Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Состав и структура клеточной стенки 8
1.2. Современные представления о механизме синтеза полисахаридов клеточной стенки 17
1.3. Нуклеотидсахара, гликозилтрансферазы 21
1.4. Целлюлозосинтетазный комплекс, целлюлоза I, II 28
1.5. Цитоскелет и синтез целлюлозы 37
1.6 Регуляция биосинтеза полисахаридов клеточной стенки 39
Глава 2.Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования 44
2.2 Выделение и фракционирование клеточной стенки 45
2.3 Измерение мембранного потенциала 46
Глава 3. Результаты и обсуждение 47
3.1 Краткий анализ данных литературы по вопросу о наличии зависимости интенсивности синтеза целлюлозы от величины мембранного потенциала на плазмалемме. 48
3.2 Существует ли потенциалозависимость целлюлозосинтетазного комплекса? 52
3.3 О связи интенсивности синтеза полисахаридов клеточной стенки с электрогенной активностью протонного насоса плазмалеммы. 60
3.4 Роль протонного насоса плазмалеммы в мембранной регуляции синтеза целлюлозы. 69
3.5 О роли внутриклеточной концентрации ионов калия в интенсивности синтеза целлюлозы клеточной стенки 86
Заключение 91
Выводы 94
Литература 95
- Современные представления о механизме синтеза полисахаридов клеточной стенки
- Цитоскелет и синтез целлюлозы
- Выделение и фракционирование клеточной стенки
- Существует ли потенциалозависимость целлюлозосинтетазного комплекса?
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. К настоящему времени
получена обширная информация о составе и структуре растительной
клеточной стенки. Существенно скуднее выглядят данные литературы о
механизмах регуляции синтеза основных её компонентов - полисахаридов и,
в частности, целлюлозы. Изучена структурная организация
целлюлозосинтетазного комплекса в плазматической мембране
растительных клеток (Тарчевский, Марченко, 1985; Saxena et al., 2001). Однако роль самой плазмалеммы в регуляции этого комплекса остается малоизученной. Интерес к такой проблеме обусловлен гипотезой о возможности непосредственного влияния величины электрического мембранного потенциала (МП) плазмалеммы на интенсивность синтеза целлюлозы, высказанной Делмер с соавторами на основании данных, полученных ими на модельных препаратах из волосков семян хлопчатника и на целых метаболизирующих клетках ацетобактерий (Delmer et al., 1982). Эта гипотеза не противоречит физическим процессам, которые могут сопровождать функционирование ферментных комплексов в сильных электрических полях, как это имеет место в случае трансмембранного целлюлозосинтетазного комплекса. Действительно, при потенциале около 100 мВ и толщине плазмалеммы около 10 нм, напряженность электрического поля в толще этой мембраны может достигать 100 кВ/см, поэтому конформационная динамика глобул целлюлозосинтетазного комплекса, а, возможно, и целлюлозосинтетазная активность клеток, могут находиться под контролем МП. Многие исследователи, отмечая работы группы Делмер о связи интенсивности синтеза целлюлозы с величиной мембранного потенциала на плазмалемме, выражали удивление, что эти работы не имеют продолжения (см., например, Gibeaut and Carpita, 1994). Вместе с этим нельзя было исключать, что вышеотмеченные данные Делмер имеют и другую трактовку. Важным элементом, формирующим и определяющим МП, а также
6 регулирующим транспортные процессы на плазмалемме, является её протонный насос (электрогенная ІҐ-АТФаза). Важная роль в поддержании МП у клеток высших растений принадлежит также ионам калия. Поэтому не исключено, что регулирующую роль мембранного потенциала в синтезе полисахаридов клеточной стенки у растений необходимо рассматривать во взаимосвязи МП с электрогенной активностью протонного насоса и /или с активностью калиевых каналов плазмалеммы.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении роли
мембранного потенциала, протонного насоса и калиевых каналов
плазмалеммы в регуляции синтеза полисахаридов клеточной стенки у
растений с акцентом на изучение их роли в целлюлозосинтетазной
активности клеток. В связи с этой целью были поставлены следующие задачи исследования:
- изучить изменения во включении экзогенной ' С-глюкозы в различные по растворимости фракции полисахаридов клеточной стенки при изменениях величины МП на плазмалемме (как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения абсолютной величины МП от нормального (контрольного) состояния), вызванных путем изменения соотношения вкладов метаболической и диффузионной составляющих в общую величину МП,
- изучить влияние мембранных каналоформеров (грамицидин S, нистатин) на биосинтез полисахаридов клеточной стенки и на метаболическую составляющую МП,
- изучить влияние некоторых ингибиторов и активаторов протонного насоса плазмалеммы на интенсивность включения метки в целлюлозную фракцию клеточной стенки,
- изучить влияние блокаторов калиевых каналов плазмалеммы на интенсивность синтеза целлюлозы.
