Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Концепция стресса 10
2.2. Феномен ИТ 13
2.3. Классификация и основные классы БТШ 15
2.4.1. Белки семейства БТШ 100 (HsplOO/Clp) 18
2.4.2. Белки семейства БТШ90 (Hsp90) 29
2.4.3. Белки семейства БТШ70 (Hsp70) 30
2.4.4. Шаперонины (семейство БТШ60 (Hsp60)) 34
2.4.5. Низкомолекулярные БТШ (sHsps) 35
2.5. Причины и механизмы гибели клетки при стрессе 37
2.5.1. Некроз и апоптоз: сходства и различия (обзор возможных форм гибели клетки) 38
2.5.2. Признаки ПКГ 43
2.5.3. Механизм апоптоза у животных клеток. Сходства и различия с ПКГ дрожжевой и растительной клеток 44
2.6. Роль митохондрии в развитии ПКГ 48
2.7. БТШ как регуляторы апоптоза на примере животной клетки 51
2.8. Сведения о роли растительных и дрожжевых БТШ в развитии ПКГ 53-
3. Материалы и методы 55
3.1. Объект исследования 55
3.2. Температурная обработка 55
3.3. Определение выживаемости клеток 56 -
3.4. Определение дыхательной активности 58
3.5. Выделение суммарного белка 58
3.6. Получение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций 59
3.7. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na 63
3.8. Окраска и обесцвечивание гелей 64
3.9. Вестерн-блотинг 64
ЗЛО. Определение молекулярных масс полипептидов 65
3.11. Использованные антитела 65
3.12. Выделение ДНК 65
3.13. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия) 66
3.14. Статистическая обработка данных 68
4. Результаты 69
4.1. Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ 69
4.1.1. Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ у суспензионной культуры A. thaliana 69
4.1.2. Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ в культуре дрожжей & cerevisiae 72
4.2. Изучение зависимости между синтезом БТШ и развитием ИТ 73
4.2.1. Изучение зависимости между синтезом БТШ и развитием ИТ у суспензионной культуры^, thaliana 73
4.2.2. Изучение зависимости между синтезом БТШ и развитием ИТ у культуры дрожжей S. cerevisiae 76
4.3. Параметры гибели клеток при тепловом шоке 77
4.3.1. Изменение морфологии клеток 77
4.3.1.1. Изменение морфологии клеток суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока 77
4.3.1.2. Изменение морфологии клеток в культуре дрожжей S. cerevisiae после теплового шока 79
4.3.2. Изучение динамики движения цитоплазмы с помощью цейтраферной съёмки 81
4.3.2.1. Изучение движения цитоплазмы после тепловых воздействий у суспензионной культуры A. thaliana 81
4.3.2.2. Изучение движения цитоплазмы после тепловых воздействий в культуре дрожжей S. cerevisiae 82
4.3.3. Изучение динамики гибели клеток 82
4.3.3.1. Динамика гибели клеток у суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока 83
4.3.3.2. Динамика гибели дрожжей 5". cerevisiae после теплового шока 88
4.3.4. Высвобождение цитохрома с 92
4.3.5. Изучение состояния плазматической мембраны у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока 93
4.3.6. Качественное измерение электрохимического потенциала на ВММ в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии 94
4.3.6.1 Изучение изменения электрохимического потенциала на ВММ у клеток суспензионной культуры^, thaliana при гипертермии 94
4.3.6.2. Изучение изменения электрохимического потенциала на ВММ у клеток дрожжей S. cerevisiae при гипертермии 97
4.3.7. Качественное измерение продукции АФК в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии 98
4.3.7.1. Изучение продукции АФК во время гипертермии у суспензионной культуры A. thaliana 98
4.3.7.2. Изучение продукции АФК во время гипертермии у дрожжей S. cerevisiae.99
4.3.8. Морфология ядер 100
4.3.8.1. Изучение морфологии ядер у суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока 100
4.3.8.2. Изучение морфологии ядер у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока 102
