Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИБ СВОЙСТВА,ЛОКАЛИЗАВДЯ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ КАРБОАНГЙДРАЗЫ РАСТЕНИЙ
1.1. Распространение и физико-химические свойства карбоангйдразы растений 12
1.2. Локализация карбоангйдразы в клетках высших растений 15
1.3. Локализация карбоангйдразы в одноклеточных водорослях 27
1.4. Физиологическая роль карбоангйдразы в фотосинте-зирущей клетке 23
1.5. Регуляция карбоангидразной активности 32
1.5.1. Влияние света на карбоангидразную активность 32
1.5.2. Влияние концентрации 0 на карбоангидразную активность и фотосинтетические характеристики одноклеточных водорослей 34
1.6. Зависимость путей метаболизма углерода в фотосинте-
зирущей клетке от концентрации углекислоты. 38
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования ^б
2.2. Методы и условия культивирования водорослей,учет их фотосинтетической продуктивности
2.3. Схема проведения опытов «
2.4. Методы измерения интенсивности и световых кривых фотосинтеза 4-8
2.5. Методы дезинтеграции клеток водорослей 48
2.6. Методы фракционирования растворимых белков и нерастворимых клеточных компонентов 53
2.7. Определение активности карбоангйдразы и способы
ее расчета 55
2.8. Определение количества белка 56
2.9. Ингибиторный анализ 56
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ! АКТИВНОСТИ РАСТВОРИМОЙ ФОРШ КАРБОАНШДРАШ КЛЕТОК ХЛОРЕЛЛЫ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ С02
3.1 Динамика изменения активности мембранносвязанной и растворимой форм карбоангидразы клеток хлореллы., при изменении концентрации COg 57
3.2. Исследование углекислотной зависимости активности
растворимой формы карбоангидразы и интенсивности
фотосинтеза клеток хлореллы 59
3.3. Характеристика световых кривых фотосинтеза клеток хлореллы адаптированных к различным концентрациям 0(.... 63
3.4. Локализация растворимой ^-зависимой формы карбоангидразы в фотосинтезирущих клетках хлореллы 65
ГЛАВА 4. ИССЛВДОВАЕШ ЗАВИСИМОСТИ ИЦЦУКОДИ РАСТВОБЇМОЙ COg-ЗАВИСИМОЙ ФОРМЫ КАРБОАНІИДРАШ КЛЕТОК ХЛОРЕЛЛЫ ОТ ИНТЕНСИВНОСТИ СВЕТА И АКЇИВНОСТИ ЭТЦ ХЛОРОПЛАСТА
4.1. Зависимость индукции синтеза растворимой формы карбоангидразы клеток хлореллы от интенсивности света .71
4.2. Зависимость синтеза растворимой формы карбоангидразы
от степени ингибирования фотосинтеза диуроном 78
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИЦДУКЦИИ СИНТЕЗА СО^-ЗАВИСИМОЙ РАСТВОБЇМОЙ ФОРМЫ КАРБОАНГИДРАЗЫ КЛЕТОК ХЛОРЕЛЛЫ
5.1. Влияние я % на индукцию синтеза С0-зависимой формы карбоангидразы клеток хлореллы 82
5.2. Зависимость индукции растворимой формы карбоангидразы от соотношения концентрации 02/С02 в среде......^5
5.3. Эффект кратковременного действия С>2 на индукцию синтеза растворимой формы карбоангидразы клеток хлореллы 91
5.4. Влияние света на индукцию рКА кислородом 93
5.5. Исследование участия продуктов гликолатного пути метаболизма углерода в индукции синтеза СС^-зависимой растворимой формы карбоангидразы клеток хлореллы., 93
5.5.1. Влияние ингибиторов гликолатного пути на индукцию синтеза С02~зависимой растворимой формы карбоангидразы клеток хлореллы 95
5.5.2. Влияние ингибиторов гликолатного пути метаболизма на фотосинтез клеток хлореллы при различных концентрацияхСО?, .......100
5.5.3. Влияние экзогенных продуктов гликолатного пути на индукцию синтеза СОо-зависимой растворимой формы
карбоангидразы в клетках хлореллы ЮЗ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106
выводы га
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 116
- Распространение и физико-химические свойства карбоангйдразы растений
- Методы и условия культивирования водорослей,учет их фотосинтетической продуктивности