Научная новизна работы. Вопреки существующей гипотезе продемонстрировано, что интенсивность синтеза целлюлозы не находится под прямым контролем мембранного потенциала плазмалеммы.
Показано, что на уровне плазмалеммы отличие, приводящее к кардинальным изменениям в интенсивности синтеза целлюлозы под влиянием двух широкоизвестных активаторов ростовых процессов - ИУК и фузикокцина, связано с тем, что последствием активации протонного насоса под влиянием ИУК является активация калиевых каналов входящего выпрямления, а активирующий протонный насос эффект фузикокцина сопряжен с блокированием этих каналов.
Показано, что причиной наблюдаемой по результатам большого числа экспериментов корреляции интенсивности синтеза целлюлозы с МП и с величиной метаболической составляющей МП может быть сопряженная с электрогенной активностью протонного насоса активность (вероятность открытого состояния) Кіп+-каналов плазмалеммы.
Выдвинута гипотеза о том, что на заключительном этапе изменений
ионного транспорта через плазмалемму эта мембрана регулирует
интенсивность синтеза целлюлозы посредством контроля
цитоплазматической концентрации ионов калия.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов, лежащих в основе регуляции биосинтеза целлюлозы. Обнаруженное изменение полисахаридного состава клеточных стенок под влиянием экзогенных ионов калия и кальция создает предпосылки для возможности управления составом полисахаридов клеточной стенки и технологическими качествами промышленно важных сортов растений.
Современные представления о механизме синтеза полисахаридов клеточной стенки
Одним из важнейших вопросов биогенеза клеточной стенки является вопрос о месте синтеза ее компонентов - целлюлозы, ее предшественников, компонентов матрикса. Ответ на этот вопрос со временем, т.е. по мере поступления новых экспериментальных данных, претерпел изменения. Поначалу внимание исследователей было привлечено к аппарату Гольджи, и была отмечена его особая роль в образовании клеточной стенки между дочерними клетками (Muhlethaler, 1967; Brown, Montezinos, 1976; Atalla et al., 1984; Koyama et al, 1997; Blanton, Haigler, 1996; Bulone et al.,1999). Поскольку аппарат Гольджи относится к экскреторному механизму животных и растительных клеток, то считалось, что все компоненты клеточных стенок, включая и целлюлозу, синтезируются в этих органоидах. Экспериментально, в пузырьках аппарата Гольджи у водоросли Pleurachrysis schefellii было обнаружено наличие Р 1,4-глюкансинтазной активности и даже наличие чешуек целлюлозы (Brown et al., 1970). И если последний факт впоследствии, все-таки, оказался исключением, то присутствие в аппарате Гольджи (3-1,4-глюкансинтазной активности дезориентировало исследователей в течение некоторого времени. Однако синтез целлюлозы в этих органоидах не происходил, и была высказана версия, что образующиеся в них молекулы целлюлозосинтетазы просто не активны до тех пор, пока не будут доставлены в плазмалемму (Shore, Maclachlan, 1975). Лишь опытами с ингибитором белкового синтеза - циклогексимидом было установлено, что выноса этого фермента из диктиосом аппарата Гольджи не происходит, и он играет в этих органоидах самостоятельную роль - синтез Р-1.4-глюканового скелета гемицеллюлоз, которые образуются в этих органоидах (Harris, Northcote, 1971; Ray et al., 1976; Wright, Northcote, 1976). При синтезе в них ксилоглюкана (основной гемицеллюлозы двудольных и луковичных) ксилоглюкановая синтаза катализирует одновременный перенос глюкозы и ксилозы к предварительно синтезированному (3-1,4-глюкану (Hayashi, Maclachlan, 1986). Синтез ксилоглюкана стимулируется двухвалентными катионами, главным образом Мп2+ (а не Mg2+), а ионы Са2+ не содействуют его синтезу (Hayashi, 1989).