4.4. Изучение распределения БТШ между митохондриальной и цитоплазматпческой фракциями белков после воздействия повышенной температурой 103
4.4.1. Распределение БТШ между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков после тепловых воздействий у суспензионной культуры A. thaliana 104
4.4.2. Распределение БТШ между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков после тепловых воздействий у дрожжей S. cerevisiae 105
4.4.3. Распределение HsplOl и Hspl7,6 между митохондриальной и
цитоплазматической фракциями белков у суспензионной культуры A. thaliana с конститутивной экспрессией HSP101 в контроле и после мягкого теплового стресса 107
4.5. Влияние мягкой тепловой предобработки на развитие параметров гибели клеток 109
4.5.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на морфологию клеток 109
4.5.1.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на морфологию клеток у суспензионной культуры^!, thaliana после теплового шока 109
4.5.1.2. Влияние мягкой тепловой предобработки на морфологию клеток у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока ПО
4.5.2. Влияние мягкой тепловой предобработки на остановку движения цитоплазмы после теплового шока 111
4.5,2.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на остановку движения цитоплазмы после теплового шока у суспензионной культуры A thaliana 111
4.5.2.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на остановку движения цитоплазмы после теплового шока у дрожжей S. cerevisiae ИЗ
4.5.3. Влияние мягкой тепловой предобработки на распределение белков между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков 113
4.5.3.1. Влияние мягкой тепловой предобработки на распределение белков между митохондриальной и цитоплазматической фракциями у суспензионной культура А. thaliana после теплового шока при 50С 113
4.5.3.2. Влияние мягкой тепловой предобработки на распределение белков между митохондриальной и цитоплазматической фракциями у дрожжей & cerevisiae после теплового шока при 45С 116
4.5.4. Влияние мягкой тепловой предобработки на изменение морфологии ядер у дрожжей S. cerevisiae после обработки тепловым шоком при 45С 117
4.5.5. Влияние мягкой тепловой предобработки на гиперполяризацию ВММ у дрожжей S. cerevisiae при негубительном для клеток коротком тепловом воздействии 45С 118
5. Обсуждение 121
5.1. Тепловой шок вызывает развитие ПКГ в культуре клеток арабидопсиса и дрожжей 121
5.2. Зависимость между синтезом БТШ и развитием ПКГ 130
5.3. Общие и отличительные черты между развитием защитной программы и программы клеточной гибели : 135
5.4. Hsp60 как регулятор развития ПКГ 138
5.5. Ассоциация цитоплазматических БТШ с митохондриями 141
5.6. HsplOl/104, Hsp70, Hspl7,6 как ингибиторы развития ПКГ в растительной и дрожжевой клетках 144
6. Выводы 148
7. Список использованной литературы
- Некроз и апоптоз: сходства и различия (обзор возможных форм гибели клетки)
- Получение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций
- Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ у суспензионной культуры A. thaliana
- Динамика гибели клеток у суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока
Введение к работе
В жизни любого организма температура окружающей среды является одним из основных факторов, определяющих его существование. Естественно, что изменение температуры ведет к самым разнообразным и часто неблагоприятным последствиям. Чтобы минимизировать повреждения и выжить, организмы выработали различные механизмы. Всю совокупность ответных реакций, индуцируемых в организме внешними воздействиями, объединяют термином «адаптационный синдром» (англ. "adaptive syndrome"), а также не совсем точным, но широко распространившимся термином «стресс».
