Содержание к диссертации
Введение
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Генетическая система пластид и ее функции 9
1.2. Регуляция светом процессов транскрипции и трансляции в хлоропластах ..... 25
1.3. Влияние цитокинина на дифференциацию хлоропластов 31
2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
2.1. Постановка опытов 45
2.2. Определение числа клеток в семядолях .... 46
2.3. Определение содержания пигментов 47
2.4. Определение содержания РНК 48
2.5. Выделение нуклеиновых кислот 49
2.6. Фракционирование нуклеиновых кислот 50
2.7. Расчет количества пластидных и цитоплазмати-ческих рРНК 50
2.8. Включение [31-уридина в РНК семядолей .... тыквы , 51
2.9. Выделение интактных хлоропластов 53
2.10.Включение уридина в РНК изолированных хлоропластов 54
2.11 Выделение осмотически разрушенных хлоропластов и их очистка в градиенте плотности
сахарозы 55
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..... 56
3.1. Влияние фитогормонов и фузикокцина на образование пигментов в изолированных семядолях
3.1.1. Действие цитокинина на накопление хлорофилла и каротиноидов ........... 56
3.1.2. Сравнительное исследование влияния фузикокцина и цитокинина на образование пигментов 63
3.1.3. Влияние КСІ и его сочетания с цитокинином и фузикокцином на образование хлорофилла
и каротиноидов 70
3.1.4. Влияние абсцизовой кислоты на образование хлорофилла и ее взаимодействие с цито
кинином в регуляции этого процесса .... 76
3.2. Влияние цитокинина, абсцизовой кислоты и фузи кокцина на синтез РНК в изолированных семядолях тыквы 83
3.2.1. Влияние 6-бензиламинопурина на синтез рибо-сомальных РНК 83
3.2.2. Влияние абсцизовой кислоты и ее сочетания с цитокинином на синтез рРНК в изолированных семядолях тыквы 103
3.2.3. Влияние фузикокцина на синтез FHK в изолированных семядолях тыквы и сравнение его
с действием цитокинина ..... 115
3.3. Система синтеза ШК интактными хлоропластами и ее использование для изучения действия на хлоропласты фитогормонов 124
3.3.1. Выбор среды выделения и инкубации хлоро-
пластов 124
3.3.2. Характеристика синтеза РНК в интактных изолированных хлоропластах 128
3.3.3. Анализ продуктов синтеза РНК интактны-ми хлоропластами, выделенными из семядолей тыквы 141
3.3.4. Использование суспензии интактных хлоро-пластов для изучения действия фитогормо-
нов 147
3,3.4.1.Влияние 6-бензиламинопурина на синтез РНК в изолированных хлоропластах 147
3.3.4,2.Влияние АБК на синтез РНК в изолированных интактных хлоропластах 158
3.3.4.3.Влияние фузикокцина на синтез РНК в изолированных хлоропластах 160
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 169
ВЫВОДЫ 178
ЛИТЕРАТУРА 181
- Генетическая система пластид и ее функции
- Определение числа клеток в семядолях
- Влияние фитогормонов и фузикокцина на образование пигментов в изолированных семядолях
Генетическая система пластид и ее функции
В настоящее время четко показано, что в пластидах растительной клетки имеется собственная генетическая система, отличная от генома ядра.
На долю хлоропластной ДНК в клетке высших растений приходится 5-10% суммарной ДНК, что составляет около I0""1 мг.
ДНК хлоропластов представляет собой кольцевую двунитевую молекулу ( Tewari et al. Д977),размер которой значительно отличается у разных организмов (Hobom et al., 1977). В хлоропластах клеток высших растений, папоротников и Euglena длина молекул р. ДНК составляет 40-45 мкм и эквивалентна молекулярной массе 90x10 дальтон (Hobom et al., 1977; Herrmann, Possingham, 1980). Bo всех исследованных высших растениях содержание ГЦ-пар в пластид-ной ДНК составляет примерно 37,5% (а в ДНК ядра 39,4%) и плавучая плотность молекул равна 1 697 г/см3 (Ellis, 1976).В зависимости от вида растения ядерная ДНК имеет меньшую,большую или сходную с хлоропластной ДНК плавучую плотность (Tewari,1971). В противоположность ДНК ядра пластидная ДНК не содержит 5-метилцитозина (Ellis, 1976) и не связана с гистонами (Ris,Plaut, 1962).Другим характерным свойством хлоропластной ДНК является ее быстрая ренату-рация после тепловой или щелочной денатурации,что может служить критерием для отделения ее от ядерной ДНК (Tewari,Wildman,I966).