В ходе pulse-chase экспериментов было установлено, что время переноса вновь синтезированных полимеров к плазматической мембране с помощью везикул аппарата Гольджи составляет примерно 10-30 минут (Fry, 1988). Сливаясь с плазматической мембраной, везикулы высвобождают свое содержимое за пределы плазмалеммы в клеточную стенку.
Параллельно в литературе обсуждалась и роль эндоплазматического ретикулума в процессе формирования клеточной стенки. Помимо того, что он является местом синтеза белков, необходимых для образования мембран аппарата Гольджи, его активизацию вблизи плазмалеммы связывают также с синтезом белков, необходимых для формирования клеточной стенки (Hereward, 1974). Активная роль эндоплазматической сети в процессах регенерации клеточной стенки показана у протопластов табака (Burgess et al., 1973, Burgess et al., 1974) и скимии (Robenek, 1980), в культуре ткани шелковицы (Wooding, 1968), на водорослях (Brown, Montezinos,1976). В ряде работ Лозовой с соавторами (Лозовая и др., 1982; Лозовая, 1985) было показано, что процесс восстановления клеточной стенки изолированными протопластами мезофилла бобов связан с функциональной активностью как эндоплазматической сети, так и аппарата Гольджи.
По-видимому, следует говорить об участии и аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума в цитоплазматических процессах, связанных с образованием клеточной стенки у высших растений. Важную роль в формировании клеточной стенки играет плазмалемма, в которой находятся ферменты, ответственные за синтез целлюлозы и каллозы.
Сначала существовало предположение, что эти полисахариды синтезируются одним и тем же ферментом (мультиферментным комплексом) (Jacob, Northcote, 1985; Delmer, 1987). Например, есть интересные данные о том, что мембранные препараты плесени Dictyostelium discoideum, синтезирующие только целлюлозу в условиях in vivo, в условиях in vitro могут катализировать синтез как целлюлозы, так и каллозы. Подобная "гибкость" фермента, регулировалась различными соединениями (целлобиозой, Р-фурфурил-Р-гликозидом), катионами (например, Са ), уровнем фосфорилирования белка (Girard, Maclachlan, 1987; Ohana et al., 1993; Delmer, 1995).B работе Kudlicka, Brown (Kudlicka, Brown, 1997) целлюлозо- или каллозосинтетазная активность зависели от содержания дигитонина: 0,05-0,1 % концентрация дигитонина была оптимальной для образования целлюлозы, а при 1 % - в основном, происходило образование каллозы. Поскольку дигитонин в высокой концентрации (1%) может нарушать интактность ферментативного комплекса, вызывая диссоциацию его субъединиц, то было высказано предположение, что в нативном состоянии ферментативного комплекса (когда все его компоненты интегрированы) синтезируется целлюлоза, а каллозосинтетазные участки при этом блокируются. Существовала и другая версия объяснения более успешного синтеза каллозы в неблагоприятных условиях (например, in vitro), которая базировалась на предполагаемых свойствах соответствующих каталитических участков фермента присоединять одновременно 2 молекулы УДФГ (как это происходит при синтезе целлюлозы) или только одну молекулу УДФГ (при синтезе каллозы) (Saxena, Brown, 1997). Каталитический участок присоединяющий одну молекулу УДФГ может иметь больше шансов для получения субстрата при нарушении конформации ферментативного комплекса и таким образом успешно конкурировать с целлюлозосинтетазным участком.