- Динамика изменения активности мембранносвязанной и растворимой форм карбоангидразы клеток хлореллы., при изменении концентрации COg
- Зависимость индукции синтеза растворимой формы карбоангидразы клеток хлореллы от интенсивности света
- Влияние я % на индукцию синтеза С0-зависимой формы карбоангидразы клеток хлореллы
Распространение и физико-химические свойства карбоангйдразы растений
Еще в 1936 году Бурр ( Burr ,1936) обращает внимание исследователей на возможное участие карбоангидразы (карбонатгидролиа-за КФ 4.2.1.1) в фотосинтезе. Позднее в 1939 году карбоангидра-за ( КА) открыта Нейшем ( Neisch t 1939) в листьях шпината. В настоящее время КА обнаружена практически у представителей всех систематических групп растений ( Косицин и др., І97ІД98І; Tsu-zuki et al. , 1982). Карбоангидразная активность обнаружена также в клетках многих видов фотосингезирующих микроводорослей. Наличие КА показано в клетках зеленых водорослей (Семененко, Ав-рамова и др., 1977, 1979; Пронина и др., I981а,I984 ; Hogetsgt et al.f 1979; Kimpel et al. ,1983; Miyachi et al. , 1983; Tsuzuki et al, 1983), синезеленых водорослей (Комарова и др., 1976; Фирус И др., 1982,1984; Dohler , 1974; Ingle et el. , 1976), а также в клетках фототрофных бактерий (Родова, Ивановский,! 977; Ивановский, Родова, 1977).
Свойства КА растений в настоящее время интенсивно изучаются вследствие всевозрастающего интереса к исследованию функциональной роли фермента и возможности- участия его в регуляции фотосинтеза. Следует заметить, что растительная КА значительно хуже исследована как в отношении молекулярного строения, так и функциональной значимости, по сравнению с КА животного происхождения.
Успехи в изучений молекулярных свойств и структуры КА растений достигнуты в последнее время благодаря получению высокоочи-щенных препаратов фермента. В очищенном виде КА получена из шпината, томата, гороха и некоторых других растений (Строугени-те, 1972; Косицин, Халидова, 1974; Комарова , Доман и др.,1981; Алиев, Гулиев, 1983, 1984; ТоЪ1п , 1970; Pocker et al. , 1973,1978; Kandell et al. ,1978).
Растительная КА, также как и КА животного происхождения, относится к цинксодержащим металлоферментам ( Косицин и др.,1971, 1981; Комарова и др., 1981; Шпак,1980; Фрайфелдер, 1980; Мецлер, 1980; Ohki ,1976,1978; Basionny et al. Д976). Под действием комплексообразователей растительная КА теряет атом цинка, однако отличии от КА животных, не реактивируется после удаления комплексообразователей или при добавлении избытка цинка (Косицин и др., 1971, 1981). Исключением является КА красной водоросли Sar-raticardia maxima , которая совершенно не отличается в этом отношении от КА животного происхождения и полностью восстанавливает свою активность после удаления комплексообразователей ( Okazaki , 1973).
Исследование физико-химических свойств КА растений показало, что фермент содержит I2S Н-групп и большое количество цистеино-вых остатков, что не свойственно для КА животных ( Kisielet al. ,1972; Kandell et al. , 1978; Sankaranarayana et al . , 1981). Есть основания полагать, что это свойство является общим для всех растительных КА (Косицин и др., 1981).Различие в аминокислотном составе растительной и животной КА может быть связано со значительными различиями в структуре молекул ферментов, в том числе и их активных центров. Вероятно, именно с этим связана и большая чувствительность КА растении к кислотности среды(Комарова, Терехова и др., 1976; Пронина ,1982; Kachru et al. , 1974). Показано, что при низких значениях рН молекула фермента необра -14-тимо теряет атом цинка и инактивируется, в отличие от КА животного происхождения ( Косицин и др., 1979,1981). Выход атома цинка из молекулы фермента, по-видимому, сопровождается необратимыми изменениями в структуре молекулы КА.