Тепловой стресс является наиболее классическим и самым исследованным ответом на воздействие стрессовых факторов. В зависимости от тяжести воздействия развиваются как минимум три сценария последующих действий. Первый развивается при мягком не вызывающем серьёзных нарушений в метаболизме клетки воздействии, однако изменяет экспрессию генов, снижая синтез белков домашнего хозяйства и вызывая синтез белков теплового шока (БТШ), полиаминов, ферментов антиоксидантной системы и т.д. Всё это, в конечном счёте, хотя и приводит к некоторому снижению скорости роста и деления клеток, вместе с тем вызывает развитие индуцированной термотолерантности (ИТ) к последующему жесткому тепловому воздействию. Второй сценарий развивается в случае более сильного воздействия, когда клетка получает достаточно ощутимые повреждения, однако не настолько сильные, чтобы убить клетку непосредственно. Здесь стресс выступает в качестве индуктора развития программированной клеточной гибели (ПКГ). В этом случае также происходит изменение в экспрессии генов, однако это уже гены белков экзекуторов ПКГ, а синтеза защитных БТШ в этих условиях не происходит. Ключевым моментом при данном сценарии является активный характер процесса и непосредственное участие клетки в развитии своей собственной гибели. И, наконец, третий сценарий развивается в том случае, когда повреждения метаболизма настолько сильны, что клетка не в состоянии контролировать свою смерть, так как белки денатурируют, а мембраны теряют свои свойства. Соответственно, ни о какой экспрессии речь уже не идёт. С некоторыми натяжками все три сценария можно подвести под понятие тепловой стресс, в то время как события происходят совсем разные, следовательно, и изучать их необходимо в отдельности. Большинство БТШ работают в клетке в качестве «молекулярных шаперонов». Шапероны - это семейство белков, ассистирующих процесс правильной укладки (сворачивания) полипептидов или полипептидсодержащих структур, но не являющихся компонентами этих структур (Ellis, van der Vies, 1991). После теплового шока они восстанавливают поврежденные белки, или, если это невозможно, способствуют их деградации путем протеолиза. БТШ функционируют не только в стрессовых условиях. Конститутивно синтезируемые шапероны способствуют корректной сборке молекулы белка до нативного состояния, стабилизируя обращенные в водную фазу гидрофобные остатки и препятствуя случайным взаимодействиям (Frydman, 2001).
В настоящий момент нет сомнений в том, что повышение в содержании БТШ несколько увеличивает термотолерантность клеток. Вместе с тем, на основании функционирования БТШ в качестве молекулярных шаперонов, можно предполагать равнозначную роль последних как в защите от хаотичной смерти (некроза), так и от ПКГ. В последнее время появляются публикации о роли БТШ в апоптозе животных клеток (Агуа et al., 2007). Показано, что некоторые из белков способствуют выживанию клеток, в то время как другие, их гибели, причём регуляторные функции БТШ не всегда совпадают с их шапероновыми свойствами (Didelot et al., 2006). К сожалению, роль БТШ в регуляции ПКГ растений и дрожжей остается еще неисследованной.
Имеющиеся в настоящий момент данные не оставляют сомнений в том, что основным критическим звеном, или тригерром, в развитии ПКГ, вызванной воздействием физических факторов, служат митохондрии. Так, высвобождение белков межмембранного пространства митохондрий (МПМ) в цитозоль рассматривается как необходимый этап для запуска ПКГ. С другой стороны известно, что ряд цитоплазматических БТШ может ассоциироваться с митохондриями и модулировать их активность (Войников, Боровский, 1994).
Целью настоящей работы явилось изучение роли белков теплового шока в регуляции развития программированной клеточной гибели и индуцированной термотолерантности в клетках суспензионной культуры Arabidopsis thaliana и дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В задачи исследования входило:
1. Подобрать условия тепловой обработки, необходимые для индукции программированной клеточной гибели и индуцированной термотолерантности у суспензионной культуры A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae.
2. Выявить изменения в содержании и локализации белков теплового шока во время развития программированной клеточной гибели и индуцированной термотолерантности.
3. Исследовать цитологические и биохимические изменения в клетках суспензионной культуры A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae во время развития программированной клеточной гибели и оценить роль белков теплового шока в этом процессе.
4. Изучить зависимость между синтезом белков теплового шока и развитием программированной клеточной гибели.
