Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Меристемы как саморегулирующая система и вопросы роста и развития растений in vitro 11
2.2. Механизмы возникновения сомаклональной изменчивости растений 19
2.3. Генетически-модифицированные растения как модель изучения физиолого-биохимических процессов устойчивости к стрессовым факторам среды 26
2.4. Гормональная и углеводная регуляция клубнеобразования 32
2.5. Генмодифицированный картофель и вопросы регуляции клубнеобразования 33
3. Экспериментальная часть 37
3.1. Объекты и методы исследований 37
3.2. Методика оздоровления картофеля 38
3.2.1. Столонообразование in vitro 38
3.2.2. Культивирование столонов in vitro 39
3.2.3. Фотопериодическая реакция генотипов картофеля к КД и ДД 40
3.2.4. Условия образования микроклубней картофеля 41
3.2.5. Имуннофермептный анализ вирусов картофеля 42
4. Результаты исследований 43
4.1. Образование столонов картофеля в зависимости от сроков посадки черенков in vitro 44
4.2. Особенности образования столонов in vitro 55
4.3. Рост и развитие регенерантов из столонов картофеля in vitro 61
5. Регуляция клубнеобразования различных генотипов картофеля in vitro 73
5.1. Действие сахарозы на репродукционные процессы in vitro 73
5.2. Динамика накопления биомассы органов картофеля у различных генотипов in vitro 77
Заключение 83
Выводы 99
Список литературы 101
- Генетически-модифицированные растения как модель изучения физиолого-биохимических процессов устойчивости к стрессовым факторам среды
- Генмодифицированный картофель и вопросы регуляции клубнеобразования
- Образование столонов картофеля в зависимости от сроков посадки черенков in vitro
- Динамика накопления биомассы органов картофеля у различных генотипов in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Прогресс в области современной биотехнологии растений непосредственно связана с разработкой методических приемов культивирования клеток in vitro. Этим методом получен ряд сомаклональных линий, форм и сортов растений с ценными хозяйственными признаками, которые используются во всех экономически развитых странах мира.
С другой стороны, человеческое сообщество остро нуждается в новых знаниях и технологиях, с тем, чтобы увеличить производство продовольствия, улучшить состояние здравохранения и охрану окружающей среды. В решение этих проблем биотехнология вносит большой вклад. Поэтому применение методов биотехнологии в Республике Таджикистан является одним из важнейших факторов повышения урожайности и, следовательно, экономического потенциала.
С использованием методов генной и клеточной инженерии получен ряд линий, форм культурных растений (картофель, соя, кукуруза и др.), обладающих признаками устойчивости к вирусам, патогенам и пластичности к стрессовым экологическим факторам. Благодаря этому сокращаются сроки получения новых сортов с хозяйственно полезными признаками и получения свободных от вирусов и патогенов семенного материала, что имеет большую перспективу для Республики Таджикистан.
В теоретическом плане представляет интерес изучение степени сортовой вариабельности ДНК, выявленой методом полимеразной цепной реакции (PCR), и физиологических процессов в культуре in vitro с целью разработки методов микроклонального размножения и микроклубнеобразования картофеля.
Зависимость клубнеобразования от действия таких факторов, как световой режим (фитохром), гормонов и, углеводов и т.д. показано в ряде работ X. Чайлахян, (1984; 19.88; Аксенова и др., 2002; Кузнецов, Кулаева, 2004).
Вместе с тем, вопрос о конкретных путях действия фитогормонов и углеводов и их взаимодействие в процессе инициации клубнеобразования остается открытым, т. к. имеющиеся результаты не всегда можно итерпретировать однозначно (Hussey, Stacey, 1995; Davies,1984).
Так, для перехода регенерантов к клубнеобразованию in vitro необходимо наличие высокой концентрации сахарозы (5-10%), но есть сведения о tqm, что сахароза мало влияет на инициацию клубнеобразования. Также много неясного относительно роли фитогормонов в инициации клубней. Так показано, что гиббереллины способствуют росту столонов, но ингибируют формирование клубней (Simko, 1994; Xin Уи et.al, 1998; Irving, 1995).
