Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2. Рибулозобисфосфаткарбоксилаза.
2.1. Общая характеристика фермента
2.2. Регуляция активности РБФК
2.3. Контроль содержания РБФК в клетках 19
3. Гормональная регуляция дифференциации пластид.
4. Изолированные семядоли тыквы как модельная система для изучения гормональной регуляции синтеза белка 44
III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Модельная система и постановка физиологических экспериментов 50
2. Обработка семядолей для последующего анализа РБФК 51
3. Измерение концентрации белка 52
4. Определение карбоксилазной активности РБФК 52
5. Электрофоретический анализ белков 55
6. Выделение и очистка РБФК из растений тыквы . 55
7. Получение субъединиц РБФК 56
8. Получение специфических антисывороток 56
9. Измерение содержания белка РБФК 59
10. Введение метки в белки семядолей in vivo 60
11. Измерение скорости включения С-аминокислот в полипептиды РБФК и в суммарный растворимый белок семядолей 52
12. Вариабельность анализов 66
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Активация роста изолированных семядолей тыквы цитокинином 68
2. Влияние цитокинина на активность РБФК 71
3. Выделение и очистка РБФК из листьев тыквы 79
4. Увеличение под действием цитокинина содержания белка РБФК 97
5. Анализ влияния бензиладенина на синтез полипептидов РБФК ЮЗ
5.1. Подавление гормоноиндуцированного роста содержания РБФК циклогексимидом 105
5.2. Стимуляция цитокинином включения меченых аминокислот в полипептиды РБФК 106
5.3. Влияние бензиладенина на поступление аминокислот в клетки семядолей III
5.4. Сравнительный анализ активации цитокинином синтеза полипептидов РБФК и суммарного водорастворимого белка 112
5.5. Биосинтез полипептидов РБФК и формирование функционального фермента в семядолях,инкубируемых с бензила де нином 115
6. Изменение скорости деградации белка - один из возможных путей контроля содержания РБФК в клетках семядолей тыквы 123
7. Зависимость формирования РБФК от ингибиторов трансляции 127
8. Зависимость шзванного цитокинином роста актив-ностиРБФК от транскрипционных процессов ІЗІ
9. Влияние фузикокцина на активность и содержание
РБФК в изолированных семядолях тыквы 136
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 141
VI. В Ы В 0 Д Ы 146
Список литературы 147
- Рибулозобисфосфаткарбоксилаза.
- Модельная система и постановка физиологических экспериментов
- Активация роста изолированных семядолей тыквы цитокинином
Введение к работе
Характерной чертой современной биологии является возрастающий интерес исследователей к изучению биологической саморегуляции, в том числе механизмов регуляции физиологических процессов в растениях (Курсанов,1972).
К числу наиболее важных систем, осуществляющих контроль над различными сторонами жизнедеятельности растений, относится гормональная система (Чайлахян,1964-; Бутенко,1964; Кулаева, 1973; Кефели,1974; Муромцев,1979; Поле вой,Саламатова,1977; Гамбург,1976; Moore, 1979), важное место в которой занимают цитокинины (Кулаева,1967,1973). Гормоны этого типа, подобно другим фитогормонам, оказывают влияние на синтез белков-ферментов (Кулаева и др.,1976; Кулаева,1982).
Интересной и перспективной во многих отношениях системой для изучения регуляции цитокининами синтеза белка может служить биосинтез рибулозобисфосфаткарбоксилазы (РБФК). Особенности биогенеза и важное функциональное значение этого фермента ставят его в особое положение среди растительных белков.
РБФК является олигомерным белком; составляющие его субъединицы кодируются двумя геномами клеток - ядерным и хло-ропластным - и синтезируются, соответственно, в цитоплазме и в хлоропластах ( Ellis, 1981). Сборка белка - олигомера происходит в хлоропластах, где и локализуется этот фермент, катализирующий ключевую реакцию цикла Кальвина. Биосинтез РБФК требует координированного взаимодействия двух геномов, двух белоксинтезирующих аппаратов клетки и представляет собой чрезвычайно интересную модельную систему для изучения регу- - 5 ~ ляции, в том числе и гормональной, кооперативной экспрессии ядерного и пластидного геномов.
Способность цитокининов увеличивать активность РБФК впервые была обнаружена Файерабендом на этиолированных интакт-
НЫХ ИЛИ ЛИШеННЫХ Корней проростках РЖИ ( Peierabend, 1969,
1970) и затем неоднократно отмечалась для различных чувствительных к экзогенному цитокинину объектов (Романко и др.,1976; Trehame et al., 1970; Harvey et al., 1974), в ТОМ числе изолированных семядолей тыквы (Хохлова и др.,1978). Файерабенд и де Боер показали, что цитокинин вызывает не только стимуляцию активности РБФК, но и увеличение содержания этого белка в клетках ( Peierabend, de Boer, 1978).