Некроз и апоптоз: сходства и различия (обзор возможных форм гибели клетки)
Важная роль принадлежит sHsp в защите митохондрий от повреждений при тепловом и некоторых других стрессах. Во многих видах растений обнаружены гены sHsps, предназначенные для локализации в митохондриях. Среди этих растений - горох, соя, томаты, арабидопсис, пшеница, кукуруза и другие (Basha et al., 1999). Локализация белков в митохондриях связана со стрессом. Показано, что sHsps защищают функционирование дыхательной цепи митохондрий во время теплового шока (Chou et al., 1989; Joshi et al., 1997; Downs, Heckathorn, 1998). Многие аспекты этой защиты пока не ясны, но основной, известной на сегодня мишенью для sHsps служит NADH:y6nxHHOH оксидоредуктаза (первый дыхательный комплекс), инактивация которой показана в условиях гипертермии (Побежимова и др., 1996; Downs, Heckathorn, 1998). На основе данных о локализации sHsps в мембранах и матриксе митохондрий, можно с уверенностью предполагать, что комплекс I не является единственной целью для этих белков при стрессе. sHsps прочно связывались с частично денатурированными белками наружной мембраны митохондрий (НММ), стабилизируя их (Коротаева и др., 2001).
Причины гибели клетки при воздействии стрессовых факторов могут быть достаточно разными. Это связано в первую очередь с природой стрессора, силой приложенного воздействия и уровнем организации организма. Чем выше иерархия организации исследуемого организма, тем большую лепту вносят различные механизмы, поддерживающие гомеостаз, так как любое воздействие приводит к определённому, если не нарушению, то изменению метаболизма, и тем труднее выявить роль отдельных факторов.
Таким образом, работы по изучению причин гибели клеток при стрессе обычно проводят на более простых системах, культивируемых клеточных линиях, либо одноклеточных организмах. Что касается теплового шока, то основные причины гибели на клеточном уровне, главным образом, связаны с денатурацией и агрегацией клеточных белков, нарушениями структур мембран и нуклеиновых кислот (Piper, 1993). Последние события могут, как и сами по себе привести к непосредственной неконтролируемой гибели, так и случайно или направленно активировать механизмы клеточного суицида или ПКГ. Ферментные системы также очень чувствительны к изменению температуры. Другой причиной гибели при тепловом шоке является повышение генерации АФК, включая супероксидный анион (02 ), перекись водорода (Н202) и гидроксильный радикал (ОН) (Davidson et al., 1996; Lee, Park, 1998; Larkindale, Knight, 2002; Vacca et al., 2004; Larkindale et al., 2005). АФК отличаются высокой реакционной способностью и могут повреждать белки, липиды и ДНК. Многообразие причин гибели подразумевает многообразие, как способов гибели, так и способов защиты. В каждом отдельном случае эти причины могут зависеть от многих факторов: особенностей объекта, его физиологического состояния, условий культивирования, силы теплового воздействия и так далее.
С тех пор как более 30 лет назад Керр и соавторы предложили различать два типа клеточной гибели - апоптоз и некроз (Kerr et al., 1972), наблюдается неснижаемый интерес к изучению механизма гибели клеток. В своём современном смысле термин «апоптоз» был введён в научный обиход в 1972 году (Kerr et al., 1972) для обозначения типа гибели клеток тимоцитов под действием глюкокортикоидов (Ярилин, 2003). Позднее эта форма клеточной смерти была отождествлена с программированной гибелью клеток (ПГК или в английской транскрипции "programmed cell death", PCD). Во избежание неопределённости сформулируем определения обоих понятий.
ПКГ - это форма гибели клетки, являющаяся результатом реализации ее генетической программы или ответом на внешние силы и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул de novo (Ярилин, 2003). Апоптоз -это форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении её размера, конденсации и фрагментации хроматина, а также уплотнении цитоплазматической мембраны без выхода содержимого клетки в окружающую среду (Ярилин, 2003). Несмотря на то, что наиболее принципиальным является аспект программированное и активный характер гибели, чем сопутствующие ей морфологические изменения, чаще используется термин «апоптоз» (Ярилин, 2003; Гордеева и др., 2004). Детальный механизм двух сценариев гибели клеток разработан исключительно для животных и на примере различных интенсивностей стресса схематично представлен на рис 1.1.
