Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Светозависимые объемно-структурные изменения хлоронластов
1.1. Фотоиндуцированные объемно-структурные изменения хлоронластов in vitro и in vivo 8-10
1.2. Влияние условий инкубации на фотоиндуцированные объемно-структурные изменения хлоропластов in vitro и in vivo 11-20
1.3. Механизмы активированных светом объемно-структурных изменений хлоропластов 20-22
1.4. Методы изучения фотоиндуцированных объемно-структурных изменений хлоропластов in vitro и in vivo 22-30
1.5. Механизмы светорассеяния изолированными хлоропластами и их фрагментами 30-36
ГЛАВА II. Объекты и методы исследований 37-44
ГЛАВА III. Характер и механизмы активированных светом структурных изменений хлоропластов
3.1. Исследования на целых хлоропластах 45-115
3.1.1. Влияние некоторых условий инкубации хлоропластов на характер их фотоструктурной реакции 45-71
3.1.2. Природа фотоиндуцированных изменений светопропускания и светорассеяния хлоропластами 71-86
3.1.3. Фотоструктурные изменения хлоро-пластов и транспорт электронов на участках электрон-транспортной цепи первой и второй фотосистем 86-115
3.2. Исследования на фрагментах хлоропластов 115-І40
3.2.1. Фотоструктурные изменения гран 115-132
3.2.2. Фотоструктурные изменения субмембранных частиц, преимущественно содержащих одну из двух фотосистем 132-140
Заключение і4і-і42
Выводы 143
Литература 144-170
- Влияние условий инкубации на фотоиндуцированные объемно-структурные изменения хлоропластов in vitro и in vivo
- Методы изучения фотоиндуцированных объемно-структурных изменений хлоропластов in vitro и in vivo
- Влияние некоторых условий инкубации хлоропластов на характер их фотоструктурной реакции
- Фотоструктурные изменения хлоро-пластов и транспорт электронов на участках электрон-транспортной цепи первой и второй фотосистем
Введение к работе
К настоящему времени во многих деталях изучено строение фотосинтетического аппарата и его биохимический состав. Установлена последовательность и вскрыт механизм основных реакций этого процесса, начиная от поглощения кванта света и кончая ассимиляцией молекулы С02. Установлена высокая зависимость физиологических явлений фотосинтеза от условий внешней среды. Однако всех этих сведений оказывается недостаточно для эффективного управления процессом фотосинтеза с целью повышения устойчивости и эффективности его работы. Особенно узким местом наших знаний об этом процессе, как и о большинстве других физиологических процессов, является недостаточное понимание его регуляторных аспектов, то есть понимание тех механизмов, которые управляют скоростью процесса и его реакцией на изменение условий внешней среды.
В лаборатории фотосинтеза Института экспериментальной ботаники АН БССР были выполнены обширные исследования влияния водообеспеченности и водного режима растений на интенсивность фотосинтеза /9-16, 20, 22/. Было показано, что структурное состояние сформированных хлоропластов в каждый отдельный момент обусловлено воздействием не только факторов внешней среды, которые определяют внутриклеточные условия функционирования хлоропластов, но и протекающими в самих хлоропластах фотосинтетическими процессами. Полученные факты позволили обосновать наличие функциональной регуляции структуры хлоропластов и, тем самым, сформулировать концепцию о структурно-функциональной взаиморегуляции в них.
Фотоиндуцированные объемно-структурные изменения хлоропластов, которые были впервые обнаружены in vivo много лет на-
зад /631 64/» являются, по нашему представлению, подтверждением этой концепции. Однако, все эти годы они изучались просто как явление, то есть выяснялись условия их проявления, наличие у хлоропластов различных видов растений, а также механизм. Особенно интенсивно эти вопросы начали изучаться, начиная с 70-х годов, когда с помощью фотометрических и других методов анализа была обнаружена способность хлоропластов к светозависимым объемно-структурным изменениям in vitro /109, 116, 178, 179, 187/. За два десятилетия, прошедших с тех пор, явление было изучено практически во всех аспектах достаточно глубоко /144, 149, 150, 159, 160, 167, 171, 183, 188, 189, 198, 220/. Тем не менее, к началу наших исследований по ряду вопросов отсутствовало единое мнение. Особенно это касается механизма фотоиндуцированных объемно-структурных изменений хлоропластов.