Вместе с тем, оставалось неясным, происходит ли это за счет усиления синтеза или задержки распада фермента. Не было выяснено, влияет ли гормон на активность уже имеющихся в клетках молекул фермента.
В связи с этим, цель данной работы состояла в исследовании путей гормонального контроля активности РБФК в растениях. В качестве объекта для изучения этого вопроса были выбраны высокочувствительные к цитокинину изолированные семядоли тыквы, у которых данный фитогормон вызывает резкое увеличение активности РБФК (Хохлова и др.,1978).
В задачу работы входило следующее: очистка РБФК из растений тыквы и получение моноспецифической антисыворотки против этого белка для его количественного анализа с помощью иммунохимических методов; сравнительное изучение динамики развития активности РБФК и изменения содержания этого белка в изолированных семя- - б - долях тыквы в ответ на их обработку цитокинином;
3) исследование влияния цитокинина на скорость синтеза и деградации РБФК;
4-) изучение действия ингибиторов синтеза белка и РНК на развитие активности и синтез РБФК;
5) сравнительное изучение влияния на синтез РБФК цитокинина И токсина гриба Fusicoccum amygdali Del. фузикок-цина с целью выяснения возможности участия мембраносвязанных процессов в гормональной регуляции активности РБФК.
Б результате проведенной работы из листьев тыквы впервые была выделена и очищена до электрофоретически и иммуноло-гически гомогенного состояния рибулозобисфосфаткарбоксилаза. Против этого белка была получена моноспецифичная антисыворотка, использованная для количественного определения белка РБФК в изолированных семядолях тыквы. Впервые проведенное одновременное исследование динамики изменения карбоксилазной активности РБФК, накопления белка фермента и скорости синтеза полипептидов РБФК в изолированных семядолях тыквы позволило заключить, что цитокинин стимулирует в темноте синтез РБФК в семядолях, не вызывая активации фермента в их клетках. Стимуляция синтеза РБФК проявляется уже в первые часы действия гормона и приводит к линейному росту активности и содержания фермента в семядолых. Использование специфических ингибиторов синтеза РБФК и белка показало, что регуляция цитокинином новообразования РБФК затрагивает синтез обоих типов субъединиц этого белка-олигомера и зависит от транскрипции. Судя по сходному с действием цитокинина влиянию фузикокцина на активность и содержание РБФК, в гормональном контроле активности этого фермента в клетках семядолей могут участвовать и процессы, связанные с мембранами.
Рибулозобисфосфаткарбоксилаза
Рибулозобисфосфаткарбоксилазе (РБФК) принадлежит исключительно важная роль в фотосинтетической фиксации углерода. В отличие от ряда других ферментов цикла Кальвина, РБФК, катализирующая первую и необратимую реакцию, является ферментом, лимитирующим скорость всего цикла. В ряде работ предполагается, что увеличение активности этого фермента в клетках может привести к увеличению скорости фотосинтеза (Андреева и др.,1972,1983; Семененко и др.,1972,1976).
Причинная связь между этими параметрами не установлена, однако во многих работах продемонстрирована корреляция между активностью РБФК в экстрактах и скоростью фиксации углекислоты. Так, например, увеличение интенсивности света при выращивании растений приводит к росту активности РБФК без изменения концентрации фермента ( Perchorowicz et al,,1980, 1981) или же через увеличение содержания этого белка в клетках и вместе с тем - к повышению интенсивности фотосинтеза ( Bjorkman, 1968; Bowes et al., 1972; Семененко и др.,1976). В листьях, оставшихся после частичной дефолиации растений сои, увеличение скорости фотосинтеза сопровождается ростом содержания РБФК ( Wareing et al#» 1968). Индукция светом развития хлоропластов в проростках ржи и в клетках эвглены сопровождается увеличением содержания РБФК (Володарский и др., 1979; Чаянова и др.,1981) и скорости фотосинтетической ассимиляции СОр, причем оба процесса подавляются циклогексимидом (Freyssinet et al., 1980), то есть связаны с синтезом белка. Корреляция между активностью РБФЕ и скоростью фотосинтеза отмечается и во многих других ситуациях, например при поли-плоидизации растений ( Moiin et ai., 1982) и сохраняется в условиях снижения скорости фотосинтеза, например при недостатке азотного питания (Андреева,и др.,1972) или при старении листьев (Peterson et al., 1973; Feterson, Huffaker, 1975; Hall et al., 1978; Thomas et al.» 1978; Wittenbach, 1978; Gamp et al., 1982),
Связь между фотосинтетической функцией и активностью РБФК, очевидно, не является простой и активность этого фермента - не единственный фактор, лимитирующий интенсивность фотосинтеза, как это представляют в некоторых работах (Hail, 1971). Б определенных ситуациях, например, при высоких концентрациях СОр или в зрелых листьях скорость фотосинтеза ограничивается скоростью регенерации рибулозобисфосфата (Лайск,1983; Лайск, 0я,1974; Mott et al., 1983), тогда как при низких концентрациях COg или в развивающихся листьях - активностью РБФК.