Получение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций
Для получения цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций из суспензионной культуры растений и дрожжей использовали метод дифференциального центрифугирования.
Растения. Культуру фильтровали на водоструйном насосе через фильтровальную бумагу, отбирали по 4 г, заливали средой гомогенизации СГ (0,002 мМ ЭДТА, 0,01 М Трис-НС1, 0,3 М сахароза, 0,1% р-меркаптоэтанол, 0,0005 - 0,001 мМ ФМСФ, рН 7,5) в соотношении 1:4. Гомогенизировали сначала на электрическом универсальном лабораторном гомогенезаторе MPW-309 "Mechanika procyzyina" (Польша) с использованием насадки с охлаждённым стеклянным поршнем и ступкой до получения однородной массы. С этого момента все операции проводили в рефрижераторном шкафу при температуре +4С. Гомогенат переносили в охлаждённый ручной стеклянный гомогенезатор Даунса и делали по 5 ударов каждым пестиком. Пестик А имел зазор 0,003-0,006 Дюйма, пестик В - 0,001-0,003 Дюйма. Переносили полученный гомогенат в охлаждённые центрифужные пробирки, уравновешивали и для осаждения неразрушенных клеток, клеточного дебриса и ядер центрифугировали 3 мин при 5500g на центрифуге с охлаждением Allegra 64R ("Beckman Coulter", США). Затем супернатант переносили в чистые охлаждённые центрифужные пробирки, уравновешивали и центрифугировали 3 мин при 24000g для осаждения митохондрий. Надосадочную жидкость считали фракцией, содержащей преимущественно цитоплазматические белки. Белки цитоплазматической фракции осаждали холодным трёхкратным ацетоном, центрифугируя 10 мин при 5500g. Осадок митохондрий растворяли в 100 мкл буфера для образца Sb (0,625 М Трис-НС1, 0,008 М ДДС-Na, 0,1 М В-меркаптоэтанол, 10% глицерин, рН 6,8), осадок цитоплазматических белков растворяли в 500 мкл Sb. Нагревали образцы 5 мин при 100С для денатурации белков на термостатируемом шейкере TS-100 ("Biosan", Латвия) при перемешивании 800 об/мин. Затем центрифугировали при 7000g в течение 10 мин на микроцентрифуге MiniSpin ("Eppendorf", Германия). Растворённую надосадочную фракцию белков переносили в чистые микропробирки, определяли концентрацию по методу Лоури (Lowry et al., 1957), разводили в Sb без Р-меркаптоэтанола и с бромфеноловым синим (0,625 М Трис-НС1, 0,008 М ДДС-Na, 10% глицерин, 0,001% бромфеноловый синий, рН 6,8) и использовали для электрофореза в концентрации от 10 до 70 мкг белка на трек. Дрожжи. Митохондрии из дрожжей выделяли по методу Звягильской и
Шольц (1980) с некоторыми модификациями. Дрожжи в необходимом физиологическом состоянии наслаивали центрифугированием при 3900g по 2 мин на центрифужные пробирки, используя центрифугу Allegra 64R ("Beckman Coulter", США), промывали два раза дистиллированной водой в полном объёме пробирки при тех же оборотах при комнатной температуре. Для получения протопластов использовали по 3 г сырой массы. Перед обработкой ферментом клетки сенсибилизировали к ферменту, инкубируя 15 мин в восстанавливающей среде СИВ (50 мМ Трис-НС1, 10 мМ Р-меркаптоэтанол, рН 8,6) в соотношении 1:10 при комнатной температуре в стеклянной колбе на магнитной мешалке при средних оборотах. После чего опять два раза промывали дистиллированной водой в полном объёме пробирки на тех же оборотах при комнатной температуре. Далее сенсибилизированные клетки растворяли в среде инкубации с ферментом СИФ (1 М сорбитол, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES-Трис рН 7,4) в соотношении 1:10 в стеклянных колбах, затем помещали в термошейкер-инкубатор ES-20 ("BioSan", Латвия) на 30С и инкубировали 10 мин для уравновешивания температур и осмотического давления внутри клеток (в это время клетки обмякали и сморщивались, плазмалемма отделялась от клеточной стенки). После чего добавляли литиказу из Arthrobacter Intern L2524-50KU ("Sigma", США), растворённую в буфере литиказы 100 U/мкл (100 мМ КН2Р04, 100 мМ NaCl, 50% глицерин, рН 7,5) и хранящуюся при -20С по 50U/r сырого веса. Инкубировали в течение 10-15 мин, контролируя реакцию каждые 5 мин по уменьшению спектрофотометрической плотности клеток, разведённых в дистиллированной воде. Для этого из образца отбирали по 80 мкл, разводили в 2 мл дистиллированной воды и через 2 мин измеряли оптическую плотность при 600 нм. Снижение плотности должно произойти примерно в три раза. По достижении необходимой плотности реакцию останавливали добавлением ФМСФ и помещением в лёд, доводя температуру до 4С, но не более 3 мин. После чего все операции проводили в рефрижераторном шкафу при 4С.