В этом отношении превалирует точка зрения, согласно которой основной движущей силой фотоиндуцированных объемно-структурных изменений хлоропластов является образуемый в процессе фотосинтетического электронного транспорта протонный градиент /30, 33, 68, 70-73, 75, 150, 159, 160, 183, 189, 207, 220, 224/. Нами обнаружено всего несколько работ /9, 29, 140, 183/, в которых ставился вопрос о значении для этого явления более ранних этапов фотосинтетического процесса.
Известные литературные данные /109, 116, 178, 179, 187/ свидетельствуют о практически однозначной структурной реакции хлоропластов на включение актиничного света в условиях, обеспечивающих протекание электронного транспорта. Эта реакция была определена как фотосокращение хлоропластов. И лишь в специфических условиях инкубации хлоропластов (в солевых средах) их отклик на включение актиничного света идентифициро-
ван /71, 157, 190, 194/ как фотонабухание, причем последний процесе представлялся как не физиологический, а деструктивный. Однако с точки зрения концепции о взаиморегуляции структуры и функции хлоропластов следовало бы ожидать более сложной картины объемно-структурных изменений хлоропластов на освещение актиничным светом в зависимости от условий их инкубации. В связи с вышеизложенным целью наших исследований явилось:
Изучить характер структурных изменений хлоропластов в процессе их функционирования в различных условиях инкубации.
Выяснить природу изменений светопропускания и светорассеяния хлоропластами, являющихся индикатором их структурного состояния в процессе функционирования.
Исследовать механизм структурно-функциональной взаиморегуляции в хлоропластах.
Выражаю искреннюю благодарность и признательность за большую помощь в проведении экспериментов и ценные советы при оформлении диссертации своим коллегам по работе кандидатам биологических наук Майе Ивановне Маршаковой и Светлане Александровне Микульской.
Приношу глубокую благодарность сотрудникам Института фотобиологии АН БССР Валентине Максимовне Коляго и Галине Семеновне Сенкевич за помощь в освоении методики выделения субмембранных частиц из хлоропластов гороха, а также кандидату биологических наук Александре Ивановне Арнаутовой за любезно предоставленную возможность получения электронно-мик роскопи-ческих фотографий изолированных гран хлоропластов гороха.
Выражаю глубокую признательность доктору биологических наук Владилену Лазаревичу Калеру и доктору биологических наук Леониду Исаевичу Фрадкину за полезное обсуждение экспериментальных результатов.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АДФ - аденозиндифосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
ДФК - 1,5-дифенилкарбазид
ДХММ - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметшшочевина
ДХФИФ- 2,б-дихлорфенолиндофенол
КЦФФ - карбонилцианид-р-трифлуорометоксифенилгидразон
КЦХФ - карбонилцианид-т-хлорфенилгидразон
MB - метилвиологен
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
ТМХ - триметил-1,4-бензохинон (окислен.)
TMXHg- триметил-1,Ч-бензохинон (восстанов.)
ФМА - фенилмеркурийацетат
ФМН - флавинмононуклеотид
ФМС - феназинметасульфат
ФС - фотохимическая система
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия
ЭТЦ - электрон-транспортная цепь
Г Л А В A I
СВЕТОЗАВЙСИМЫЕ ОБЪЕМНО-СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ
ХЛОРОПЛАСТОВ
I.I. Фотоиндуцированные объемно-структурные изменения
ХЛОропластОВ in vitro и in vivo
Изучение светозависимых объемно-структурных изменений хлоропластов было первоначально начато in vivo с помощью светового микроскопа /63, 64/. Оптико-микроскопические исследования хлоропластов, находящихся внутри растительных клеток, показали их способность менять пространственную форму и объем под действием периодического освещения /101, 221,230/» in vivo объемные изменения хлоропластов под действием акти-ничного света наблюдали также с помощью электронного микроскопа /101, 125, 184/.
Ряд исследований /I7I-I74/ был выполнен в условиях, когда световую активацию хлоропластов осуществляли in vivo, а объемные изменения хлоропластов регистрировали с помощью гравиметрии и кондуктометрии после быстрого (за период около 2 минут) их выделения. Показано, что под действием белого света происходит уменьшение объема хлоропластов гороха с 39д3 (темнота) до 3IJA.3 (свет) /172, 173/. В других опытах /171/ с использованием аналогичной методики наблюдали уменьшение объема хлоропластов на 85% по сравнению с хлоропластами, выделенными из листьев в темноте.
