Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 РНК полимераза
1.1.1 Строение РНК полимеразы
1.1.2 Особенности транскрипции РНК полимеразой
1.1.3 Строение промотора РНК полимеразы
1.1.4 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы
1.2 РНК полимераза
1.2.1 Строение РНК полимеразы
1.2.2 Строение промотора РНК полимеразы
1.2.3 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы
1.2.4 Терминация транскрипции РНК полимеразы
1.3 РНК полимераза
1.3.1 Строение промотора РНК полимеразы
1.3.2 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы
1.3.3. Терминация транскрипции РНК полимеразы
1.4 Митохондриальная РНК полимераза
1.4.1 Характеристика генома митохондрий
1.4.2 Строение митохондриальной РНК полимеразы
1.4.3 Промоторы митохондриальной РНК полимеразы и особенности ее транскрипции
1.4.4 Транскрипционный комплекс митохондриальной РНК полимеразы транскрипции
2. Материалы и методы
2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка 39
2.2. Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов 40
2.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорд 41
2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле 41
2.5. Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекция 41
2.6. Норзерн блот анализ 42
2.7. Приготовление проб для гибридизации на кДНК микроаррее 43
2.8. ОТ-ПЦР анализ 43
2.9. Выделение геномной ДНК из клеток эукариот 46
2.10. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 47
2.11. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 48
2.12. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами 49
2.13. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 49
2.14. Реакция лигирования 49
2.15. Получение конструктов и сиквенирование фрагментов к ДНК митохондриальной РНК полимеразы 50
2.16. Получение экслрессионньгх лентивирусных конструктов 51
2.17. Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий 54
2.18. Идентификация промоторов ALDH12 и ZBTB1, получение конструктов, содержащих изучаемые промоторы 55
2.19. Измерение активности люциферазы 59
2.20. Хроматиновая иммунопреципитация 60
2.21. Иммунофлуоресценция 62
3. Результаты и обсуждение
3.1. Обнаружение аномального поведения транскрипта гена PIG3 в ответ на обработку клеток а-аманитином, не характерного для генов, транскрибируемых РНК полимеразой II 64
3.2. Дополнительный транскрипт, размером 2.3 kb, является специфичным и кодируется геном PIG3 65
3.3. Идентификация и анализ транскриптов, которые подобно второму транскрипту гена PIG3, активируются в ответ на обработку а -аманитином 66
3.4. Характеристика транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 68
3.5. Экспрессия генов, устойчивых к а -аманитину, возрастает после подавления РНК полимераз Ї или II 71
3.6. Экспрессия а-аманитин устойчивых генов снижается после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы 73
3.7. Белок, узнаваемый антителами к митохондриальной РНК полимеразе обнаруживается как в митохондриях, так и в ядре 78
3.8. Существование двух форм белка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимеразе 79
3.9. Доказательство существования альтернативного сплайсинга в гене митохондриальной РНК полимеразы 82
3.10. РНК полимераза IV кодируется альтернативной формой мРНК 84
3.11. Альтернативная форма РНК действительно способна кодировать ядерную форму белка ПО кД 86
3.12. Для трансляции белка РНК полимеразы IV используется шестой стартовый ATG кодон 88
3.13. Идентификация промоторов генов ALDH12, ZBTB и MGC3265 91
3.14. Характеристика промоторов генов ALDH12 и ZBTB1, демонстрирующих устойчивость к а -аманитину и транскрибируемых РНК полимеразой IV 93
3.15. Промоторы генов ALDH12, ZBTB1 и MGC3265, регулируемых РНК полимеразой IV, содержат общий структурно-функциональный мотив 95
3.16. Промоторы генов, регулируемых РНК полимеразой IV, не активируются энхансерами, стимулирующими транскрипцию РНК полимеразы II 96
3.17. РНК полимераза IV обладает способностью связываться с промотором гена ALDH12 97
3.18. Количественная оценка числа генов человека, транскрипция которых происходит с участием РНК полимеразы IV 99
Заключение 101
Выводы 102
- РНК полимераза
- Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов
- Измерение активности люциферазы
- Характеристика транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12
РНК полимераза
Функцией РНКП I является синтез рибосомальной РНК (18S и 28S). Рибосомальная РНК представляет основной продукт транскрипции в клетке, на долю которого приходится около 80-90% от общей массы РНК. РНКП I расположена в клетке преимущественно в ядрышках. При микроскопии ядрышки имеют характерную структуру, и состоят из волокнистой сердцевины, окруженной зернистым ободком. Волокнистая сердцевина является местом транскрипции рибосомальной РНКП I. Зернистый ободок представлен рибонуклеопротеидными частицами, основной составляющей которого является рибосомальная РНК [41]. В процессе транскрипции образуется единый предшественник рибосомальной РНК (45 S), в результате последующего расщепления которого образуются отдельные молекулы 28 S и 18S РНК. По-видимому, существует несколько независимых участков транскрипции, разделенных внутренними нетранскрибируемыми спейсерами (IGS), которые составляют кластер. Благодаря этому, несколько молекул РНКП I могут одновременно вести транскрипцию на одной матрице. 1.2.1. Строение РНК полимеразы I. Ядерные РНК полимеразы являются сложными мультикомпонентными ферментами, в состав каждого из которых может входить 12 и более субъединиц [42], причем пять субъединиц (АВСЮа, АВСЮр, АВС14.5, АВС23 и АВС27) являются общими для всех трех полимераз. Кроме этого, полимераза I и полимераза III делят между собой еще две субьеденщды (АС19 и АС40) [43],которые не обнаружены в составе комплекса полимеразы II, но которые по функции соответствуют субъединицам В12,5 и В44 РНКП II [44, 45]. Существование общих субъединиц закладывает возможность координированной регуляции транскрипции разными полимеразами. [46]. 1.2.2. Строение промотора РНК полимеразы I. Промотор РНКП I состоит из двух функциональных участков, разделенных нетранскрибируемым спейсерами. Центральный, (коровый) участок промотора (СР), окружающий точку старта транскрипции, необходим и достаточен для инициации. Он представлен преимущественно ГЦ-богатой последовательностью [47], а также короткой консервативной ТАТА-подобной последовательностью вокруг точки старта, рибосомального инициатора InR [48]. Впрочем, несмотря на сходство с ТАТА-мотивом„ InR не является сайтом взаимодействия с TATA связывающем белком ТВР. Существуют и другие элементы, способствующие сборке и стабилизации комплекса на коровом участке промотора. Одну из ключевых ролей в этом процессе играет вышележащий промоторный элемент, UPE, который значительно усиливает интенсивность транскрипцию, но не является обязательным для ее инициации.
Он представлен ГЦ- богатыми участками, гомологичными последовательностям в коровой зоне промотора [49, 50] UPE связывает фактор, который является посредником при сборке транскрипционного комплекса. Еще один многофункциональный компонент промотора, проксимальный терминатор РТ, располагается выше UPE и выполняет ряд функций, таких как: защита промотора от "блуждания" полимеразы [51, 52], участвует в перестройке хроматина [53] и укладке рибосомальной РНК [54] (Рис. 2). Проксимальный терминатор вносит вклад в координацию процесса транскрипции. Известны организмы, например, S. cerevisia,, у которых проксимальный терминатор представлен в неправильной ориентации, но, тем не менее, сохраняет способность связываться с фактором терминации и координировать транскрипцию. Описанный принцип организации промотора РНКП I универсален для большинства видов, хотя сама последовательность промотора имеет строгую [55], но не абсолютную видовую специфичность [56]. Сходство в последовательности промотора между разными видами минимальное, в то время как, основа функционального элемента промотора высоко консервативна у всех видов [57]. В виду разнообразия промоторной последовательности у разных видов, РНКП I некоторых организмов приобретает потенциальную возможность выполнять нехарактерные для нее функции. Так, известно, что у Trypanosoma cruzi РНКП I способна транскрибировать не только рибосомальную РНК, но и два белок-кодирующих гена, однако, не с характерного для нее промотора [58]. 