клонирование конструкций GFP, Stop! 11, Stop360 и Stopl5
Конструкция 35S-GFP (также обозначаемая GFP-40) была сделана на основе вектора рСатЬіаІЗОО (любезно предоставленный доктором Сринивазаном Кандагаром из Национального Университета Сингапура) в который по сайтам Hindlll/Ncol был вставлен 35S промотор и S1 лидер CaMV, по сайтам NcoI/BamHI был вставлен синтетический ген GFP (Chiu et al., 1996) и по сайтам ВатШ /EcoRI вставлен 35S терминатор транскрипции CaMV.
Конструкции Stop711, Stop360 и Stopl5 были получены путем замещения гена GFP в 35S-GFP по сайтам NcoI/ВатШ продуктом ГЩР GFP с соответствующими стоп-кодонами. ГЩР проводилась с использованием праймеров "GFPNco+", "GFP-Stopl5-p", "GFP-Stop360-p", "GFP-Stop360-m", "GFP-Stop711-m".
Клонирование конструкций GFP-mRFP, GFPmRFPf. Плазмида 35S-GFP-RFP (также обозначаемая GFP-720) была получена клонированием гена mRFP в 35S-GFP по сайтам BamHI/EcoRI. Фрагмент, содержащий mRFP, был получен при помощи ГЩР с праймеров "RFP(+)" и "RFP(-)". Ген GFP, не имеющий стоп-кодона, был получен в результате ГЩР с использованием праймеров "GFP-Nco+" и "GFPw/o stop". Далее этот продукт ПЦР был лигирован в 35S-GFP-RFP по сайтам NcoI/BamHI вместо GFP, так была получена конструкция 35S-GFPRFPf. Клонирование конструкций GFP-40 и GFP-720 описано в предыдущих абзацах. Фрагмент, содержащий последовательность области внутренней посадки рибосомы IRESCP,148Cr (Dorokhov et al., 2002) фланкированный сайтами Kpnl, был получен при помощи праймеров "IREScpKpn-" и "GFPDir+" и вставлен в прямой или обратной ориентации в 35S-GFP по сайту Kpnl после гена GFP. Таким образом, были получены конструкции GFP-180a и GFP-180Ь. Проверка ориентации производилась с помощью рестрикции полученных плазмид, с последующим разделением фрагментов в электрофорезном геле. Для создания конструкции GFP-380 тот же продукт ПЦР был вставлен дважды в прямой ориентации.
Конструкции GFP-340a, GFP-340b представляли собой вектор рСатЬіаІЗОО, в который последовательно были вставлены 35S промотор с S1 лидером по сайтам Hindlll/Ncol, ген GFP по сайтам NcoI/ВагпШ, 5 -проксимальная часть гена RFP длиной 340 нт по сайту BamHI (в случае GFP-340а в прямой ориентации, для GFP-340b - в обратной) и 35S терминатор по сайтам BamHI /EcoRI.
Конструкция GFP-1010 была получена клонированием после гена GFP гена белка оболочки PVX (полученного с помощью ПЦР с плазмидой pPVX201 (любезно предоставленной Д.Болкомбом) и праймерами PVXCPNco+ и PVXSacI-), слитого с IRESCP,148Cr в обратной ориентации.
Последовательность, образующая стабильную вторичную структуру ("шпильку") в составе РНК, была взята из конструкции GFP-IRES-GUS (Dorokhov et al., 2002). и лигирована перед геном GFP в 35S-GFP-RFP по сайтам Kpnl /Ncol, результатом чего стала плазмида 35S-hGFP-RFP. IRESCP,148Cr был клонирован между генами GFP и RFP в 35S-GFP-RFP с использованием сайтов ВатШ-NcoL Таким образом, получена конструкция 35S-GFP-IRES-RFP. При этом был восстановлен стартовый кодон гена RFP . Плазмиды, содержащие вирусные векторы, были сделаны на основе
PVXdt-GFP (Komarova et al., 2006) с использованием промежуточных конструкций. Конечная конструкция, PVX:GFP-RFP, содержала 35S-промотор, 5 -НТО и ген РНК-зависимой РНК-полимеразы PVX, субгеномный промотор, ген GFP, ген RFP без стартового ко дона, З -НТО PVX и 35S-терминатор. PVX:GFPRFPf отличается только тем, что ген GFP не имеет стоп-кодона, при этом образуется ген слитого белка GFPRFPf.