В отличие от э кспериментов in vivo было показано /52, 109, 116, 179, 187, 190, 194/, что in vitro хлоропластам присущи два типа объемно-структурных изменений, активируемых светом. Фотоиндуцированное низкоамплитудное сокращение хлоропластов, согласно литературным данным /4, 73, 76, 77, 88,
I78-I8I, 185, 190, 194, 198, 211/, представляет собой энергозависимый процесс и связано с энерготрансформирующими реакциями, ведущими к синтезу АТФ. Сокращение хлоропластов на акти-ничном свету - полностью обратимый процесс /109, 179, 194, 198/.
В темноте в относительно концентрированном растворе Ласт (0,35М) протекает высокоамплитудное набухание хлоропластов с полупериодом процесса примерно около 30 минут /III, 194/. На свету, в условиях, обеспечивающих транспорт электронов в хлоропластах, набухание их происходит во много раз быстрее /210/. Но этот процесс считается нефизиологическим /71, 157, 190, 191, 194/, поскольку первоначально полагали /191/, что свет лишь активирует темновое необратимое набухание хлоропластов. Поэтому явление было определено как энергонезависимое высокоамплитудное набухание /190, 194/. Однако вероятнее всего,что здесь мы имеем дело с двумя параллельными, совпадающими по направлению процессами, один из которых не зависит от света, а другой, наоборот, осуществляется с участием светоиндуцируе-мых реакций в хлоропластах и, поэтому, безусловно, является энергозависимым /33, 57, 146, 170, 180, 181, 192, 193, 209, 211, 216/.
В ряде работ /70, 71, 74, 158, 207, 214/ с использованием электронной микроскопии и техники криоскалывания было зарегистрировано сжатие структурных элементов (тилакоидов) гран при освещении хлоропластов. Сопоставление кинетик изменений объема гран и хлоропластов показало, что на свету граны сокращаются с полупериодом примерно в 30 сек, тогда как целый хлоропласт сплющивается после полного сокращения гранальных стопок с полупериодом в 3-5 минут /144/.
Некоторые исследователи /79, 159, 182/ наблюдали параллельное уменьшение под действием актиничного света толщины мембран тилакоидов и расстояния между отдельными тилакоида-ми. Эти данные свидетельствовали об изменениях в структуре мембран хлоропластов при их освещении. По мнению авторов /159/, неосмотическое уменьшение толщины мембран отражает изменения в третичной и четвертичной структуре белковых молекул, являющихся компонентами мембран хлоропластов,
В опытах in vivo, как и in vitro, также продемонстрировано, что при фотосокращении хлоропластов как целостной системы имеет место заметное уменьшение толщины мембран гра-нальных тилакоидов /ИЗ, Ш, 160, 234/»
При изучении действия света на изолированные граны и фрагменты тилакоидов зарегистрированы /94, 96, 112, 140, 166, 178, 179, 213/ изменения светорассеяния, аналогичные по характеру и кинетике фотоструктурной реакции целых хлоропластов. Исследования с помощью электронной микроскопии фрагментов хлоропластов в условиях перехода свет-темнота подтвердили эти изменения /96/,
Таким образом, многочисленными опытами in vitro и in vivo подтверждена функционально обусловленная лабильность сформированной структуры хлоропластов. В связи с этим большой интерес представляет собой как выяснение механизмов фотоструктурных изменений хлоропластов, так и роли этих изменений в регуляции отдельных фотосинтетических процессов и фотосинтеза в целом.
1.2. Влияние условий инкубации на фотоиндуцированные объемно-структурные изменения хлоропластов in vitro и in vivo
Переход к опытам in vitro открыл возможность решения вышеуказанных задач, так как позволил последовательно проводить модификацию исходного структурного состояния хлороплас-тов воздействием различными факторами (температурой, концентрацией водородных ионов, концентрацией солей и др.) при одновременном варьировании интенсивности и спектрального состава актиничного света.
Изучение in vitro и in vivo спектра действия фотоинду-цированных объемно-структурных изменений хлоропластов различных видов растений, а также влияние на эти изменения интенсивности актиничного света, показало, что они тесно связаны с поглощением света пигментными системами фотосинтетического аппарата хлоропластов /69, 76, 89, 98, 101, 102, 116, 122, 145, 168, 173, 175, 191, 201, 230-235/.