Для активизации процесса клубнеобразования использовались различные сочетания гормонов и углеводов (Бутенко,1990; Palmer, Smith, 1987). Но эффективного образования микроклубней не было достигнуто, так как повышенное содержание сахарозы или кинетина не индуцировали дополнительного образования столонов с последующим образованием клубней. Не было получено положительных результатов и при культивировании микрочеренков картофеля в темноте по методу G. Hussey и N.L Stacey (1984), а также при изменении температурного режима (+12, +16 С). Поэтому исследование условий, стимулирующих столоно- и клубнеобразование у картофеля in vitro остаётся актуальной задачей. Нам известно всего лишь две публикации (Sassey, Stacey, 1984; Mingo-Castel et.al. 1976), где сделана попытка культивировать столоны картофеля in vitro.
В последние годы многие используют новый подход для регуляции клубнеобразования картофеля in vitro. Так, в частности используются генетически трансформированные регенеранты картофеля с изменённым гормональным статусом, такие, как трансформанты, несущие гены roLB и roLC Agrobacterium Rhizogenes (Аксёнова и др., 2002).
Считаем, что изучение процессов инициации и роста клубней in vitro с использованием культуры столонов позволит выяснить роль углеводов и гормонов в инициации роста клубней и применить возможности методов биотехнологии для клонального размножения картофеля, что и явилось целью наших исследований.
Цель и задачи исследований^ Целью настоящей работы является изучение особенностей культивирования изолированных столонов, возможности их использования в микроклоналыюм размножении, зависимости различных этапов клубнеобразования у генотипов картофеля. В соответствии с этим, поставлены следующие задачи исследований: разработка условий культивирования изолированных столонов картофеля; изучение ростовых процессов регенерантов, полученных из изолированных столонов; изучение процессов микроклубнеобразования у различных генотипов в зависимости от условий фотопериода; сравнительный анализ этапов инициации и роста клубнеобразования картофеля в зависимости от воздействия углеводов в культуре in vitro.
Научная новизна работы:
При изучении роста и размножения регенерантов картофеля in vitro обнаружена сезонность их морфогенной потенции, проявляющая в процессе микроклубнеобразования у пробирочных растений, а также при образовании столонов.
Обнаружены некоторые особенности индукции роста изолированных столонов при изменении условий их культивирования in vitro. Полученные из столонов регенераты обладают более высокой способностью к клубнеобразованию по сравнению с исходными к^меристемными растениями.
Раработана эффективная методика культивирования столонов in vitro.
Обнаружена сезонная зависимость калусообразования у пробирочных растений, индуцируемых из столонов.
Установленно, что процесс клубнеобразования зависит от содержания углеводов и является фенотипической реакцией генотипов картофеля. При сравнении клубнеобразования различных генотипов картофеля (исходный сорт Жуковский-ранний и его температуроустойчивой линии-регененранта) показана неоднозначная реакция по ряду характерных параметров роста, развития и индекса урожая на уровне пробирочных растений. Наиболее существенным отличием является усиление иннициации и роста клубней у клеточно-модифицированных растений под влиянием высокой концентрации сахарозы в культуральной среде, по сравнению с исходным сортом Жуковский-ранний.
Обнаружено, что процесс иннициации и темпа роста микроклубней в зависимости от концентрации сахарозы однонаправленны, но не тождественны, так как масса сформировавшихся клубней в заключительной фазе их роста во многом определяется генотипом и, следовательно, требуют дифференцированных условий инициации и роста клубней in vitro.
Установлена зависимость действия углеводов и гормонов в процессе дифференцировки столоновых клеток картофеля в культуре тканей in vitro, вызывающая активацию морфогенетической потенции растений.