Однако недавние результаты исследований по клонированию ДНК каллозосинтетазы и целлюлозосинтетазы показали, что эти ферменты не имеют гомологии в первичной аминокислотной последовательности, тем самым опровергли гипотезу о том, что 1,3- и 1,4-глюкановые синтезы могут катализироваться одним и тем же ферментом (Hong et al., 2001). Таким образом, в цитоплазме имеется два фермента - каллозосинтетаза и целлюлозосинтетаза, которые имеют очень схожую топологию на мембране, включая присутствие большой гидрофильной петли, длинного N-терминального сегмента и короткого С-терминального сегмента, локализованных на цитоплазматической стороне плазмалеммы. Похожесть в топологии этих белков согласуется с их биологическими функциями - оба фермента используют один и тот же субстрат (УДФГ) для синтеза полисахаридов. Предполагают, что могут быть две разновидности генов в растениях, кодирующих каталитическую субъединицу каллозосинтетазы. Одна из них является классической Са -активируемой формой - обнаружена в различных тканях растений (Delmer, Amor, 1995; Kudlicka, Brown, 1997), a вторая разновидность гена характерна для пыльцевых трубок и активируется протеазами или обработкой детергентами в условиях in vitro, но не ионами Са2+ (Schlupmann et al., 1993).
Цитоскелет и синтез целлюлозы
Роль цитоскелета в синтезе целлюлозы рассматривается во многих статьях (Giddings, Staehelin, 1991; Green, Selker, 1991; Cyr, 1994, Delmer, Amor, 1995; Wymer, Lloyd, 1996). Существует гипотеза, что сеть кортикальных микротрубочек, расположенных во внешних слоях цитоплазмы в соседстве с плазмалеммой, определяет ориентацию целлюлозных микрофибрилл, поскольку между ориентацией этих двух структур наблюдается тесная взаимосвязь (Heath, 1974). Это наблюдается не только в процессе роста первичной клеточной стенки, но и при укладке вторичных слоев. В работе Mizuno (Mizuno, 1996) при разделении каллозо- и целлюлозосинтетазных активностей афинной хроматографией с использованием колонки с антителами на тубулин, с колонкой связывалась только целлюлозосинтетазная активность. Целлюлозосинтетаза могла быть элюирована с колонки и сохраняла при этом свою активность in vitro. Подтверждением этой гипотезы служат также эксперименты с ингибиторами микротрубочек, которые изменяли ориентацию отложения микрофибрилл (Green, 1962; Wymer, Lloyd, 1996). Каким же образом, все-таки, сеть кортикальных микротрубочек может "руководить" отложением целлюлозных микрофибрилл в определенном направлении? Одни авторы, изучавшие функциональные "взаимоотношения" микротрубочек с везикулами аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, пришли к выводу, что микротрубочки ориентируют везикулы и тем самым определяют места интенсивного синтеза клеточной стенки (Pickett-Heaps, Northcote, 1966). То есть, микротрубочки как бы "организуют" приток везикул аппарата Гольджи, заполненных пектиновыми веществами, гемицеллюлозами, гликопротеидами к тем местам плазмалеммы, где осущесвляется синтез микрофибрилл целлюлозы. Некоторые авторы предполагают участие микротрубочек в движении ферментных комплексов, связанных с мембранами (Heath, 1974). Целлюлозосинтетазы, посредством соединяющего компонента (например, белка kinesin) взаимодействуют с ближайшей микротрубочкой и передвигаются в полужидкой плазмалемме вдоль микротрубочки, вследствие чего микрофибриллы целлюлозы ориентируются вдоль лежащих под плазмалеммой микротрубочек. Возможно даже, что кортикальные микротрубочки, делая более твердой плазматическую мембрану, "создают" в определенном месте "корридоры", внутри которых целлюлозосинтетазные комплексы свободно движутся (Staechelin, Giddings, 1982). Имеются также данные (Brower, Hepler, 1976), демонстрирующие наличие контактных "мостиков" между микротрубочками и плазматической мембраной, между микротрубочками и цитоплазматическими везикулами. Авторы считают, что эти "мостики" являются связующим звеном во взаимодействии микротрубочек и плазматической мембраны, в результате чего осуществляется ориентация микрофибрилл.
Есть мнение, что и микрофиламенты актина, которые взаимодействуют с микротрубочками кортикального слоя и плазмалеммой, могут участвовать в процессе отложения микрофибрилл целлюлозы (Kobayashi et al., 1987; Seagull, 1990).