Фотосокращение хлоропластов наблюдали (in vitro и in vivo ) при возбуждении во всей видимой области (400*700 нм) с максимумами в синей и красной полосе спектра действия. Иными словами, спектр действия фотосокращения совпадает со спектром поглощения фотосинтетических пигментов хлоропластов /5, 76, 98, 116, 172, 173, 231, 232/.
Относительно спектра действия фотонабухания в литературе нет достаточно исчерпывающих данных. Некоторые исследователи наблюдали in vitro данный тип объемно-структурных изменений хлоропластов в красной СЛ>600 нм) области видимого спектра при различной интенсивности актиничного света /47, ИЗ, 191, 198, 220, 228/. Другие индуцировали набухание хло-
ропластов in vitro белым светом с уровнем освещенности порядка 1,2*3,5'Ю4 лк /157, 193, 194, 209, 211/.
Были проведены сравнительные опыты по действию голубого и красного света различной интенсивности на размер, форму и внутреннюю структуру хлоропластов in vitro и in vivo /89, 163, 230-235/. in vitro голубой (^мах#=484 нм) свет низкой интенсивности (2,5*3,3*10 эрг/сьг'сек) вызывал увеличение поверхности хлоропластов, а при высоких его интенсивностях (8«Пг*5«105 эрг/см2»сек) наблюдалось ее уменьшение. Красный свет (^мах#=бб8 нм) при всех интенсивностях вплоть до 8«Ю5 эрг/см2»сек индуцировал только увеличение поверхности хлоропластов /231, 232/.
in vivo было измерено поперечное сечение хлоропластов при изменении интенсивности голубого (370*500 нм) и красного (600*850 нм) света /233/. При возрастании интенсивности красного света от 0,06 Вт/м2 до 400 Вт/м2 наблюдалось увеличение поверхности хлоропластов с одновременным уменьшением их толщины. Это параллельно приводило к уменьшению объема хлоропластов примерно на 10% как при высокой, так и при низкой интенсивности освещения в указанном диапазоне. В случае голубого света подобный эффект наблюдался лишь при низкой его интенсивности (0,06 Вт/м2). При высоких интенсивностях (400 Вт/м2) голубого света происходило значительное уменьшение поверхности хлоропластов, а также их объема (на 35%) по сравнению с темновым контролем. Как в случае красного, так и голубого света наблюдаемые изменения конфигурации и объема хлоропластов были обратимыми при выключении актиничного света /233/.
Изменения поверхности хлоропластов в интактных клетках
листьев шпината вызывались /89/ голубым (370*500 нм) и красным (600+850 нм),светом с интенсивностью от Ю2 эрг/см2*сек до 5-Ю5 эрг/см2»сек. Красный свет приводил к увеличению по-верхности хлоропластов от 11,9^ до 19,4^^ пропорционально интенсивности и времени (до 2-х часов) освещения. Низкая интенсивность (10 эрг/см2»сек) голубого света вызывала увеличение поверхности (до 12,5/^2) хлоропластов по сравнению с темновым контролем (11,9/л-2), а высокие его интенсивности (5-Ю5 эрг/см2«сек) заметно уменьшали (до 7,5/-2) ее /89/.
Показано /235/, что голубой и красный свет высоких ин-тенсивностей (30 нЭйн/см2»сек) оказывают противоположное влияние на объем и форму хлоропластов. На красном свету наблюдалось увеличение поверхности хлоропластов, а голубой свет стимулировал ее уменьшение в течение двух часов непрерывного освещения. За этот период времени происходило уменьшение объема хлоропластов на голубом свету и увеличение его на красном. Однако в течение первых 30 минут освещения в обоих случаях (голубой и красный свет) объем хлоропластов сначала уменьшался. А затем на красном свету наступала фаза медлен-*-ного набухания хлоропластов. При низких интенсивностях (до 3 нЭйн/см2»сек) голубого и красного света характер изменений объема хлоропластов был одинаковым. В этих условиях за первые 30 минут освещения хлоропласты максимально сокращались, и в дальнейшем (в течение 2-х часов наблюдений) их объем не менялся /235/.
Исследованиями обоих типов объемно-структурных изменение хлоропластов in vitro и in vivo выявлено, что они отличаются друг от друга по кинетике и обратимости в зависимости от рН среды, температуры и др. Амплитуда фотооокращения силь-
но зависит от рН среды (максимальная при рН 5,5*6,5), а фо-тонабухания - слабо, хотя его максимум наблюдался при рН 7,8*8,0/5, 70, 76, 102, 160, 180, 184, 191, 198, 210, 222/.