Изучение зависимости между гибелью клеток и синтезом БТШ у суспензионной культуры A. thaliana
Решающую роль в развитии ИТ у A. thaliana играет HsplOl (Lee, Schoffl, 1996; Queitsch et al., 2000; Hong, Vierling 2000, 2001; Kotak et al., 2007). Hsp70 и Hspl7,6 работают совместно с HsplOl и выполняют вспомогательную роль в развитии ИТ (Vierling, 1991; Lee, Vierling, 2000; Lee et al., 2005; Haslbeck et al., 2005). Hsp60 локализован в митохондриях и участвует в импорте синтезированных в цитоплазме белков в митохондрии (Bukau, Horwich, 1998).
Для установления зависимости между индукцией вышеназванных БТШ и жизнеспособностью клеток суспензионной культуры A. thaliana были проведены следующие эксперименты. Культуру клеток подвергали тепловым воздействиям различной интенсивности и продолжительности, а затем определяли относительное содержание исследуемых БТШ, жизнеспособность клеток и степень прироста биомассы. Нужно было в первую очередь, определить режим температурной обработки, необходимый для индукции синтеза БТШ и развития ИТ. С другой стороны важно было установить температурный порог, при котором клетки начинают умирать, чтобы в дальнейшем изучить, существует ли зависимость между синтезом БТШ и развитием клеточной гибели.
Для определения относительного содержания БТШ в контроле и образцах, подвергнутых тепловым воздействиям различной интенсивности и продолжительности, культуру клеток A. thaliana подвергали следующим тепловым обработкам: 37С - 120 мин, 39С - 120 мин, 43С - 60 мин, 46С -40 мин, 50С - 10 мин. Затем, после восстановительного периода 120 мин при 26С, выделяли общую белковую фракцию. В качестве контроля использовали культуру, выращиваемую при 26С. Количественное содержание отдельных БТШ регистрировали методом Вестерн-блоттинга с соответствующими антителами против HsplOl, Hsp70, Hsp60 и Hspl7,6. Как видно на рис. 4.1.1а, содержание цитохрома с во всех исследованных образцах оставалось постоянным, что свидетельствует об одинаковой нагрузке белка на трек. В контроле (26С) наблюдался довольно высокий уровень синтеза Hsp60 и Hsp70. Синтез HsplOl и Hspl7,6 в этих условиях практически отсутствовал. При тепловом воздействии 37 С резко увеличивалось содержание HsplOl и Hspl7,6, а также в некоторой степени Hsp70. В то же время уровень синтеза Hsp60 при этой температуре почти не изменялся. Дальнейшее повышение интенсивности теплового воздействия до 39С и выше ингибировало индукцию синтеза HsplOl, Hsp70 и Hspl7,6. Наоборот, содержание конститутивно синтезируемого митохондриального Hsp60 значительно повышалось пропорционально увеличению температуры обработки. Так, содержание Hsp60 при 39С увеличивалось в два раза, а при 50С как минимум в 5 раз.