Фрагменты GFP-RFP и GFPRFPf были вставлены по сайтам Ncol/ Xbal в PVXdt-GFP (Komarova et al., 2006) вместо гена GFP с образованием PVX:GFP-RFP и PVX:GFPRFPf соответственно.
Конструкции Stop360 рА и Stop 15 рА были получены клонированием межцистронной области конструкции GFP-A60-GUS (Dorokhov et al., 2002), содержащей последовательность из 60 аденинов, в середину гена GFP по сайту PstI в конструкции Stop360 и Stopl5 соответственно.
Деградация РНК с протяжённой З'-НТО, как и деградация «нонсенс» РНК, зависит от её трансляции
Данный эффект можно объяснить допустив, что общая схема реализации NMD у растений и млекопитающих одинакова, т.е. распознавание РНК с ПСК происходит на особом этапе жизненного цикла РНК - пионерском раунде трансляции и требует наличие белков, связывающихся с мРНК в ядре.
Определённое подтверждение эта гипотеза нашла при изучении таксономии вирусов. Мы проанализировали таксономическую базу данных вирусов (ICTV database) и подсчитали количество семейств (и отдельно — родов) ДНК- и РНК-содержащих вирусов, заражающих животных и растения. Оказалось, что к настоящему моменту известно приблизительно одинаковое число ДНК и РНК вирусов животных (соответственно 8 и 11 семейств, 42 и 50 родов). В то же время, было обнаружено, что ДНК-вирусы среди вирусов растений встречаются гораздо реже - только 3 семейства по сравнению с 9-ю РНК вирусов и только 13 родов по сравнению с 55. Возможно, полицистронные РНК ДНК-содержащих вирусов растений не могут избежать NMD. Следовательно, РНК-содержащие вирусы имеют по сравнению с ДНК-содержащими определенные преимущества с эволюционной точки зрения.
В растениях, распознавание преждевременного стоп-кодона определяется его отдаленностью от поли-А хвоста мРНК.
В этой части работы мы исследовали вопрос, какое именно расстояние критично для определения ПСК: расстояние до поли-А хвоста или расстояние до физического 3 -конца молекулы? Для ответа на данный вопрос были сделаны 2 конструкции: в гене GFP конструкций Stop360 и Stop 15 нуклеотиды с 366 по 426 были заменены на аденины (Рис.18) Таким образом, после ПСК конструкции Stop360 был внесен протяжённый поли-А-участок.
Было показано, что конструкция, содержащая ПСК, после которого располагается поли-А последовательность, накапливается существенно эффективнее аналогичной конструкции, не содержащей внутренней поли-А последовательности. При этом уровень накопления данной конструкции практически неотличим от уровня накопления конструкции, не содержащей ПСК (Рис 19). Таким образом, подтверждается предположение о том, что детерминация ПСК у растений происходит путём измерения расстояния от стоп-кодона до поли-А. л ь J&
Нозерн-блот анализ РНК, вьщеленной из листьев N. benthamiana, агроинъецированных этими конструкциями. Детекция мРНК осуществлялась комплементарным к GFP ДНК-зондом, меченным [a-32P]dATP. Контроль нанесения приведен на нижней панели.