1.2.3. Транскрипционный комплекс полимеразы I. По аналогии с РНКП II, для работы полимеразы I требуются дополнительные факторы. Для большинства систем необходимым и достаточным является транскрипционный фактор, который связывается с коровой частью промотора. У разных видов он известен под разным названием (TIF-IB - у мыши и A. castellanii, SL1 - у человека и крысы, Ribl - у Xenopus, CF - у дрожжей), хотя выполняемая им функция аналогична. . Это основной фактор инициация транскрипции рибосомальной РНК. Он включает в себя TATA связывающий белок ТВР, а также три или четыре (в зависимости от вида) дополнительные субъединицы, известные как группа факторов, ассоциированных с ТВР (TAFls) [59, 60]. Эти факторы способны взаимодействовать как между собой, так и с ТВР. В присутствии ТВР они выполняют функцию, аналогичную факторам TFIID и TFIIIB в транскрипционной системе РНКП II и РНКП III, соответственно. Основная функция TAF-IB заключается в установке полимеразы на промоторе перед началом транскрипции. Помимо TAF-IB, для повышения эффективности транскрипции требуется фактор UBF, взаимодействующий с элементом, расположенным выше от промотора, который, связываясь с ГЦ- богатыми участками, помогает TAF-IB в сборке и укреплении на промоторе [61]. UBF представляет собой димер полипептида размером 90-100 кД, N-конец которого представлен димеризационным доменом, за которым, в центральной части белка, располагаются от четырех до шести ДНК-связывающих доменов, а С-конец представлен кислым серин-богатым участком [62]. Димер UBF способен покрывать своими ДНК связывающими доменами участок ДНК размером около 135-160 оснований и образовывать достаточно устойчивую структуру, названную энхансомой [63]. Было также обнаружено, что коровый и UBF элементы промотора РНКП I могут экспонироваться на поверхности двух смежных энхансом. Это облегчает процесс связывания ядерных факторов с промотором за счет одновременного взаимодействия как с коровым, так и с UBF элементами [64]. Кроме того, UBF способен напрямую контактировать с ядерными факторами, помогая последним связываться с промотором [65]. У человека такой контакт осуществляется за счет взаимодействия фактора TAF1-48 (48 кД белок, ассоциированный с ТВР) с С-концевым участком фосфорилированного UBF [66]. В зоне нетранскрибируемого спейсера, между активными точками транскрипции, могут содержаться элементы, выполняющие функцию энхансеров.
Энхансеры представляют собой цис-активные элементы, располагающиеся как выше, так и ниже от промотора, которые способны значительно усиливать активность промотора [67, 68]. Механизм их действия не совсем ясен. Так, было показано, что у Xenopus энхансер может стимулировать транскрипцию даже не будучи в цис-ориентации по отношению к промотору. Если в ооциты Xenopus ввести ДНК, содержащую промотор, сцепленный с энхансером, после инъекции связь промотора с энхансером мгновенно терялась, но активационная функция энхансера продолжала сохраняться [69]. Возможно, энхансеры работают как некие загрузочные агенты промотора, обеспечивая его лимитирующими факторами, У позвоночных кандидатом на роль такого фактора является UBF, который, как было показано, может связывается с энхансерными элементами [70]. Однако, энхансеры, преобладающие в транс-ориентации и достаточно удаленные от промотора не могут полноценно активировать транскрипцию за счет конкуренции с промотором за UBF фактор [71], но способны связывать его форму, которая не работает непосредственно на промоторе [72]. Формирование комплекса РНКП I осуществляется за счет белок-белковых взаимодействий с транскрипционными факторами. Однако, и в отсутствии ядерных факторов, РНК полимераза I обладает способностью связываться с последовательностью ДНК; в таком случае, инициация осуществляется случайным образом. В присутствии факторов, полимераза специфически связывается с промотором, таким образом, исключая неспецифическую инициацию [73]. 1,2.4. Терминация транскрипции. Для терминации транскрипции необходимо связывание белка-терминатора со специфической последовательностью ДНК, расположенной в пределах 1000 оснований ниже от транскрипционной единицы. Функцию терминатора РНКП I выполняет ДНК связывающий белок TTF1 (у человека и мыши), или его аналог Reblp, у дрожжей [74].
Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов
Клетки на чашке (субконфлюэнтный монослой), промытые 2 раза холодным буфером PBS, лизировали на снегу на 10-см чашке Петри в 350-600 мкл охлажденного лизирующего буфера RIPA (RIPA буфер: 50мМ трис-HCl рН 7,4; 150 мМ NaCl; 1% деоксихолат Na, 1% NP-40, 0.1% додецилсульфат Na, 100 мкМ PMSF, 1мкМ пепстатин А, ІмкМ Е64) К этому буферу, непосредственно перед использованием, добавляли ингибиторы протеаз: пепстатин А, апротинин и Е64 (Sigma) до конечных концентраций 1 мкг/мл. Инкубировали на льду в течение 2-5 минут, а затем собирали скребком и переносили лизат в охлажденные 1.5-мл пробирки. Центрифугировали в течение 10 минут на холоду, супернатант переносили в чистую пробирку и хранили на -20С. Для получения ядерных экстрактов клетки лизировались в низкосолевом буфере (20 мМ HEPES рН 7.6, 10 мМ NaCl, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ ЭДТА, 0.1% Тритон Х-100. L мМ ДТТ, 20% глицерин). Центрифугировали ядра 10 сек при 14000 об./мин, супернатант тщательно отбирали, а осадок растворяли в 50-100 мкл буфера NE (лизирующий буфер + NaCl до концентрации 500 мМ). Для полного лизиса пробирки качали на качалке 45 мин при 4С, затем центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку, и полученные ядерные экстракты хранили при -20-40С. При подготовки образцов к электрофорезу к нужному объему экстракта добавляли половину объема буфера для нанесения (150 мМ Трис-HCl рН 6.8, 6% SDS, 300 мМ ДТТ, 30% глицерин и 0.3% бром феноловый синий), затем денатурировали образцы 5 мин при 95С, центрифугировали 5-10 мин при 14000 об/мин и наносили в гель. . Измерение концентрации белка по методу Бредфорд, К 1-2 мкл лизата добавляли 2 мл краски (Bio-Rad Protein assay kit), и проводили измерение оптической плотности при 595 нм. 2.4. Фракционирование белков в полнакриламидном геле. Электрофорез белков проводили по стандартной методике (Маниатис, 1984) используя 4% концентрирующий и 12% градиентный разделяющий гель. При электрофорезе выставляли постоянный ток 35-40 мА. В качестве маркерных белков использовали Rainbow markers (Amersham). 2.5. Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекцин. Белки из геля переносили на PVDF мембрану Hybond-P (Amersham) в буфере (39 мМ глицин, 48 мМ трис-HCl рН 8.3, 0,037 мМ SDS, 20% метанол), с помощью прибора Trans-Blot Cell (Bio-Rad) при токе 300 мА в течение двух часов. Полноту переноса контролировали по маркерным белкам и окрашиванием геля 0,25% Кумасси G-250 в 7% уксусной кислоте.
Для иммунодетекцин фильтр инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в PBSween буфере (10 мМ трис-HCl рН 7.4, 0.9% NaCl, 0.1% Tween-20), содержащем 2% обезжиренного сухого молока, затем добавляли специфические моноклональные антитела (100 мкг/мл) в разведении 1:1000-1:5000 и инкубировали еще 1 час. Фильтр 3 раза по 10-15 мин отмывали PBSween буфером и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с вторичными анти-видовыми поликлональными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham). Фильтр 3 раза по 10-20 минут отмывали в буфере PBS, содержащем 0.1% Tween-20. Проявление специфических белковых полос проводили согласно инструкции к ECL-набору фирмы Amersham. Использованные антитела: к митохондоиальной РНК полимеразе - кроличьи поликлональные антитела (любезно предоставлены лабораторией Gerald S. Shadel); к РНК полимеразе II - кроличьи поликлональные антитела (SantaCraz #899,N-20), Flag М2 мышиные моноклональные антитела (Sigma). 2.6. Норзерн - блот анализ. Клетки выращивали до достижения субконфлюэнтного монослоя на 10-см чашках Петри, затем отмывали буфером PBS и люировали на льду реагентом Trizol (GibcoBRL). Далее выделение тотальной РНК проводили согласно рекомендациям производителя. Аликвоты РНК, по Юмкг каждого образца, были разделены на 1% агарозном геле, содержащем 1.7% формальдегида, перенесены на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham) и фиксированы прогреванием при 80С в течение 2-х часов в вакуумной сушке. Гибридизация осуществлялась, как описано [160]. В качестве зонда для гибридизации использовались кДНК фрагменты, полученные с помощью ОТ-ПЦР с использованием следующих прайм еров: p21-Wafl кДНК человека Г503 п.н.Ч. 5 праймер: 5 -ggcgccatgtcagaaccggctgg; 3 праймер: 5 -gattagggcttcctcttggagaag; GADD153 кДНК человека (731 п.