Практическая значимость. Показана возможность использовния культуры столонов in vitro в практической биотехнологии картофеля. Регенеранты, полученные из культуры столонов, обладают значительно более высокими темпами микроклубнеобразования и свободны от вирусов и патогенов, что позволяет наладить новую технологию микроклонального размножения с целью их ускоренного внедрения в семеноводство картофеля. Апробация работы: Материалы диссертации доложены/ представлены на следующих конференциях и симпозиумах:
Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений, Душанбе 2004;
International symposium Transgenic plants and biosafety , Moscov, 2004;
Республиканский симпозиум экономики и науки ГБАО: прошлое, настоящее, будущее, Хорог, 2005.
Научно-практическое совещание «Использование оздоровленного материала в семеноводстве картофеля», Муминобад, 2005.
Конференции молодых ученых Таджикского аграрного университета, Душанбе, 2003-2005 гг.
Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, - Россия 2005г.
International Congress BioVision Alexandria, 2006.
Структура и объем работы: Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 117 стр., содержит 26 рисунков, 9 таблиц. Количество цитированных источников 125.
Публикации. По материалам диссертаций опубликовано 6 экспериментальных работ, 7 тезисов.
2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Генетически-модифицированные растения как модель изучения физиолого-биохимических процессов устойчивости к стрессовым факторам среды
Защитные механизмы растений от различных биотических и абиотических стрессовых факторов вырабатывались на протяжении долгих эволюционных процессов. Эти механизмы сложны и многообразны и не подтверждены экспериментальными материалами. Вместе с тем физиолого-биохимическая основа всего комплекса процессов, происходящих в стрессовых условиях, далеко не изучена. Одни исследователи используют классический подход - получение мутаций генетическими методами, тем или иным образом затрагивающих процессы защитного ответа к стрессовым факторам окружающей среды и их проявления на определенном этапе развития растений (Bowling et.al. 1994; Hunt, Reals, 1996; Reals et.al. 1996; Delney, 1997). С развитием методов генетической инженерии, многие исследователи используют трансгенные растения с вставленными генами различного происхождения с известными функциями, способными проявить защитную реакцию в стрессовых условиях (Пирузян и др., 2000; Решетников и др., 1997; Ленец и др., 1998; Mett et.al., 1993; Сохансандж и др., 1998; Цой и др., 1988). В работах последних лет ведущее место занимает получение растений, устойчивых к фитопатогенам и выяснение защитных механизмов их проявления. Это связано с тем, что растения в ходе онтогенеза сталкиваются с большим количеством патогенов, таких как грибы, бактерии, вирусы, вироиды, нематоды, насекомые, но это не всегда приводит к развитию заболевания. Устойчивость к этим патогенам может быть связана с наличием структурных барьеров или токсичных соединений, которые ограничивают инфекцию растений или при узнавании атакующего патогена активизируются защитные механизмы, благодаря которым его проникновение (инвазия) имеет локализованный характер. Инфекция, ведущая к развитию болезни, происходит в том случае, если защитные механизмы не срабатывают. Защитный механизм на инфекцию проявляется только тогда, когда срабатывает соответствующая пара генов -авирулентности (avr) у патогена и устойчивости (R) у растения. (Dixon, Lamb, 1990; Bent, 1996). Такой феномен известен как «gene-for-gene» взаимодействие к патогенезу (Flor,1971), и патоген авирулентен к растению, поскольку продукты R-генов прямо или опосредованно взаимодействуют с молекулами, образующимися в результате экспрессии генов авирулентности-avr (Keen, 1997). Биохимические основы работы этих генов, далеко не изучены. Молекулы, которые образуются в результате инфекции микроорганизмов, обычно называют элистаторы, которые могут имитировать индукцию защитного ответа (Dixon, Lamb, 1990; Lamb et.al., 1989). Элистаторы, такие как 1,3-р-Д-глюканы, гликопротеины, хитозан, арахидоновая кислота, индуцируют защитный ответ, как у чувствительных, так и устойчивых растений, поэтому они являются неспецифическими элистаторами. Специфические элистаторы индуцируют защитный ответ только в случае несовместимой комбинации растение-патоген, присутствием у растения и патогена пары генов R и avr, и они являются прямыми или непрямыми продуктами генов авирулентности. Модуляторный принцип взаимодействия «gene-for-gene» хорошо срабатывал при проявлении гиперчувствительности растений. К настоящему времени получен обширный материал, позволяющий выяснить активирующие симптомы болезни к широкому спектру фитопатогенов (Hunt, Reals, 1996; Reals et.al., 1996). При образовании некротических повреждений, активируется так называемый «SAR-путь» (systemic acquired resistence), приводящий к развитию системной устойчивости к широкому спектру фитопатогенов. Термин SAR обозначает - повышенная устойчивость к последующей атаке патогенами, т.е. является своего рода иммунизацией растений (Reals at. al., 1996; Chen et.al., 1995).