Таким образом, ДНК пластид значительно отличается по ряду физикохимических свойств от ядерной ДНК.
Одной из особенностей организации пластидного генома (плас-тома) является высокая степень его повторения.Количество молекул ДНК в органелле в зависимости от растительного объекта, размера пластид и стадии их развития может составлять от I до 200 копий .
( Herrmann et al., I974;I975; Herrmann, Poseingham, 1980). Молекулы пластидной ДНК одного вида растения одинаковы по размеру, составу оснований и их последовательности и содержат, следовательно, одну и ту же генетическую информацию ( Herrmann et al.,I975; Kolodner,TewariJ975; Herrmann, Possingliam; .1980).
Хлоропластная ДНК связана с мембранами тилакоидов пластид (Филиппович и др.,1970; Herrmann et al., 1974; Rose, Lindbeck, 1982) и ее репликация осуществляется с помощью расположенного в мембране и ассоциированного с ДНК ферментного комплекса ( Spencer, Whitfeld, 1967а; Possingham, Rose, 1977). Прямым доказательством локализации синтеза ДНК внутри пластид является способность изолированных хлоропластов включать радиоактивные предшественники в ДНК органелл (эвглена, Scott et al.,1968; шпинат, Spencer, Whitfeld, 1967a). Однако, информация для синтеза ДНК-полимеразы пластид, по-видимому, содержится в геноме ядра ( Surzycki, 1969).
Как было показано у Chlamydomonas ( Chiang, Sueoka,I967) и Euglena ( Manning, Richards, 1972), репликация пластидной и ядерной ДНК происходит на разных стадиях клеточного цикла, причем удвоение ДНК пластид связано со световым периодом роста клеток. У шпината и пшеницы пластидная ДНК синтезируется как на свету, так и в темноте и особенно во время роста клеток, когда происходит деление пластид ( Possingham, Rose, 1976; Boffey et al.J979).
Определение числа клеток в семядолях
Семена тыквы замачивали в течение 5 часов в воде и проращивали на влажной фильтровальной бумаге в темноте при 28С в кондиционированной камере. Прирост сырого веса семядоли на проростке происходил за счет увеличения размеров клеток (Микулович,1978) и их числа (табл.1,А).
Как видно из таблицы 1(A) деление клеток в семядолях проростка происходит в течение первых 4-х дней прорастания семян в темноте, а затем прекращается. Через 96 часов прорастания семядоли были свободны от семянной кожуры и проросток имел развитый ги-покотиль. На этой стадии при слабом зеленом свете этиолированные семядоли отрезали от осевых частей проростка и использовали в двух различных постановках опытов.
I. Изолированные семядоли выдерживали 24 часа в темноте на воде для повышения их чувствительности к экзогенным фитогормонам (Рибицка и др.,1977). В течение этого времени число клеток в семядолях практически не изменялось (табл.1,Б). Через 24 часа часть
Таблица I Изменение числа клеток в семядолях проростков тыквы и в изолированных семядолях в течение 24 часов роста в темноте на воде
А возраст проростка (часы) 72 96 120 144
Число клеток в I семядоле х Ю"3 141,6 2,8 171,6+8,9 237,5+П 239,1+П 251,6+13
Б Семядоли 96 час. Семядоли 96 час. про-проростков ростков + 24 часаизоляции
Число клеток в I семядоле 254,1+22 282,5+7,3
семядолей переносили на растворы исследуемых веществ, а другие на дистилированную воду и инкубировали в темноте или на свету (ЛБ-40, 1300 люкс) при 28С. Через определённые интервалы времени семядоли отбирали для анализа.
П. Изолированные семядоли выдерживали в темноте на дистиллированной воде 6 часов, после чего часть семядолей переносили на растворы исследуемых веществ и инкубировали 18 часов в темноте и 3 часа на свету (ЛБ-40, 1300 люкс).
В каждую чашку Петри наливали по 10 мл раствора и раскладывали по 20 семядолей.