нЛ 5 праймер: 5 tccagactgatccaactgcagag; 3 праймер: 5 cactttaatagatagggacagtc; А также полученные из АТСС клонов с использованием соответствующих рестриктаз: кДНК гена PIG3: АТСС# MGC8642 (550 п.н.) кДНК гена ALDH12: АТСС# 7106221 (340 п.н.) кДНК АТСС клона: # MGC3265 (480 п.н.) кДНК гена большой субъединицы РНК полимеразы 1: АТСС# 6085833 (500 п.н.) кДНК гена большой субъединицы РНК полимеразы II: АТСС#6031855 (630 п.н.) кДНК гена митохондриальной РНК полимеразы: АТСС# 8331495 (400 п.н.), 2.7. Приготовление проб для гибридизации на кДНК микроаррее. В качестве проб для микроарреев была использована тотальная РНК, экстрагированная из клеток HeLa реагентом Тризол (Gibco-BRL) в соответствии с рекомендациями производителя и подвергнутая дополнительной очистке на колонках "RNeasy Mini Kit" (Qiagen) руководствуясь рекомендациями производителя. 2.8. ОТ-ПЦР анализ. Выделение тотальной РНК производилось стандартным методом с помощью экстракции Тризолом. Для получения кДНК обратную транскрипцию проводили с использованием кита "Superscript First-Strand Synthesis System" (Invitrogen) на 3 мкг тотальной РНК в 20 мкл реакционной смеси в соответствии с рекомендациями производителя. После этого аликвоты по 2 мкл переносили в 50 мкл реакционной смеси для ПЦР, содержащей по 100 нг специфических праймеров. ПЦР амплификацию проводили с использованием "Hi-Fi supermix" Taq-полимеразы (Invitrogen). Программа ПЦР подбиралась с учетом параметров специфических праймеров, по окончании амплификации смесь подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле,. Клетки рассевались на 10 см. чашки и были доведены до субконфлюентного монослоя. После чего трижды промывались холодным lx PBS и были собраны с чашек в 0.5 мл 1 х PBS. Далее клетки центрифугировались при 1000 оборотах в течение 1 минуты, PBS тщательно отбирался, а осадок был суспендирован в ЗООмкл лизирующего буфера (ЮОмМ NaCl, ЮмМ Tris-HCl, рН 8.0, 25мМ EDTA, рН 8.0, 0.5% SDS, ОЛмкг протеиназы К). После этого клетки инкубировались в течение ночи при 55С. Далее к образцу добавлялся 1 объем фенола, образец тщательно, но аккуратно перемешивался и центрифугировался в течение 5 минут при 13000 оборотах.
После этого отбиралась верхняя фаза и была последовательно очищена путем добавления равного объема смеси фенол/хлороформа, а далее равного объема хлороформа. После чего, при добавлении трех объемов 96% этанола и 1/10 объема ацетата Na (рН 5.0), ДНК осаждалась в течение 30 минут при -20С. Далее, образец центрифугировался в течение 20 минут при 13000 оборотах, надосадочная жидкость отбиралась, а осадок промывался в 70% этаноле, после чего растворялся в воде и хранился при -70С. 2,10. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация [161]. Мы использовали штамм бактерий E.coli: DH5a. Несколько бактериальных колоний со свежей чашки с SOB-агаром засевали в 5 мл среды SOB (2% бакто-триптона, 0.5% дрожжевого экстракта, 0.5% NaCl, 2.5 мМ КС!, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgS04) и выращивали при 18-25 С в течение суток при интенсивном встряхивании (180 об./мин). Далее 1 мл суспензии переносили в 250 мл среды SOB и растили при 18-25 С еще в течение суток до плотности ODeoo = 0.6. Собирали клетки центрифугированием при 1200 g, 4С, 10 мин, ресуспендировали осадок клеток в 80 мл буфера ТБ (10 мМ MOPS, 55 мМ МпС12,15 мМ СаС12, 250 мМ КС1, рН 6.7), инкубировали во льду 10 мин, осаждали клетки центрифугированием при 800 g, 4 С, 10 мин, ресуспендировали клетки в 20 мл буфера ТБ и добавляли DMSO до 7%. Инкубировали при 0С, 10 мин, распределяли аликвоты по 0.2-1 мл в охлажденные пробирки, замораживали в жидком азоте и хранили на-135С. Трансформацию бактерий проводили обычным способом. В 100 мкл размороженных компетентных клеток в снегу добавляли аликвоту лигазной смеси (до 10 мкл) помешивали и инкубировали 30 мин. После этого клетки подвергали тепловому шоку при 42С 60 сек и снова быстро переносили в снег. Затем добавляли к клеткам 1 мл среды SOB или LB, качали при 37С 45-60 мин. Суспензию клеток высевали на чашки Петри с 1.5% бактоагаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали при 37 С в течение 16 часов. Затем выросшие клоны анализировали. 2.11, Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК
Измерение активности люциферазы