В пользу этого свидетельствует получение трансгенных растений, экспрессирующих бактериальный ген nahG, который кодирует фермент салицилатгидролаза (деградирующий салициловую кислоту при стрессе). Растения с генами nahG были неспособны к накоплению салициловой кислоты, что коррелировало с блокированием индукции SAR в ответ на инфекцию фитопатогенами (Gaffney et.al., 1993; Delaney et. al., 1994). Снижение уровня салициловой кислоты приводило также к уменьшению устойчивости растений, определяемой взаимодействием генов растения и патогена (Delaney et.al., 1994). Таким образом, показано, что салициловая кислота является эндогенным сигналом в ответ на инфекцию фитопатогенами. Изучение накопления салициловой кислоты у картофеля показало, что неинфицированные растения имеют в 40-100 раз более высокий уровень (Yu et.al., 1997). Однако такое накопление салициловой кислоты у картофеля не ведет к системной активации устойчивости к патогенам. Вместе с тем, системно приобретенная устойчивость к патогенам (Phytophtohor infestana) эффективно индуцировалась элиситором - арахидоновой кислотой в контрольных растениях, но не индуцировалась в NahG-растениях. Таким образом, салициловая кислота является необходимым компонентом в арахидоново-кислотной индуцируемой устойчивости у картофеля, и вопрос участия салициловой кислоты в индукции устойчивости растения остается загадочным. Поэтому познание механизмов стрессовых ответов растений имеет как фундаментальное, так и практическое значение.
Изучение физиолого-биохимических изменений, вызываемых природными стрессовыми факторами является основой для создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью к широкому кругу фитопатогенов, воздействию неблагоприятных факторов среды, таких как засуха, повышение или понижение температуры, засоленность почв и т.д.
В настоящее время созданы трансгенные растения, экспрессирующие гены-ингибиторы протеиназ (Ryan, 1990) и токсины из Bacillus thuringiensis (Perlak et.al., 1991), обладающие высокой устойчивостью к насекомым. С помощью мутагенеза in vitvo нитрозогуанидином был получен мутантный ген aroA E.Coli кодирующий устойчивость к глифосфату фермент-ЕРБР-синтетазе в результате замены Ала-104--Про в аминокислотной цепи (Piruzian et.al., 1988). Этот ген был экспрессирован в растениях картофеля под контролем промотора 35S CaMV. Эти растения картофеля выдержали обработку глифосфатом в концентрации 4-раза превышающую концентрации, применяемые на полях (Simonova et.al., 1994).
Генмодифицированный картофель и вопросы регуляции клубнеобразования
Известно, что цитокинины принимают участие в морфофизиологических процессах, таких как регуляция роста, развитие. В одних случаях они могут инициировать, в других замедлять. Эти процессы кроме того, цитокинины играют существенную роль в проявлении устойчивости к некоторым стрессовым факторам (Кузнецов, Кулаева, 2003). В связи с этим в последние годы широкое распространение получили работы в части генетической интерпретации, целенаправленно изменяющих гормональный статус растений. Одной из возможностей получения трансгенных растений с повышенным содержанием цитокининов явилось обнаружение в геноме Agrobacterium tumefaciens ipt-гена, кодирующего изопентенилтрансферазу, фермента, катализирующего синтез цитокининов в растениях (Schmulling et.al., 1989; Beinsberger et.al., 1991; Алексеева и др., 2000). Были созданы разнообразные конструкции, в которых экспрессия ipt-гена управлялась разными промоторами, одним из таких промоторов был чувствительным к температурному шоку (Schmulling et.al., 1989). Внедрение в растения агробактериального гена ipt открыло новые возможности для изучения роли цитокининов в различных физиолого-биохимических и молекулярно-генетических процессах, протекающих в растительной клетке.