2.2. Определение числа клеток в семядолях проводили методом Брауна и Риклес (Brown, Rickless,i949 ) I семядолю мацерировали в 10 мл 5% раствора хромового ангидрида, встряхивая в течение 24 часов на качалке при 28С и затем тщательно перемешивая. Клетки считали под световым микроскопом с увеличением ХІ00 в камере Фукс-Розенталя и их число в семядоле определяли по формулемуле: число клеток _ кООП . у . X ГТТР в семядоле - оиии х где 5000 - постоянный коэффициент для пересчета объема раствора, заполняющего I сетку камеры, в мл,
v - объем (мл) раствора СгО$ взятого для мацерации семядоли,
х - среднее число клеток в I квадрате сетки.
В кавдом варианте счет клеток проводили в б биологических и 2 химических повторностях. Рост семядолей определяли, измеряя их сырой вес.
Влияние фитогормонов и фузикокцина на образование пигментов в изолированных семядолях
Образование хлорофилла и каротиноидов в листьях растений существенно изменяется в ответ на воздействие внешней среды С Sun qyist et ai., 1980). Эти изменения, часто обнаруживаемые визуально, можно легко и быстро измерить сравнительно простыми методами. Локализация данных пигментов внутри пластид позволяет судить по изменению их накопления о влиянии различных экзогенных факторов на биохимическую дифференциацию хлоропластов. Мы использовали этот показатель для характеристики реакции пластид в изолированных семядолях тыквы на экзогенные фитогормоны.
Действие штокинина на накопление хлорофилла и каротиноидов
В ходе нормального развития проростков тыквы семядоли выносятся на поверхность земли и на ранних стадиях роста растения служат единственным фотосинтезирующим органом подобно настоящим листьям ( Lott a,bJ970). Способность к формированию фотосинтетического аппарата сохраняется у семядолей и после отделения их от остальных частей проростка и одновременно с этим изолированные семядоли приобретают способность реагировать на экзогенный цитокинин (Banerji, Laloraya, 1967; Микулович и др., 1971; Каравайко и др.,1975). Ранее было показано, что быстрота и характер ответной реакции изучаемой нами системы зависит от физиологического состояния семядолей в момент изоляции их от проростка и помещения на раствор 6-бензиламинопурина (БАТІ) (Рибицка и др., 1977; Микулович, 1978). Поэтому прежде всего необходимо было охарактеризовать ответную реакцию семядолей на ЦАП при используемой нами постановке опытов.
Определение концентрационной зависимости действия БАЛ на образование хлорофилла показало, что наибольший стимулирующий —5 эффект наблюдается при концентрации фитогормона 5 х ЮМ (рис.2). На основании этих данных во всех опытах мы использова ли 5»10 М раствор 6-бензиламинопурина.
Исследование накопления хлорофилла в динамике показало, что при переносе семядолей на свет они медленно зеленели в первые 3 часа освещения, затем скорость образования в них хлорофилла быстро возрастала и на протяжении следующих 18 часов оставалась линейной (рис.3).
В течение первых 3 часов роста семядолей на свету БАЛ не влиял на интенсивность образования пигмента, но при увеличении продолжительности инкубации значительно стимулировал этот процесс, причем скорость его была линейна до 12 часов и сильно возрастала при более длительном воздействии цитокинином (рис.3). Следовательно, действие БАЛ на накопление хлорофилла при одновременном предоставлении семядолям цитокинина и света проявлялось после лаг-периода, составляющего менее 6 часов.
Прединкубация семядолей 4-дневных проростков в темноте на растворе БАД в течение 12, 18 или 24 часов индуцирует образование хлорофилла в первые 3 часа последующего освещения, то есть устраняет лаг-период (рис.4). Интенсивность накопления пигмента на свету увеличивалась пропорционально продолжительности темновой прединкубации семядолей с БАЛ. Результаты этих опытов позволяют предполагать, что действие БАЛ на накопление хлорофилла начинается на ранних стадиях биосинтеза пигмента, идущих без участия света. Аналогичные данные были получены в работах других авторов при использовании изолированных семядолей или листьев интактных растений (Fletcher et al., 1973; Ford et al., 1979; Naito et al., 1980a, Клячко и др.,І98І).