В клетки HeLa с помощью прямой трансфекции был введен вектор pGL3, экспрессирующий ген люциферазы под минимальным SV40 промотором (pGL3-SV40), а так же полученные ранее конструкты pGL3-ALDH12, pGL3-ZBTBl, pGL3(TRE)-ALDH12 и pGL3(TRE)-ZBTBl. В качестве контроля был использован пустой вектор pGL3. В каждом случае с люциферазной плазмидой котрансфецировалась плазмида, экспрессирующая ген р-галактозидазы, для проверки эффективности трансфекции. Через 48 часов клетки промывали 3 раза 1 xPBS, лизировали с помощью лизируещего буфера (Reporter Lysis Buffer, Promega), для лучшего лизиса клетки инкубировались в течение часа при -70С, после чего им давали оттаять и измеряли активность люциферазы с помощью Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя, 2.20. Хроматиновая иммунопреципитация. За 48 часов до начала эксперимента в клетки HeLa с помощью прямой трансфекции вводились конструкты, содержащие в составе вектора pGL3 промотор ALDH12 или SV40 ранний промотор. В качестве контроля был использован пустой вектор pGL3. За 24 часа клетки считались на камере Горяева и рассевались на 10 см. чашки в одинаковых количествах. После чего клетки фиксировались путем добавления в среду формальдегида до конечной концентрации 1% и проводилась инкубация в течение 15 минут при 37ПС. Реакция останавливалась с помощью добавления в среду глицина до конечной концентрации 0,125М и инкубации в течение 5 минут при комнатной температуре. После этого, клетки тщательно промывались холодным PBS, содержащим ингибиторы протеаз, соскребались с чашки и переносились в эппендорфы. После центрифугирования в течение 5 минут при 400 оборотах, осадок был суспендирован в 10 мл лизирующего буфера 1 (10мМ Tris-HCl, рН 8.0, ЮмМ EGTA, 0.25% Triton-XlOO, 1мМ PMSF) и инкубировался при комнатной температуре 15 минут. После этого клетки центрифугировались 5 минут при 400 оборотах и осадок суспендировался в лизирующем буфере 2 (ЮмМ Tris-HCl, рН 8.0, ЮмМ EDTA, 0.5мМ EGTA, 200мМ NaCl, 1мМ PMSF), в котором клетки инкубировались 15 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировались при 2000 оборотах в течение 5 минут.
Далее осадок был ресуспенцирован в 3 мл. буфера 3 (ЮмМ Tris-HCl, 1мМ EDTA, 0.5мМ EGTA, 1мМ PMSF) с добавлением ингибиторов протеаз и хроматин был подвергнут дроблению на соникаторе с использованием заранее отработанной программы, так чтобы после дробления образовались фрагменты ДНК размером 400-600 п.н., что было детектировано с помощью электрофореза в агарозном геле. Весь процесс дробления проводился на льду, не допуская нагревания и вспенивания образцов. После дробления к образцам были добавлены следующие реагенты до конечной концентрации в растворе 20мМ Tris-HCl, рН 8.0 , 1мМ EDTA, 0.5мМ EGTA, 200мМ NaCl, 0.5% Triton-XI00, 0.05% deoxycholate, 0.1% NP-40, ІмМ PMSF, а так же ингибиторы протеаз. После чего образцы центрифугировались при 14000 оборотах в течение 15 минут. Супернатант был тщательно отобран и перенесен в новые пробирки, где к нему, для предварительной очистки, была добавлена G-сефароза и проведена инкубация в течение двух часов при 4С с постоянным покачиванием. После чего сефароза была откручена на центрифуге, супернатант перенесен в чистые пробирки, к нему были добавлены специфические антитела. В нашем случае преципитация проводилась параллельно на трех образцах (контрольном, содержащем промотор ALDH12 или ранний промотор SV40) в двух повторах с использованием антител к РНК полимеразе II или к митохондриальной РНК полимеразе в течение ночи при 4С, После чего к смеси была добавлена сефароза, и образцы инкубировались еще в течение двух часов при постоянном покачивании. Далее преципитация была подвергнута серии отмывок с использованием следующих буферов: а). 2 раза в течение 15 минут буфером 3 (20мМ Tris-HCl, 200мМ NaCl, 0.5% Tritin-XlOO, 0.05% deoxycholate, 0.1% NP-40, ІмМ PMSF) с добавлением протеазных ингибиторов, б). 2 раза в течение 15 минут буфером 3, содержащим 500мМ NaCl, в). 2 раза в течение 10 минут буфером 3, содержащим 250мМ LiCl, г). 