Одним из перспективных подходов к исследованию регуляции клубнеобразования у картофеля могут стать трансгенные растения с измененным уровнем цитокининов. Для этого необходимо получение трансгенных растений картофеля, содержащих в геноме новый агробактериальный ipt-ген или другие гены, меняющие метаболизм углеводов, оказывающие гормоноподобный или гормональный эффект. В этом плане наиболее приемлемым для внедрения в растения картофеля оказался дрожжевой ген-инвертаза. Присутствие в трансгенном картофеле инвертазы представляется важным с учетом роли сахарозы в индукции клубнеобразования in vitro, а также как источника материала для синтеза крахмала в клубнях.
Так, в ряде работ у картофеля изучались экспрессия инвертазы, катализирующий распад сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы (Slitt, Sannewald, 1995; Kossman et.al., 1996; Sonnewald et.al., 1997). Они показали, что в случае, когда внедренный ген инвертазы дрожжей находился под контролем клубнеспецифичного промотора пататина класса I (ВЗЗ-промотор), находящегося в цитоплазме, имело место снижение урожая, более того, происходило уменьшение среднего веса клубней. Наоборот, при локализации дрожжевого гена инвертазы в анопластном пространстве вес клубней увеличивался, а их число уменьшалось.
Другим звеном метаболизма картофеля является синтез крахмала, при этом ключевую роль играет АДФ-глюкозо-пирофосфарилазы (AGP). Поэтому для работ с растениями картофеля, с измененным углеводным метаболизмом, были выбраны трансгенные растения, в которых экспрессия гена AGP ингибированным химерным геном, содержащим кодирующий фрагмент В-субъединицы AGP из картофеля, присоединенный в антисмысловой ориентации к 358-промотору ВМК (Muller-Rober et.al., 1992). При этом показана, что у линии 35S-aAGP обнаружено резкая активизация роста клубней, при высоком содержании сахарозы (8%). В таком случае наличие ИУК мало влияло на размер клубней, а кинетин-вызывал даже его уменьшение (Аксенова и др., 2000). Они показали, что действие фитогормонов проявилось сильнее при концентрации сахарозы, близкой к пороговой для клубнеобразования. Более того, растения с геном ВЗЗ-rolB и особенно ВЗЗ-inv имели сниженный порог концентрации сахарозы для инициации клубней (Аксенова и др., 2000). Таким образом, в вышеперечисленных работах выявлены особенности клубнеобразования у картофеля в условиях in vitro, что может служить основой для дальнейшего изучения взаимосвязи гормональной и углеводной регуляции in vivo как у трансгенных так и у нормальных растений картофеля.
Трансгенные растения картофеля обычно содержат гены rolB и rolC из Agrobacterium rhirogenes (Gaudin et.al., 1994; Лутова и др., 1998; Аксенова и др., 1999). Гены rolB и rolC обычно вызывают гормоноподобные морфогенетические изменения у растений, но не однотипно. Эффект гена rolB напоминает эффект действия ауксинов, гена rolC-цитокининов (Shmulling et.al., 1988). Механизмы действия этих генов в растительных организмах до конца не выяснен. Известно, что in vitro продукт гена rolB способен гидролизовать коньюгаты ауксинов, а rolC-коньюгат цитокининов (Ectruch et.al 1991а; Estruch et.al., 19916). Появились данные о том, что in vivo rol-гены могут менять не столько концентрацию фитогормонов, сколько чувствительность клетки к ним (Лутова и др. 1998; Vreugdenhil, Struik, 1990).