Растительная КА, в отличии от КА животных, обладает высокой молекулярной массой, около 180000 дальтон ( ToMn , 1970). Для некоторых растений, однако, установлены более высокие значения молекулярных маес,например,для гороха - 194000 ( ТоМп ,1969, 1970), бобов - 270000 (Комарова, Доман и др., 1981), нута - около 210000 дальтон ( Алиев, Гулиев и др., 1983,1984).
Большинство исследователей разделяет точку зрения Тобина ( Tobin ,1970), который считает, что КА растительного происхождения является гексамером ,состоящим из одинаковых мономеров с молекулярной массой около 30000, близкой к молекулярной массе мономерной КА животных. Вместе с тем указывается, что гексамерная структура молекулы характерна для КА двудольных растений, в то время как фермент однодольных является мономером ( Косицин и др., 1981; Atkins et al. f 1972) с молекулярной массой около 42-45000 дальтон ( Atkins et al. ,1972). Гексамерная структура КА двудольных растений не является прочным образованием и молекула фермента достаточно легко диссоциирует. Так, в присутствии додецилсульфата натрия, КА легко диссоциирует на субъединицы и можно получить смесь всех возможных состояний полимера от мономера до гексамера ( Pocker et al.,1973, 1978.,).
Методы и условия культивирования водорослей,учет их фотосинтетической продуктивности
Объектом исследования служила термофильная одноклеточная зеленая водоросль ohioreiia sp.K, физиолого-биохимическяе свойства которой хорошо изучены (Семененко, Владимирова и др., 1966а,б)» в том числе в отношении свойств ее карбоангидразной системы( Семененко, Аврамова и др., 1977,1979; Пронина, Аврамова и др. ,1981; Пронина, Семененко,1984). Штамгл получен из коллекции штаммов и мутантов одноклеточных водорослей ИФР АН СССР, 2.2. Методы и условия культивирования водорослей, учет их Фотосинтетической продуктивности
Водоросли выращивали стерильно, в условиях интенсивной культуры (Семненко, Владимирова,!962) в накопительном д проточном режимах, при круглосуточном освещении и непрерывном барбатирова-нии суспензий газовоздушной смесью с 2 и 0,03$ С02» В качестве питательной среды была использована среда Тамия с нитратным азотом ( Владимирова, Семененко, 1962).
Водоросли культивировали в различного типа лабораторных установках, обеспечивающих разную степень интенсификации их роста и возможность варьирования физиологически значимых параметров в широком диапазоне ( условия освещенности, температуры и др.).
Культивирование водорослей проводили:
1. В стеклянных сосудах с плоскопараллельными стенками (Ди-лов, Семененко и др., 1969) при двустороннем освещений люминесцентными лампами
2. В плоскостенном реакторе из органического стекла, при одностороннем освещений ксеноновой лампой ДКСТВ-6000. Установка, в которой регулировалась и непрерывно регистрировалась температура суспензии, плотность культуры, рН среды, скорость подачи газовоздушной смеси, концентрация СС была использована для выращивания культуры в проточном режиме со стабилизированной плотностью суспензии (Семененко, Владимирова и др., 1966; Цоглин, Семененко и др., 1966).
3. В установке для интенсивного взращивания водорослей(УИВ) при освещении дуговой ксеноновой лампой ДКСТВ-6000 (Семененко, Ничипорович, 1962). Размещением культуральных сосудов на различном расстоянии от источника света достигались необходимые значения освещенностей при выращивании культуры.
Скорость роста культуры учитывали прямым подсчетом числа клеток под микроскопом в камере Горяева и по оптической плотности культуры (Владимирова, Семененко, 1962).
Прддуктивность водорослей определяли по накоплению сухой массы спектрофотометрически по поглощению света при 750 нм на предварительно проградуированном фотокалориметре " Spekoi ". В опытах была использована культура на линейной стадии роста, плотностью 100 млн/мл.