2 раза в течение 10 минут буфером ТЕ (ЮмМ Tris-HCl, ІмМ EDTA). После отмывок к сефарозе добавлялось ЮОмкл элюирующего буфера (50мМ Tris-HCl, 5мМ EDTA, 1% SDS) и проводилась элюция при 65С в течение 30-и минут. Далее, к образцам был добавлен NaCl до конечной концентрации 200мМ и РНКаза А (10мг/мл), после чего они инкубировались на протяжении 6-й часов при 65С. Далее, образцы были разбавлены до 200мкл водой, содержащей протеиназу К (20мкг) и инкубировались в течение трех часов при 55С. После этого из образцов была получена ДНК, очищенная методом фенол-хлороформенной экстракции и переосаждением в 3 объемах 96% этанола, с добавлением 1/10 объема ацетата Na. В качестве носителя был добавлен гликоген. После этого с полученной ДНК была поставлена трансформация и посчитаны колонии. Количество колоний свидетельствовало об эффективности преципитации. Результаты были воспроизведены четыре раза, после чего были обработаны с учетом статистики. 2.21. Иммунофлуоресцснция. Клетки HeLa и HeLa(pO), были высажены на 4-луночные Chamber Slide (Lab-Тек) в количестве 4 х 104 на лунку, при необходимости, подвергались обработкам различными препаратами, такими как а-аманитин, рифампицин, Н202 и фиксировались через 24-48 часов. При экспрессии митохондриальной РНК полимеразы и РНК полимеразы IV с Flag, конструкты вводились в клетки за трое суток до начала эксперимента, за 24 часа клетки также рассевались на Chamber Slide (Labek) в количестве 4 х 104 на лунку. После чего, клетки промывали два раза 1 х PBS, фиксировали в течение 15 минут 3.7% формалином при комнатной температуре, после чего отмывались и инкубировались при комнатной температуре с 1% Тритон-ХЮО в течение 10 минут. Клетки несколько раз промывались 1 х PBS, после чего в течение 30 минут качались в 1 х PBS содержащем 3% БСА. После этого клетки инкубировали в течение 1 часа с антителами к митохондриальной РНК полимеразе в разведении 1x200 или с антителами, специфичными к Flag в разведении 1x100, промывали 3 раза 1 х PBS и инкубировали 40 минут с антителами, конъюгированными с FITC или TRITC (Sigma) в разведении 1x200. После 3-х кратной отмывки 1 х PBS, клетки покрывали поливиниловым спиртом под покровным стеклом и анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа.
Характеристика транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12
Мы сосредоточились на анализе транскрипции генов MGC3265 и ALDH12, которые продемонстрировали наиболее выраженную устойчивость к а -аманитину. С помощью Нозерн-гибридизации было показано зависимое от дозы а -аманитина увеличение уровня транскрипции данных генов (Рис.10). В качестве положительного контроля был использован ген PIG3 (верхний транскрипт размером 2,3kb), а в качестве отрицательного - р53 регулируемый ген p21Wafl. Результат был воспроизведен независимо на трех линиях клеток (HeLa, А431 и MRC5). При этом гены р21 Wa и GAPDH демонстрировали зависимое от дозы а -аманитина снижение транскрипции, в то время как транскрипция генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 демонстрировала обратную зависимость, усиливаясь по мере увеличения концентарции ингибитора, что совершенно нехарактерно для генов, транскрибируемых РНК полимеразой II. Пытаясь найти обьяснение обнаруженному эффекту, в результате которого уровень транскрипции исследуемых генов значительно увеличивался в после обработки ингибитором РНК полимеразы II а -аманитином, мы решили протестировать действие некоторых других обработок на транскрипцию выбранных генов. В частности, клетки HeLa обрабатывали перекисью водорода (Н2О2), ингибиторами различных киназ, а также облучали UV. Уровень экспрессии генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 определяли с помощью Нозерн-гибридизации РНК, полученной из обработанных клеток (Рис.11). В результате было обнаружено, что инкубация с 0,5 мМ НгСЬ в несколько раз увеличивала уровень экспресии PIG3, MGC3265 и ALDH12, что свидетельствует об активации данных генов под действием окислительного стресса. Кроме того, было обнаружено, что данные гены активируются также после обработки ингибитором широкого спектра серин-треониновых киназ Н7 (100 цМ/мл). Интересно, что Н7 также является ингибитором РНК полимеразы II, подавляя активацию этого фермента, и поэтому полученный результат хорошо согласуется с эффектом а-аманитина. Таким образом, нами было установлено, что транскрипция генов PIG3, MGC3265 и ALDHI2 повышается в ответ на обработку ингибиторами РНК полимеразы II, кроме того, транскрипция данных генов активируется при окислительном стрессе. 3.5. Экспрессия генов, устойчивых к а -аманитину, возрастает после подавления РНК полнмераз I ила II.