Связывание РАВР с аберрантой мРНК вблизи TICK стабилизирует матрицу. В предыдущем эксперименте было показано, что приближение поли-А последовательности к ПСК стабилизирует аберрантую мРНК. В данной работе была произведена попытка определить, вызван ли данный эффект прямым взаимодействием аппарата NMD и поли-А, либо опосредован определёнными белок-белковыми взаимодействиями. Основным белком, связанным с поли-А последовательностями мРНК является поли-А-связывающий белок ( poly-A binding protein, РАВР). Для того чтобы выявить роль РАВР, создана следующая экспериментальная система. Ген белка РАВР из N. benthamiana объединили в одну рамку с геном белка оболочки фага MS2 в конструкции 35S-CP(MS2)PABPf. Известно, что белок оболочки фага MS2 способен связываться с определённой 19-нт шпилечной структурой в РНК фага MS2. Эта структура была поставлена через 6 нт после стоп- кодона в конструкции 35S-GFP-RFP (Рис 20). Поскольку с поли-А последовательностью, как правило, связаны несколько молекул РАВР, была создана конструкция с несколькими шпильками, идущими подряд (Рис 20). Для контроля были созданы аналогичные конструкции, несущие инвертированные последовательности шпилек: такие последовательности способны к образованию вторичной структуры, но не связывают белок оболочки MS2 (Рис 20).
Схема конструкций. Показан инвертированный повтор, образующий стабильную вторичную структуру в РНК, способный (на схеме направленный вверх) или не способный (на схеме направленный вниз) связываться с белком оболочки фага MS2.
В листья N.benthamiana вводили суспензию агробактерий, содержащих конструкции 35S-GFP-h(MS2)-RFP, 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP, 35S-GFP-ash(MS2)-RFP, и 35S-GFP-4Xash(MS2)-RFP. Каждая из агробактерий, содержащих эти конструкции, инфильтрировалась в 2 вариантах: (а) в сочетании с агробактерией, содержащей конструкцию 35S-CP(MS2)PABPf, несущей 35S промотор, слитый ген белка оболочки фага MS2 и РАВР, и 35S терминатор; и (б) в сочетании с агробактерией, содержащей конструкцию 35S-CP(MS2), которая включает в себя 35S промотор, ген белка оболочки фага MS2 и 35S терминатор.
Мы получили результаты, свидетельствующие о том, что связывание РАВР после ПСК повышает стабильность конструкций 35S-GFP-h(MS2)-RFP и 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP (Рис 21). С другой стороны присоединение белка оболочки фага MS2 к мРНК конструкций 35S-GFP-h(MS2)-RFP и 35S-GFP 4Xh(MS2)-RFP не повлияли на стабильность этих матриц (Рис 21). Наличие в клетке белка CP(MS2)-PABP также не повышало стабильность мРНК 35S GFP-ash(MS2)-RFP, сходной по строению с мРНК 35S-GFP-h(MS2)-RFP, но не способной связывать этот химерный белок вблизи стоп-кодона (Рис 21). 35S-CP(MS2)PABP(fuse) 35S-CP(MS2) 35S-CP(MS2)-PABP(fuse)
Нозерн-блот анализ РНК, выделенной из листьев N. benthamiana, агроинъецированных конструкциями A 35S-GFP-h(MS2)-RFP, В 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP, С 35S-GFP-ash(MS2)-RFP и D 35S-GFP-4Xash(MS2)-RFP в сочетании с конструкциями 35S-CP(MS2)-PABP(fuse) и 35S-CP(MS2). Детекция мРНК осуществлялась комплементарным к GFP ДНК-зондом, меченным [a- PJdATP. Контроль нанесения приведен на нижней панели. Ниже приведено соотношение количества РНК, содержащей последовательность GFP к рРНК, нормированное на соотношение, рассчитанное для конструкции 35S-GFP-ash(MS2)-RFP.
Стабильность всех 4 конструкций, в отсутствии белка CP(MS2)-PABP была примерно одинакова и сходна со стабильностью конструкции 35S-GFP-RFP (данные не представлены).