Динамика изменения активности мембранносвязанной и растворимой форм карбоангидразы клеток хлореллы., при изменении концентрации COg
В адаптации фотосингезирующих клеток хлореллы к условиям угленислотного лимитирования , особенно при насыщающих фотосинтез интенсивностях света, определяющая роль может принадлежать СОз-зависймой рКА, активность которой ,как было показано в 1-ой главе существенно возрастает при низких концентрациях С02. Однако, детальная зависимость этого фермента от концентрации С02 ( с получением углекислотной кривой) оставалась не изученнойІ В связи с этим представляло несомненный интерес исследование зависимости адаптивных изменений активности С02-зависимой растворимой формы КА клеток хлореллы от концентрации С02 в достаточно широком диапазоне ее концентраций и сопоставление углекислотной кривой активности фермента и углекислотной кривой фотосинтеза. 3,1. Динамика изменения активности мембранносвязанной и растворимой ФОРМ карбоангидразы клеток хлореллы при изменении концентрации С02
При выращивании фотосинтезирущих клеток хлореллы в оптимальных условиях, при насыщающих фотосинтез концентрациях С02 (2#),карбоангидразная система представлена только одной формой фермента- мсКА, обладающей достаточно высокой активностью(рис.9), в то время как активность СО зависимой рКА имеет очень низкие значения или практически не обнаруживается. Снижение концентрации С02 до 0,03$ (барбо.тирование суспензии водорослей воздухом), приводит к значительному увеличению активности рКА при сохранении активности мсКА на постоянном уровне. Такое распределение КА-активности в клетках хлореллы было обнаружено ранее Семе ненко, с соавторами,( Семененко, Аврамова и др., 1977;1979; Пронина, Аврамова и др., 1981; Пронина, Семененко, 1984). Существенно,что обратное повышение концентрации С0 в газовоздушной смеси приводит, как видно из рис.9,к обратимому снижению активности рКА до исходного уровня ( через 5-6 часов).
Такой типичный активный характер изменения активности С0-зависимой рКА клеток хлореллы служит веским аргументом в пользу широко обсуждаемой в литературе ( Глава I) „ гипотезы, об участии КА в облегчении внутриклеточного транспорта неорганического углерода при низких его концентрациях, когда, вследствии возрастания диффузионных сопротивлений, скорость поступления СО? в клетку начинает лимитировать фотосинтез. Вместе с тем, из рис.9 отчетливо видно,что в процессе адаптации клеток к низким концентрациям С02 принимает участие не вообще КА, а только одна из ее форм, именно растворимая форма КА.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при адаптации фотосинтезирующих клеток хлореллы к условиям углекислотного лимитирования наблюдается существенное возрастание активности СС -зависимой рКА, в то время как активность мсКА практически не зависит от содержания СС 2 в среде выращивания водорослей. Такой характер зависимости изменения активности рКА может указывать на участие этого фермента в механизмах облегчения транспорта неорганического углерода в фотосинтезирувдую клетку при адаптации . к условиям углекислотного лимитирования,
Зависимость индукции синтеза растворимой формы карбоангидразы клеток хлореллы от интенсивности света
Для изучения зависимости индукции синтеза рКА. клеток хлореллы от интенсивности света водоросли выращивали при двустороннем освещении люминесцентными лампами и непрерывном барботировании газовоздушной смесью с 2% COg. По достижении плотности клеток около 100 млн/мл концентрацию СОз снижали до естественного содержания двуокиси углерода в воздухе ( 0,03$).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при низких концентрациях углекислоты в среде синтез фермента наблюдается только на свету, в то время как в темноте при тех же условиях углекислотного режима выращивания водорослей, клетки Chioreiia не индуцируют рКА ( рис.14). При этом следует обратить особое внимание на то, что увеличение интенсивности света до 100 Вт/м вызывает многократное возрастание активности СОз-зависимой рКА.
Светоиндуцированное увеличение активности СОз-зависимой рКА клеток хлореллы может быть связано с прямым действием света на активность фермента так и может быть опосредовано через изменение количества фермента, затрагивая механизмы дополнительного синтеза.