В последнее время была высказана гипотеза, что синтез целлюлозы, в свою очередь, необходим для нормальной организации сети кортикальных микротрубочек (McClinton, 1998). Однако наряду с этим имеются данные и об отсутствии корреляции между расположением микротрубочек и направлением отложения целлюлозных микрофибрилл (Emons, 1990; 1992; 1998). Emons было обнаружено, что в клетках закончивших рост самые последние отложения целлюлозных микрофибрилл, в основном, не были параллельны кортикальным микротрубочкам (Emons et al., 1992).
Заслуживает внимания геометрическая модель, предложенная Emons с соавторами, которая, по их мнению, может объяснить образование любого типа архитектуры клеточной стенки встречающихся в растительных клетках. (Emons, 1994; Emons, Kieft, 1994; Emons, Mulder, 1997; 1998; 2000). Эта модель количественно связывает угол отложения (относительно оси клетки) целлюлозных микрофибрилл с геометрией клетки, плотностью активных целюлозосинтетаз в плазматической мембране, количеством матриксных молекул между целлюлозными микрофибриллами в клеточной стенке, т.е. с расстоянием между отдельными микрофибриллами.
Системы регуляции обеспечивают гомеостаз организма, а также создают условия для его развития (эпигенеза). К внутриклеточным системам регуляции, возникшим в ходе эволюции, относятся регуляция генетическая и на уровне ферментов, а также мембранная регуляция. Генетическая регуляция - стратегический путь регуляции реакций биосинтеза полисахаридов, включающий в себя регуляцию на уровне репликации, транскрипции, процессинга и трансляции и осуществляемый за счет синтеза новых молекул ферментов. Этот тип регуляции определяет различия в способах образования целлюлозы у представителей отдельных таксономических групп (бактерии, водоросли, высшие растения), и изменения в синтезе полисахаридов при переходе от формирования первичной клеточной стенки к формированию вторичной. Период перехода клетки к синтезу вторичной клеточной стенки характеризуется многократным (почти в 100 раз) усилением синтеза целлюлозы. Столь значительные изменения скорости синтеза целлюлозы могут быть обусловлены изменениями на уровне экспрессии генов, кодирующих необходимые для синтеза целлюлозы белки. И действительно, в опытах in vitro по трансляции РНК, выделенной из хлопкового волокна в разные периоды развития, было обнаружено существенное увеличение уровня транслируемых мРНК, связанное с переходом к синтезу вторичной клеточной стенки (Delmer et al., 1987).
Регуляция активности ферментов определяется, как известно, физико-химическими факторами внутриклеточной среды (температура, рН, ионная сила и др.), факторами, действующими на уровне каталитического центра (субстрат, продукт реакции, коферменты, кофакторы, ингибиторы) и на уровне аллостерического центра (Кретович, 1980).
Рядом исследователей (Курсанов, Выскребенцева, 1953; Pilonnell et al., 1980; Tarchevskii et al., 1984; Тарчевский, Марченко, 1985) был установлен факт значительной недонасыщенности субстратами синтеза структурных полисахаридов. Так в работах Тарчевского с соавторами (Тарчевский, Марченко, 1985) повышение концентрации ССЬ в атмосфере до уровня значительно превышающего начало углекислотного насыщения или концентрации экзогенной глюкозы приводило к значительному усилению синтеза целлюлозы. Это и понятно, поскольку низкая концентрация СОг (0,03 %) в атмосфере является главным лимитирующим фактором фотосинтеза у растений, фотосинтезирующий аппарат которых "настроен" на гораздо более высокую концентрацию С02.