Чтобы установить, имеет ли РНК полимераза II или I отношение к транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDHI2 в клетках HeLa с помощью лентивирусного вектора pLSLG были проэкспрессированы siPHK, специфичные, соответственно, генам больших субъединиц РНК полнмераз I или II. Клетки собирались в течение четырех дней после введения siPHK; на выделенной из них тотальной РНК был поставлен Нозерн, после чего блот гибридизовался с меченными кДНК пробами, специфичными для больших субьединиц РНК полимеразы I и II, соответственно, а также для генов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH. В качестве контролей была использована РНК, полученная из контрольных клеток, клеток обработанных а -аманитином, и клеток зараженных пустым вектором pLSLG (Рис. 12). Было обнаружено, что в ответ на подавление РНК полимераз I или II уровень транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 не только не снижался, но, напротив, значительно активировался, усиливаясь в течение нескольких дней после заражения. В то же время, транскрипты гена GAPDH, а также самих РНК полимераз I и II после введения siPHK существенно снижались. На основании полученных выше результатов, нами был сделан вывод, что РНК полимераза II, ответственная за транскрипцию всех белок-кодирующих генов, так же как и РНК полимерза I, скорее всего, не участвуют в транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12. К сожалению, с помощью siPHK не представлялось возможным подавить РНК полимеразу III, поскольку эта полимераза контролирует транскрипцию siPHK на промоторе гена H1RNA в составе лентивирусного вектора. Однако, мы исключили возможное участие РНК полимеразы III с помощью другого подхода, основанного на измерении чувствительности к обработке доксорубицином в концентрациях, способных преимущественно подавлять РНК полимеразу III. Клетки HeLa обрабатывали разными концентрациями доксорубицина, после чего Нозерн-гибридизацией было установлено, что подавление РНК полимеразы III не влияет на уровень транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 (Рис.13). Так как, мы установили, что в транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 РНК полимеразы I, II и III, по-видимому, не участвуют, а также принимая во внимание тот факт, что уровень экспресии этих генов значительно снижается после обработки клеток ингибитором митохондриальной РНК полимеразы рифампицином,, мы решили проверить, не может ли митохондриальная РНК полимераза каким-то образом участовать в транскрипции этих генов. Нами были подобраны siPHK, специфичные для экзонов гена митохондриальной РНК полимеразы. После их экспрессии в клетках HeLa в составе вектора pLSLG, клетки собирались в течение четырех дней, выделяли тотальную РНК и анализировали Нозерн-гибридизацией с меченными кДНК пробами, специфичными для генов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH, а также для гена самой митохондриальной РНК полимеразы (Рис.14). Было обнаружено, что несмотря на существенное снижение уровня самого транскрипта митохондриальной РНК полимеразы, с первого по третий день экспрессии siPHK обнаруживалось значительное увеличение транскрипции анализируемых генов, и только на четвертый день экспрессии siPHK наблюдалось некоторое снижение.
При этом на экспрессию гена GAPDH введение siPHK к митохондриальной РНК полимеразе влияния не оказывало. Мы предположили, что наблюдаемое повышение транскрипции исследуемых генов объясняется их индукцией под действием окислительного стресса, развивающегося за счет повреждения митохондрий после подавления синтеза митохондриальной РНК полимеразы. Это предположение было основано на вышеприведенных наблюдениях, указывающих на активацию транскрипции тех же генов после обработки Н2О2 (Рис.11). Действительно, развитие окислительного стресса обнаруживалось FACS анализом путем измерения внутриклеточного уровня ROS в контрольных клетках HeLa и в клетках с митохондриальной РНК полимеразой, подавленной экспрессией siPHK (Рис.15). Чтобы исключить влияние эффекта, вызванного окислительным стрессом, нами была получена линия клеток (рО), не содержащая активных митохондрий, и следовательно, не продуцирующая митохондриальных ROS. Для этого клетки HeLa в течение четырех недель пассировали в присутствии 50 нг/мл бромистого этидия на специальной среде. Отсутствие активных митохондрий было детектировано с помощью реагента MitoTracker Red (Рис.16). После этого, в клетках рО HeLa экспрессировали siPHK к митохондриальной РНК полимеразе, и ставили Нозерн гибридизацию с РНК, полученной на четверый день экспрессии. Блот отжигался с меченной кДНК для генов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH (Рис. 17). При этом было обнаружено значительное снижение уровня экспрессии исследуемых генов. Подавление митохондриальной РНК полимеразы в клетках рО HeLa не приводило к какому-либо увеличению уровня ROS, что определялось FACS анализом (Рис.18). Таким образом, митохондриальная РНК полимераза действительно имеет отношение к транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12, обнаруживающих устойчивость к а -аманитину и чувствительность к рифампицину, что подтверждается фактом снижения уровня транскрипции исследуемой группы генов после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы siPHK.