Образование столонов картофеля в зависимости от сроков посадки черенков in vitro
Общее накопление сырой массы и распределение ее по органам растений - регенерантов в зависимости от сезонности показано на рис. 3,4. Из этих данных видно, что распределение сырой биомассы по органам (стеблям, корням) существенно меняется в зависимости от сезонности культивирования растений в среде МС in vitro. Основная доля сырой массы стеблей накапливается при выращивании в течение марта-мая и января-февраля. Накопление основной массы корней также приходится на эти периоды. Увеличение биомассы корней имело место также при культивировании растений-регенерантов в июле-августе при низком приросте стеблей.
Это, возможно, является следствием антагонизма в акцептировании питательных веществ между донорами (стебли) и акцепторами (корни и клубни) в конкретной экспериментальной системе. Процесс клубнеобразования in vitro состоит из ряда последовательных этапов, среди них можно выделить процессы индукции столонов и образование клубней.
Изучали динамику образования столонов и микроклубней у пробирочных растений в течение года при разных сроках черенкования. Черенкование проводили с интервалом 25-28 дней в начале и середине каждого месяца. Из представленных результатов видно, что у растений, черенкованных в марте-августе, столонообразование начинается не раньше, чем через 40 дней после культивирования (табл.1). У растений, черенкованных в течение сентября-февраля, столонообразование задерживается, их рост наступает не раньше 50 дней от начала посадки растений. Примечательно, что чем раньше проводили черенкование (весенний период), тем раньше отмечалось начало столонообразования и тем больший процент растений имели столоны. Высокий уровень образования столонов отмечен у растений, черенкованных в начале марта и в конце апреля. Количество столонов в этом периоде составляло 42% после 40 дней выращивания и к 50 дню доля растений, имеющих столоны, составляла 97%. Этот показатель не изменялся в последующий период выращивания растений in vitro.
Высокий уровень образования столонов также был отмечен у растений, черенкованных в начале мая и конце июня. Столонообразование к 40 дню выращивания наблюдалось у 37% растений и выросло до 98% после 50-60 дней выращивания. Следует отметить, что растения, черенкованные в июле-августе, развивались медленнее и образовывали столоны в 2 раза меньше. Растения, черенкованные в период с сентября по начало февраля, гораздо медленнее развивались и столонообразование практически не наблюдалось. Образование столонов у этих растений было отмечено в конце вегетации и в незначительных количествах, что видно из данных табл.1 (всего у 8-12% растений).
Н а этот период наблюдаеся образование воздушных столонов и клубней (рис. 5, 6.). Образование воздушных клубней отмечен во всех вариантах опыта. Массовое появление воздушных клубней в этот период посадки черенков, видимо связано с изменением температурного режима и влажности воздуха, которое характерно для июля-августа месяцев. Регулирование этих факторов в культивационном домене в даный момент технически не возможно. Воздушные клубни имеют несколько меньшую массы по сравнению с клубнями образовавшимися в нижней части растений (корней).
Сравнение динамики роста столонообразования с динамикой роста растений (табл.2) показало, что у растений, выращенных в пробирках, наблюдается определенная зависимость между темпами роста вегетативных частей и образованием столонов.
Динамика накопления биомассы органов картофеля у различных генотипов in vitro
Подавляющее количество видов картофеля распространены в горных и высокогорных зонах Южной, Центральной и Северной Америки, где продолжительность дня колеблется в пределах 12 ч (Чайлахян , 1988). Это соответствует фотопериодическим условиям короткого дня (КД). Для клубнеобразования благоприятен короткий день с резко выраженными суточными колебаниями температуры (Жуковский, 1971; Скрипчинский, 1975; Марков, 2002).
В настоящее время разработана теория гормональной регуляции клубнеобразования картофеля (Чайлахян ,1971, 1988), согласно которой содержание гибберелловой кислоты (ГК) в растениях зависит от факторов среды.