Известно, что тепловое воздействие не всегда убивает клетки мгновенно и непосредственно, гибель может развиваться во времени и приобретать очертания, характерные для ПКГ (Swidzinski et al., 2002). Поэтому жизнеспособность клеток после аналогичных тепловых обработок (37С - 120 мин, 39С - 120 мин, 43С - 60 мин, 46С - 40 мин, 50С - 10 мин) оценивали по способности культуры клеток восстанавливать ТТХ спустя 48 ч инкубации при 2бС (рис. 4.1.16).
Как оказалось, обработки культуры температурами 37С и 39С в целом не нарушали способность клеток восстанавливать ТТХ (рис. 4.1.16). Воздействие температурой 43 С снижало восстанавливающую способность в два раза, а обработки температурами 46С и 50С практически полностью подавляли восстанавливающую способность. Адекватность используемого метода оценки жизнеспособности по восстановлению ТТХ, подтверждают эксперименты по изучению прироста сырого веса после аналогичных тепловых воздействий. Для этого культуру клеток обрабатывали, как описано выше, после чего инкубировали трое суток при 26С и оценивали прирост сырой биомассы. Обработка при 37С практически не влияла на скорость прироста биомассы, тогда как обработка при 39С снижала скорость роста в два раза, а при обработке 43С и выше прирост полностью отсутствовал (рис. 4.1.1в).
Таким образом, синтез HsplOl, Hsp70, Hspl7,6 у культуры клеток А. thaliana индуцируется при температуре 37С. Дальнейшее повышение температуры их синтез ингибирует. Синтез Hsp60 возрастает по мере увеличения температуры с 39 до 50С. Обработка при 43С и выше приводит к снижению жизнеспособности клеток, измеряемой по восстановлению ТТХ и определению сырого веса.
Hspl04 играет решающую роль в развитии ИТ у пекарских дрожжей S. cerevisiae (Sanchez, Lindquist, 1990). В цитозоле S. cerevisiae функционируют девять белков семейства Hsp70, которые разделены на подсемейства Ssa (Ssal, Ssa2, Ssa3 и Ssa4), Ssb (Ssbl и Ssb2), Sse (Ssel и Sse2) и Ssz (Wegele et al., 2004). Hsp60 локализован в митохондриях и участвует в импорте синтезированных в цитоплазме белков в митохондрии (Bukau, Horwich, 1998).
Для установления зависимости между индукцией вышеописанных БТШ и жизнеспособностью клеток, жидкую культуру S. cerevisiae, находящуюся в логарифмической фазе, роста, обрабатывали тепловыми воздействиями различной интенсивности: 39, 42 и 45С в течение 30 минут. Затем из клеток выделяли суммарный белок и исследовали на содержание БТШ (рис. 4.1.2.а), либо разводили стандартным образом и высевали на агаризованную питательную среду и через 24 ч оценивали жизнеспособность по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис. 4.1.26).
Как видно на рис. 4.1.2а, содержание цитохрома с было константным у всех образцов, что говорит о равномерном нанесении белков на треки. Заметные изменения в содержании БТШ были выявлены только для Hspl04. Так, тепловая обработка температурами 39 и 42С резко увеличивала содержание Hspl04 в образцах, в то время как в контроле и при обработке 45С данный белок не детектировался. Содержание же Hsp70 (Ssal и Ssbl) и Hsp60 заметным образом не изменялось.
Динамика гибели клеток у суспензионной культуры A. thaliana после теплового шока
Для изучения локализации цитохрома с в контрольных и подвергнутых тепловому воздействию образцах, были получены митохондриальные и цитоплазматические фракции из суспензионной культуры A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae. Клетки суспензионной культуры A. thaliana подвергали тепловому воздействию 50С 10 мин и после восстановительного периода 120 мин при 26С выделяли митохондриальную и цитоплазматическую фракции и проводили Вестерн-блоттинг с антителами против цитохрома с. В качестве маркерного фермента митохондриальной фракции использовали матриксный белок митохондрий изоцитрат дегидрогеназу (IDH2) (рис. 4.3.4).