Как видно из кривой 3 ( рис.14\ внесение органеллспецифя-ческого ингибитора белкового синтеза - циклогексимида полностью подавляет светозависимое увеличение активности рКА. Это указывает на то, что возрастание активности С02-зависимой рКА при увеличении интенсивности света связано с дополнительным синтезом фермента de novo на 80 s рибосомах, а не с активапдей молекулы рКА, синтезированной на низкой освещенности ,что согласуется с данными других авторов (Пронина,Аврамова и др., 1981).
Светозависимое увеличение активности рКА в условіях низкого содержания СС 2 в среде выращивания водорослей может являться убедительным доказательством необходимости этого фермента для участия в процессе обеспечения фотосинтезирущей клетки неорганическим углеродом ,когда, вследствии возрастания скорости фиксации С02» возрастает необходимость активации транспорта углекислоты в клетку.
Вместе с тем представленные выше данные дают основание предполагать, что количество синтезированного фермента в условиях углекислотного ограничения определяется ( задается каким-то образом) интенсивностью света, т.е. энергообеспеченностью фотосинте -зирующей клетки. В связи с этим особый интерес представляло изучение зависимости уровня накопления рКА от интенсивности света в широком диапазоне изменения освещенности водорослей. Следует заметить, что этот вопрос представляет еще и самостоятельный интерес в связи с тем, что зависимость предела накопления рКА от интенсивности света изучается впервые.
Влияние на индукцию синтеза зависимой формы карбоангидразы клеток хлореллы
Ранее нами было показано, что при выращивании водорослей в оптимальных условиях, при насыщающих фотосинтез концентрациях 0(, клетки хлореллы не синтезируют рКА ( глава 3). Однако,снижение концентрации ( до 0,03$ приводит к индукции синтеза С02 зависимой рКА. Эти данные могли бы служить основанием для предположения о том, что низкое содержание углекислоты в среде индуцирует синтез этого фермента. Однако, как было показано нами ранее ( глава 4), синтез рКА при низких концентрациях ( наблюдается только на свету ,тогда как снижение содержания углекислоты в темноте не приводит к появлению рКА в клетке. Такие данные свидетельствуют о том, что молекула С0 или изменение концентрации двуокиси углерода не принимает непосредственного участия в индукции синтеза С02 зависимой рКА,
Учитывая, что при изменении концентрации ( изменяется относительное содержание и других компонентов газовой смеси, в частности,такого важного в физиологическом отношении фактора, как 02, для выяснения механизмов индукции синтеза С02-зависимой рКА представляло интерес изучить зависимость индукции этого фермента от состава газовой смеси и,прежде всего,от содержания кислорода.
Водоросли выращивали в оптимальных условиях при постоянном барбатировании суспензии газовоздушной смесью с 2% С02. По достижении плотности 100 млн/мл клетки хлореллы отмывали от куль-туральной жидкости и переносили на свободную от 02 и С02 питательную среду Тамия, которую предварительно в течении I часа продували азотом, с тем чтобы исключить побочное действие растворенных в среде углекислоты и кислорода на индукцию фермента. После ресуспендирования в свежей питательной среде водоросли продолжали барботировать азотом около 60 минут. По истечении этого времени осуществляли барботаж суспензии газовыми смесями различного состава при оптимальных условиях для роста культуры: на свету, при оптимальной температуре на среде Тамия.
Проведенные исследования обнаружили неожиданные и чрезвычайно интересные закономерности,указывающие на важную роль кислорода в механизмах индукции С02-зависимой рКА в фотосинтезирующих клетках хлореллы. Оказалось, как видно из рис.19, что в атмосфере азота клетки хлореллы не синтезируют рКА ( кривая 1),так же как и при выращивании водорослей в условиях высокого (2%) содержания в воздухе С02( кривая 2). Барбатирование суспензии клеток хлореллы воздухом с естественной концентрацией углекислоты 0,03$ приводит к обычному эффекту индукций фермента (кривая 4). Однако, как видно из кривой 5, синтез рКА наблюдается также в клетках хлореллы, которые продувались воздухом без С02(предварительно пропущенным через насыщенный раствор щелочи т.е. в атмосфере азота с 21$ кислорода.