Выделение и фракционирование клеточной стенки
Для выделения клеточной стенки навеску (100-200 мг) растительного материала гомогенизировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,2), после чего осадок отделяли центрифугированием. Эту процедуру повторяли трижды. Далее осадок последовательно промывали три раза 80% ацетоном и один раз калий-фосфатным буфером. Для удаления крахмала из фракции клеточных стенок осадок на 16 часов заливали раствором а-амилазы (из расчета 1 мг а-амилазы на 10 мг сухой исходной навески). Качество отделения крахмала контролировали под микроскопом по окрашиванию KJ. Полисахариды клеточных стенок фракционировали по растворимости методом Nishitani (Nishitani et al, 1982). Пектины выделяли с помощью 0,1 М раствора оксалата аммония (хелатирует ионы кальция и приводит к растворению пектиновых веществ). Для этого фракцию клеточной стенки трижды кипятили в течение одного часа на водяной бане с последующим центрифугированием. Аликвоты надосадочных жидкостей, содержащие пектины объединяли. Для выделения щелочерастворимых полисахаридов осадок заливали 16-процентным NaOH, тщательно ресуспендировали, пробирки плотно закрывали крышками и оставляли на 14 часов. Затем центрифугировали, еще дважды повторяли такую обработку щелочью и четыре раза осадок промывали дистиллированной водой. Супернатанты полученной фракции щелочерастворимых гемицеллюлоз объединяли, измеряли радиоактивность. Кислоторастворимые гемицеллюлозы получали кипячением с уксусно-азотным реактивом (смесь концентрированной азотной и ледяной уксусной кислот в соотношении 1:10) в течение одного часа на водяной бане. Осадок промывали дистиллированной водой четыре раза с последующим центрифугированием. Оставшийся осадок представлял собой целлюлозу. Радиоактивность всех полученных фракций измеряли в жидком сцинтилляторе (ЖС-8) на радиометре Delta-ЗОО фирмы "Tracer Analytic" (США).
В работе были использованы 14С-глюкоза и соли отечественного производства, а-амилаза, нистатин, грамицидин S, ДЦКД, ИУК, хлорпромазин, ортованадат Na, ТЭА фирмы "Serva" (Германия), фузикокцин ("Sigma", США). Биологическая повторность опытов - трехкратная, аналитическая повторность в опытах с радиоактивностью - 4-5-кратная, при измерении мембранного потенциала - 10-кратная. Расчет интенсивности включения С-глюкозы во фракции полисахаридов клеточных стенок производили на единицу сухой массы ткани. В таблицах приведены средние арифметические величины биологических повторностей и ошибки генеральной средней. Достоверность оценивали по критерию Стьюдента.
Для измерения мембранного потенциала (МП) плазмалеммы клеток корня использовали микроэлектродную технику. Стандартные микроэлектроды изготовляли из стекла «пирекс» на микрокузнице МЭ-4. Электронное оборудование для осуществления одноэлектродной методики фиксации тока было реализовано на базе электрофизиологической лаборатории фирмы «Experimetria», Венгрия. Микроэлектрод с помощью микроманипулятора КМ-2 вводили в цитоплазму клеток ризодермиса в области зоны роста (1,5-2 см от кончика корня). Контроль цитоплазматической локализации кончика микроэлектрода осуществляли по критерию соответствия входного сопротивления и электрической емкости цитоплазматическому компартменту. Подробно методика описана в работе (Великанов и др., 1992).
Потребление кислорода корнями пшеницы измеряли на аппарате Варбурга совместно с лабораторией Гордона Л.Х. Глава 3. Результаты и обсуждение Как видно из обзора литературы, матриксные полисахариды клеточной стенки растений - гемицеллюлозы и пектиновые вещества - синтезируются в аппарате Гольджи, в то время как молекулы целлюлозосинтетазы, ответственные за синтез наиболее распространенного биополимера на Земле - целлюлозы, локализованы в плазмалемме. Весьма важно отметить, что целлюлозосинтетаза, представляющая собой сложную трансмембранную белковую структуру, "работает" в сильном электрическом поле мембраны большой напряженности («100 мВ/100 А = 100 кВ/см). Поэтому из-за возможной асимметрии разноименных зарядов в глобулах розетки или в их отдельных гидрофильных частях вероятно существование соответствующих дипольных моментов, а конформационная динамика глобулы или отдельных ее электрических диполей может находиться под контролем трансмембранного электрического поля. В такой ситуации можно предположить существование непосредственного влияния величины электрического мембранного потенциала (МП) на активность целлюлозосинтетазы. На возможность такого влияния указывали и данные группы Delmer, полученные на модельных препаратах из волосков семян хлопчатника и на целых метаболизирующих клетках ацетобактерий (Delmer et al., 1982). В этих опытах синтез целлюлозы зависел от величины мембранного потенциала, и направленность изменений целлюлозосинтетазной активности была одинаковой для обоих объектов: меньшему напряжению соответствовала меньшая активность синтетазы. Авторы сделали заключение о том, что изменение мембранного потенциала может служить регулирующим фактором в синтезе целлюлозы in vivo.