Фотонабухание хлоропластов более чувствительно к температуре инкубации (степень и скорость возрастают с увеличением температуры), чем фотосокращение (уменьшается с увеличением температуры) в области физиологических температур от +5С до +35С /103, 150, 168, 191, 198, 216). Однако для фотосокращения хлоропластов как in vitro, так и in vivo оптимальной является температура +20*25С /150, 172), а в некоторых случаях - +30*35С /2/. При изучении реакции гран на свет с изменением температуры от +18С и ниже показано, что их фотосокращение сменяется фотонабуханием /74/.
К числу химических веществ, действие которых на указанные процессы было исследовано, относятся кофакторы электронного транспорта, его ингибиторы и разобщители, кофакторы фо-тофосфорилирования, ионный состав реакционной среды и др.
Влияние различных кофакторов циклического и нециклического транспорта электронов на оба типа фотоструктурных изменений хлоропластов оказывается в основном аналогичным. Фотонабухание изолированных гран и хлоропластов может стимулироваться как ФМС /33, 47, 94, 146, 168, 176, 180, I9I-I94, 198, 216/, так и K3Fe(CN)6 /33, 47, 146, 191, 194, 198/ и MB /47/. Обнаружено /194/, что НАДФ+ферредоксин ингибировали фотонабухание хлоропластов. В случае фотосокращения гран усиление процесса наблюдается в присутствии ФМС /94, 96, 158, 159/ и K5Fe(CN)6 /74, 178, 179/. На фотосокращение целых хлоропластов стимулирующе влияют также такие кофакторы, как ТМХ и ТМХН2 /76/, ФМН /216/, аскорбат+ДХФЙФ /76/, К3?е(СЮб /5, 77, III,
160, 191, 198, 222/, витамин К3 /216/ и ФМС /5, 31, 52, 70, 71, 76, 160, 179, 181, 183, 191, 194, 198, 208, 211, 220, 222/. В некоторых случаях ФМН и пиоцианин не влияли на фотосокращение хлоропластов /102/.
На фотоструктурные изменения хлорошіастов оказывают влияние ингибиторы транспорта электронов (ДХММ, о-фенантролин, гидрокоиламин, КСїт, и др.), разобщители фотофосфорилирования (Ш^СІ, КЦХФ, КЦФФ, ФМА, метиламин, атебрин и др.), ионофо-ры (нигерицин, валиномицин и др.), кофакторы фотофосфорилирования (Mg2+, неорганический фосфат, АДФ) и т.д.
Стимулирующее действие, как установлено, оказывают:
1) на фотосокращение целых хлорошіастов - ФМА /159, 190, 191,
208, 211/, атебрин /103, III, ИЗ, 166/, квинакрин /76, 77,
III, 208/, ЭДТА /59, 116, 208/, хлорпромазин /103/, нигери
цин (при освещении суспензии хлорошіастов голубым (400 ^Л^
500 нм) светом) /235/, неорганический фосфат /108, 112, 120, 187, 191, 194, 208/, АДФ+неорганический фосфат /198/, Mg2++ +АДФ /120/, АТФ /102, 109, III, 186, 190/, Mg2++ATФ /198/;
2) на фотосокращение фрагментов хлорошіастов - ФМА /158, 159/,
атебрин /112/, квинакрин /74/, АДФ /178, 179/; 3) на фотона
бухание целых хлорошіастов - ДХММ в присутствии ФМС /191/,
Tffl^CI /33, 69, 71, 112, 146, 167, 176, 198, 216/, метиламин
/33, III, ИЗ, 146, 216, 228/, квинакрин /77/, дикумарол
/103/, нигерицин (при освещении суспензии хлорошіастов крас
ным светом (Л>600 нм)) /207, 235/, Mg2++Heорганический фос-
фат+АДФ /120/, АТФ /47, III/, 0,05М трис-HCI буфер /112/,
ацетон (при низких концентрациях) /157/; 4) на фотонабухание
фрагментов хлоропластов - ДХММ /74, 145/, NH^CI /71/, метил
амин /112/, нигерицин (на красном (Л> 600 нм) свету) /207/.