Кроме того, РБФК - бифункциональный фермент, его альтернативная функция - участие в фотодыхании, где фермент выступает в качестве РБФ-оксигеназы (Bowes et al., 1971). Поскольку от баланса фотосинтеза и фотодыхания в значительной степени зависит продуктивность растений ( Zelitch, 1973), ведется поиск путей стимуляции карбоксилазной активности и инги-бирования оксигеназной функции РБФК. Рассматривается, например, возможность использования методов генной инженерии для создания форм РБФК с выключенной оксигеназной функцией ( Andersen et al., 1980),
Исследование механизмов регуляции активности фотосинте - 10 тических ферментов, а в первую очередь РБФК, имеет большое практическое значение. В условиях высокой культуры сельскохозяйственного производства одним из путей дальнейшего прироста продуктивности сельскохозяйственных растений наряду с созданием и селекцией форм с повышенной интенсивностью фотосинтеза может быть и целенаправленное воздействие на активность фотосинтетического аппарата. По-видимому, сейчас назрела необходимость в разработке таких подходов (Насыров,1982). Для изучения возможности рационального управления фотосинтетической деятельностью хлоропластов необходимо детальное исследование механизмов регуляции фотосинтетических процессов, в том числе функционирования РБФК.
Модельная система и постановка физиологических экспериментов
В качестве модельной системы для изучения действия ци-токинина на активность и синтез РБФК использовали изолированные семядоли тыквы.
Выбор объекта был продиктован, как уже отмечалось выше, высокой чувствительностью изолированных семядолей к экзогенному цитокинину ( Laloraya, Banerji, 1965; Курсанов И др., 1969), а также их способностью отвечать на гормон значительным увеличением активности РБФК (Хохлова и др.,1978). При этом высокое содержание запасных веществ в семядолях тыквы позволяло использовать их в длительных экспериментах, а инкубация изолированных семядолей в течение 1-2 дней на воде в темноте приводила к снижению содержания эндогенных цитокини-нов (Рибицка и др.,1977) и АБК (Кравяж и др.,1977 а,б) и, как следствие, к увеличению чувствительности объекта к экзогенному гормону.
В связи с необходимостью исключить действие света на активность и формирование РБФК, изучение гормональной регуляции этого фермента проводили на семядолях, которые находились во время опыта в темноте. При этом все манипуляции с семядолями вплоть до их фиксирования выполняли на слабом рассеянном зеленом свету, не влияющем на активность РБФК.
Семена тыквы ( с.реро L. , сорт Мозолеевская 4-9) проращивали на влажной фильтровальной бумаге в темноте при 28 в течение 96 часов, затем семядоли отрезали от осевых частей зародыша и инкубировали на воде в темноте 48 часов для истощения запаса эндогенных цитокининов. После этого от семядолей отделяли слой в 1-2 мм для удаления каллуса, который образовывался при длительной инкубации на поверхности среза семядоли и мог быть источником цитокининов. Выровненные по размеру семядоли помещали в чашки Петри с водой или раствором синтетического аналога природных цитокининов, обладающего высокой цитокининовой активностью, б-бензиламинопурина (БАП). В опытах использовалась концентрация БАП 10 мг/л (4,4.10"- М), оптимальная для роста семядолей и их позеленения (Курсанов и др., 1969; Микулович, 1978). Через определенные интервалы времени семядоли фиксировали в сухом льду.
Активация роста изолированных семядолей тыквы цитокинином
Все эксперименты по исследованию гормонального контроля активности РБФК проводили на семядолях, полученных из одной партии (6398) семян тыквы сорта Мозолеевская 49. Поскольку ранее в лаборатории было показано, что семядоли разных партий семян тыквы могут существенно различаться по своей реакции на фитогормоны (Курсанов и др.,1969) и поскольку рост семядолей является хорошим критерием их чувствительности к цитокинину (Микулович и др.,1971), начиная работу, мы считали целесообразным прежде всего охарактеризовать взятую нами партию семян по способности роста изолированных семядолей тыквы отвечать на синтетический аналог природных цитокининов - 6-бензиламино-пурин (БАП). Так как опыты по индукции цитокинином РБФК мы считали правильным проводить в темноте, чтобы исключить влияние света, то и опыты по изучению ростовой реакции семядолей на гормон также проводили в темноте.
На рис.11 приводятся результаты ряда экспериментов, каждый из которых обозначен соответствующим индексом (от А до Л). Такие обозначения опытов будут сохранены и при обсуждении последующих данных. Это позволяет рассматривать характеристику ростовой реакции на цитокинин как паспорт чувствительности семядолей к фитогормону в каждом отдельном опыте. Кроме того, это дает возможность сравнивать влияние БАП на рост семядолей и на активность в них РБФК.