Существует ли потенциалозависимость целлюлозосинтетазного комплекса?
Обнаружено существенное увеличение мембранного потенциала корневых клеток проростков пшеницы и льна в варианте с ЭДТА по сравнению с вариантом с СаС12. Мы проанализировали причину такого увеличения напряжения.
Распространенным способом определения реального вклада метаболической компоненты в мембранный потенциал является анализ изменений последнего при действии на клетку химических агентов, блокирующих Н+-АТФазу (протонный насос плазмалеммы). Для этой цели применили ортованадат натрия (0,2 мМ, часовое воздействие). Значения мембранного потенциала снизились как на корнях проростков пшеницы, так и на корнях проростков льна, но в варианте с ЭДТА остались более высокими, чем в варианте с СаСЬ (рис. 7, 8). Для проверки наличия изменений связанного заряда цитоплазмы в этих вариантах опытов на корнях пшеницы использовали хлорпромазин в высокой концентрации (1 мМ, часовое воздействие), который нарушает ионную селективность и барьерные свойства плазмалеммы. В обоих вариантах опыта (СаСЬ и ЭДТА) регистрировали одинаково низкий уровень доннановского потенциала цитоплазмы в клетках корней пшеницы (рис. 7). Поскольку в опыте мы использовали ортованадат Na в концентрации обеспечивающей максимальное снижение уровня мембранного потенциала (его метаболической компоненты), а напряжение в обоих вариантах опыта с хлорпромазином было одинаковым, то можно заключить, что более высокое напряжение в варианте опыта с ЭДТА объясняется увеличением именно диффузионной компоненты и связано с увеличением проницаемости плазмалеммы для ионов калия. Это подтверждается и данными литературы (Oka et al., 1987; Опритов и др., 1991). Например, Ока с соавторами (Oka et al., 1987) в работе, выполненной на изолированных протопластах растительных клеток показали, что действие СаСЬ и ЭДТА на мембранный потенциал связано с изменением отношения коэффициентов проницаемости плазмалеммы для ионов калия и хлора, т.е. с изменением диффузионной компоненты напряжения. На следующем этапе работ мы проанализировали интенсивность синтеза полисахаридов клеточных стенок в этих двух вариантах опыта (результат показан в табл. 1). Следует отметить, что значения мембранного потенциала клеток корней перед началом экспозиции на растворе С-глюкозы, в процессе экспозиции и сразу после ее завершения различались недостоверно, поэтому в таблице приводятся только данные, полученные перед экспозицией корней на 14С-глюкозе. В варианте опыта с ЭДТА, т.е. при более высоком значении напряжения на плазмалемме, для корней проростков пшеницы отмечена значительно более низкая интенсивность синтеза целлюлозы из С-глюкозы. На корнях льна-долгунца по синтезу целлюлозы получен качественно такой же результат, что и на корнях пшеницы: большему уровню напряжения соответствовал меньший уровень интенсивности синтеза целлюлозы. Таким образом, объектоспецифичность не обнаружена.
Необходимо отметить, что в наших опытах в варианте с ЭДТА корни были короткие, но толстые, в то время как в варианте с СаСЬ наблюдался более интенсивный рост клеток растяжением: к началу опыта корни (пшеницы) в 2 раза тоньше, но в 3-4 раза длиннее. Не исключено, что в вариантах с ЭДТА С-глюкоза использовалась на синтез вторичной клеточной стенки, а в вариантах с СаС12 - первичной. Поэтому мы осуществили процедуру изменения диффузионной составляющей мембранного потенциала и проконтролировали соответствующие изменения в синтезе полисахаридов клеточной стенки растениями для каждой фазы развития, т.е. для каждого варианта среды выращивания.