Установлено, что ГК накапливается в растениях на свету, но разрушается в темноте (Ложникова, Чайлахян , 1969), поэтому в условиях длинного дня (ДД) у картофеля наблюдается низкий уровень клубнеобразования, что компенсируется в экспериментальных условиях обработкой абсцизовой кислотой (АБК) (Mashackova et.al, 1998). В настоящее время показано, что у ДД - растений при переходе на КД (короткий день) содержание АБК повышается (Марков, 2002), повышается уровень АБК также при воздействии положительных низких температур (Xun, Zipaul, 1992). Такая система условий соответствует первичным ареалам распространения картофеля в полиэкваториальных широтах, т.е. в условиях КД-фотопериода. Поскольку в этих зонах наблюдаются ритмичные суточные колебания температуры воздуха и почвы (ночные холода), содержание АБК остается на высоком уровне, что способствует клубнеобразованию. Поэтому многие авторы в экспериментах с ДД-растениями используют различные факторы, усиливающие образование фитогормонов с последующей генеративной репродукцией (Марков, 2002; Аксёнова и др., 2002) и, следовательно, формируют клубни, т.е. депонируют ассимиляты и осуществляют вегетативную репродукцию.
Поскольку клубнеобразование является эволюционно сформировавшимся, генетически детерминированным и экологически пластичным признаком картофеля, то для его изменения необходим поиск новых подходов. Такой методический инструмент, влияющий на генетическую систему, основан на использовании методов современной биотехнологии (молекулярная биология, клеточная и генная инженерия).
В настоящее время развёрнуто интенсивное исследование факторов, инициирующих морфогенетические процессы, регулирующие клубнеобразование картофеля. Для формы фитохрома - phyA и phyB (Аксёнова и др, 2002) в морфогенетическом процессе картофеля показано, что phyB строго контролирует клубнеобразование при коротком дневном фотопериоде и моделирует реакцию ингибирования формирования клубней длинным днём (Jarkson et.al, 1996).
Для выяснения морфогенетических процессов и увеличения фотосинтетической продуктивности в последние годы широко используются трансгенные растения картофеля (Аксёнова и др, 2002; Гришунина и др., 2004), как перспективное направление, имеющее как фундаментальное, так и прикладное значение.
В целях изучения роли физиологических факторов в клубнеобразовании в настоящей работе приведены результаты исследования эффекта различных факторов на фотопериодическую реакцию клубнеобразования клеточно модифицированного картофеля, выращенного в различных условиях фотопериода. Ранее нами было показано, что культивируемые in vitro растения картофеля являются удобной моделью для изучения реакции клубнеобразования (Давлятназарова и др. 2003).
Динамика инициации образование клубней с регенерантами (растениями) генотипов контрольных (сорт Жуковский ранний) и ТУ-регенеранты при выращивании их на длинном (ДД) и коротком (КД) дне при различных концентрациях сахарозы, внесенных в культуральную среду, показана на рис.15.
Контрольные растения при всех концентрациях сахарозы (5;7;9%) сформировали клубни как на ДД, так и на КД (кривые 1,2). Содержание сформировавшихся клубней у этих растений на КД было выше по сравнению с растениями на ДД. При 7% сахарозе контрольные растения формировали наибольшее количество клубней, чем при 5 и 9% сахарозе. Эти различия проявились чётко после 40-дневного культивирования растений. У модифицированных растений ТУ-регенерантов наибольшая инициация клубней отмечена при 9% концентрации сахарозы (кривая 4). ТУ-регенеранты проявили большую чувствительность к ингибирующему действию ДД, чем контрольные растения при такой же концентрации сахарозы (кривая 3,4,). Следовательно, ТУ регенеранты обладали короткодневной фотопериодической реакцией клубнеобразования. Сравнение динамики инициации клубней у опытного варианта (ТУ-регенеранты) при 5,7,9 % содержания сахарозы показало также зависимость ингибирующего действия ДД от уровня углеводного питания растений в условиях in vitro.