Как видно на рис. 4.3.4. маркер митохондриальной фракции IDH2 в контроле и после обработки температурой 50С присутствовал исключительно в митохондриальной фракции. В то же время цитохром с в контроле детектировался преимущественно в митохондриальной фракции, а после обработки 50С менял своё расположение и большая его часть выявлялась в цитоплазматической фракции.
Для изучения распределения цитохрома с у дрожжей S. cerevisiae после обработки тепловыми воздействиями, культуру инкубировали при температурах 39, 42 и 45С по 30 мин, затем из клеток выделяли митохондриальную и цитоплазматическую фракции белков.
Как можно видеть на рис. 4.4.2 (стр. 106) в контроле и после обработки температурами 39 и 42С цитохром с обнаруживался только в митохондриальной фракции, в то время как после обработки дрожжей температурой 45 С цитохром с детектировался исключительно в цитоплазматической фракции.
Таким образом, гибель клеток суспензионной культуры A. thaliana после теплового воздействия 50С и дрожжей S. cerevisiae после обработки температурой 45С сопровождается высвобождением цитохрома с из митохондрий в цитоплазму.
Отличительной чертой ПКГ является сохранение целостности плазматической мембраны до самых поздних стадий развития процесса (Самуилов и др., 2000).
Мы исследовали целостность плазматической мембраны у дрожжей S. cerevisiae после теплового шока при 45 С 30 мин. Для этого из клеток получали протопласты и анализировали их реакцию на изменение осмотической силы раствора-(рис. 4.3.5).
Как видно на рис. 4.3.5 протопласты, полученные из клеток, обработанных при 45С, не только оставались в состоянии поддерживать целостность плазматической мембраны, но и были способны некоторым образом отвечать на изменение осмотического давления. Так, протопласты, полученные из контрольных дрожжей при помещении в гипертоническую среду, сжимались и сморщивались, в то время как при перемещении в гипотоническую набухали и надувались. Те же явления, хотя и в меньшей степени, происходили с протопластами, полученными из дрожжей после их обработки при 45С. Под цифрой 3 на рис. 4.3.5 показан внешний вид протопластов с разорванной плазматической мембраной после их разрушения в гомогенизаторе (тени протопластов).
Чтобы изучить каким образом изменяется заряд на ВММ у клеток суспензионной культуры A. thaliana при обработке гипертермией, клетки подвергали тепловым воздействиям различной интенсивности в присутствии красители, попадая в клетки, концентрируются на внутренней мембране митохондрий в силу электростатического притяжения в зависимости от величины потенциала на последней (Smiley et al., 1991). JC-1 имеет преимущество по сравнению с другими катионными красителями, так как при увеличении его концентрации на мембране изменяет спектр испускания с зелёной на красную область спектра (Salvioli et al., 1997). Данное обстоятельство позволяет снизить вклад процессов, не связанных с повышением потенциала на ВММ в увеличение интенсивности флуоресценции красителя (например, при набухании митохондрий).
Клетки суспензионной культуры A. thaliana инкубировали при температурах 26, 37, 39, 43, 46 и 50С по 10 мин в в присутствии 10 мкМ JC-1, затем регистрировали интенсивность флуоресценции в зелёном и красном каналах (рис. 4.3.6.1).
Как видно на рис. 4.3.6.1 контрольная культура после окрашивания JC-1 флуоресцировала лишь слегка и только в зелёной области спектра. Обработка при 37С приводила к увеличению диффузной флуоресценции в зелёном канале и появлению в красном ярких флуоресцирующих точек внутри клеток. Если обработку при 37С проводили в присутствии 5 мкМ FCCP, то флуоресценция проявлялась диффузно и только в зелёном канале. Дальнейшее возрастание температуры обработки приводило к прогрессивному увеличению интенсивности флуоресценции, как в красном, так и в зелёном каналах. При этом характер флуоресценции различался. В то время как в красном канале флуоресценция имела вид ярких дискретных образований внутри клетки, в зеленом наблюдали диффузное свечение по всему периметру цитоплазмы.