В обоих вариантах данного опыта при уменьшении напряжения на плазмалемме за счет экзогенного калия произошло увеличение синтеза целлюлозы по отношению к соответствующему контролю и не изменилась интенсивность синтеза матриксных полисахаридов. В данном опыте, как и в предыдущем опыте (см. рис. 7, 8, табл. 1), наблюдается корреляция изменений интенсивности синтеза целлюлозы с изменением МП на плазмалемме. Однако, в наших опытах, в отличие от результатов Delmer наблюдается другой знак корреляции изменений интенсивности синтеза целлюлозы с изменением величины мембранного потенциала, а именно: большему уровню напряжения на плазмалемме соответствует меньшая интенсивность синтеза целлюлозы.
При анализе полученных нами данных и данных литературы обнаруживается важное обстоятельство: при изменении значений мембранного потенциала в одном и том же диапазоне при действии различных химических агентов оказывается можно наблюдать разные по знаку приращения в интенсивности синтеза целлюлозы. Так при одинаковом по величине увеличении мембранного потенциала от контроля под влиянием ИУК (см. выше анализ данных литературы, а также представленные нами данные по влиянию ИУК на интенсивность синтеза целлюлозы, табл. 5 ) и ЭДТА наблюдаются разнонаправленные изменения в интенсивности синтеза целлюлозы. Разнонаправленными оказываются такие изменения и при уменьшении величины мембранного потенциала в одном и том же диапазоне значений от уровня контроля при действии ингибиторов энергетического метаболизма с одной стороны, или повышении наружной концентрации ионов калия - с другой. Это означает, что интенсивность синтеза целлюлозы зависит не от величины мембранного потенциала, а от способа воздействия на эту величину (через метаболическую или диффузионную компоненты). Это означает также, что уровень мембранного потенциала не является узким звеном или лимитирующим фактором синтеза целлюлозы в рассмотренных сравнительных опытах, и что прямая потенциалозависимость активности мембраносвязанной целлюлозосинтетазы, скорее всего, отсутствует. По результатам наших опытов важно также отметить, что в то время как выявляется определенная связь с механизмами формирования электрического напряжения на плазмалемме для процесса синтеза целлюлозы, устойчивой связи синтеза полисахаридов матрикса клеточной стенки с электрическим напряжением на плазмалемме не просматривается или нет вообще (табл. 1, 2). Причина, по-видимому, в том, что матриксные полисахариды синтезируются внутри цитоплазмы и напряжение на плазмалемме, а также механизмы, работающие на его формирование, не оказывают прямого влияния на синтез полисахаридов матрикса. Однако не исключено, что на синтез полисахаридов матрикса может оказывать влияние изменение кальциевого статуса среды выращивания проростков (см. табл. 1). Причем это влияние может быть неодинаковым. Так у пшеницы в варианте с ЭДТА (пониженное содержание кальция) наблюдалась интенсификация синтеза пектиновых веществ при уменьшении синтеза других полисахаридов клеточных стенок, в то время как у льна интенсифицировался синтез кислоторастворимых гемицеллюлоз. Т.е., по-видимому, обычно наблюдаемая в норме синхронность синтеза различных полисахаридов клеточных стенок может быть нарушена изменениями в кальциевом обмене. Интересно, и это отметим особо, что под влиянием изменений наружной концентрации К+ в корнях пшеницы изменялась интенсивность синтеза целлюлозы, а синтез других полисахаридов клеточных стенок оставался практически на том же уровне (см. табл. 2). В своей монографии Тарчевский (Тарчевский, Марченко, 1985, стр.60) специально отмечает лишь два случая, когда исследователям удавалось достигать десинхронизации синтеза целлюлозы и гемицеллюлоз с помощью варьирования концентрации Mg2+ и УДФГ, а также с помощью модификации белковых компонентов плазмалеммы азотнокислым свинцом. Наши опыты свидетельствуют о том, что отмечаемая десинхронизация, по-видимому, более широко распространенное явление и зависит от ионного статуса растений. Этот факт объясняет вариации состава клеточных стенок, вызванные сильными изменениями условий существования растений, и создает некоторые предпосылки для возможности управления составом клеточных стенок а, следовательно, технологическими качествами промышленно важного растительного сырья.