Светоактивируемые объемно-структурные изменения хлоропла-стов ингибировали такие вещества, как: а) фотосокращение целых хлоропластов - ДХММ /5, 59, 76, 77, 88, 160, 167, 173, 179, 191, 222/, О-фенантролин /76, 109, 167, 231/, гидроксил-амин /109/, NH^CI /5, 52, 76, 103, 109, 167, 179, 180, 190, 194, 198, 222, 231/, КЦХФ /5, 76, 216, 222/, КЦФФ /III, 112, 173/, антимицин-А /167, 216/, атебрин /167/, ЭДТА /34, 103, 112/, дикумарол /103/, нигерицин (при освещении суспензии хлоропластов красным (Л>600 нм) светом)/173/, грамицидин-Д /207/, АТФ /31, III/, аминокислоты глицин, аланин, серии, аспартат /191/; б) фотосокращение фрагментов хлоропластов -ДХММ /96, 178/, їїН^СІ /71, 178/, КЦХФ /214/; в) фотонабухание целых хлоропластов - ДХММ в присутствии K3Pe(QOg /33, 47, 191/, ДХММ /33, 47, 146, 167, 198, 228/, О-фенантролин /167/, КЦХФ /47, 216/, КЦФФ /III, 170/, ФМА /190, 198, 211, 216/, антимицин-А /216/, дикумарол /170/, дезаспидин /170/, пентахлорфенол /170/, грамицидин-Д /47, 170/, нигерицин+ +грамицидин-Д /207/, нигерицин+валиномицин /207/, АТФ /III/, АТФ+Mg2* /33/, неорганический фосфат /33, 34, 191, 193, 194, 198/, неорганический фосфат+ Мв2++АДФ /33/, ЭДТА /33, 34, 47/, жирные кислоты /157/, 0,8М трис /216/, ацетон (при высоких концентрациях) /157/; г) в условиях фотонабухания фрагментов хлоропластов - КЦФФ /145/.
В ряде случаев не обнаружилось влияние на фотосокращение целых хлоропластов и их фрагментов (гран и тилакоидов) ДХММ /52, 144, 160, 216/, КОТ /109/, додецилбензол сульфоната /109/, КЦФФ /112, 166/, ЭДТА /112, 120, 166/, антимипина-А /52, 76/, валиномицина /207/, АДФ и АТФ /52/. На фотонабухание хлоропластов и их фрагментов не оказывали действия ДХММ
/198, 216/, ИН^СІ /168, 193, 194/. КЦФФ /112/, ЭДТА /112/, квинакрин /216/, АДФ /193/, %2++АДФ /216/, Ме2++АТФ /194, 216/.
Из перечисленных выше результатов по влиянию ряда химических веществ на объемно-структурное состояние освещенных хлоропластов видно, что действие одних и тех же веществ весьма неоднозначно. Например, яН^СІ и ФМА в зависимости от условий проведения эксперимента оказывают, соответственно, ин-гибирующее или стимулирующее действие на фотосокращение, но не на фотонабухание хлоропластов /70, 144, 190, 208/. По данным других исследователей наблюдалась противоположная картина. В присутствии їїН^СІ граны и хлоропласты на свету были сильно набухшими /71, 112/. Аналогично на фотонабухание (подавление или усиление) влиял и ФМА' /190, 211/. Такая же ситуация наблюдается и в случае введения в инкубационную среду других химических агентов.
В то же время действие неорганического фосфата на фотоструктурные изменения хлоропластов, согласно литературным данным /191/, однозначно. Неорганический фосфат сильно подавляет фотонабухание хлоропластов /33, 34, 193, 194/, а на фотосокращение их /108, 187, 194, 208/, он оказывает сильно стимулирующее влияние с максимумом при концентрации примерно 20*50 тМ.
Поскольку хлоропласт является осмотически активной системой, значительное внимание в исследованиях было уделено действию различных неорганических и органических осмотически активных веществ (солей щелочно-земельных металлов, солей слабых органических кислот, Сахаров и др.) на фотосокращение и фотонабухание хлоропластов.
Присутствие в суспензии хлоропластов анионов и катионов различных слабо- и сильнодиссоциирующих солей вызывает определенную модификацию структуры хлоропластов в темноте и в последующем определяет тип ответной реакции хлоропластов на свет (либо их фотонабухание, либо фотосокращение) /71, 96, 191, 207, 220/. Оказалось, что различные анионы слабых органических и неорганических кислот сильно стимулируют процесс фотосокращения хлоропластов in vitro иіп vivo /68, 69, I84-, 191/.
Наибольшее внимание среди ионов уделялось действию мо-но- и дивалентных катионов щелочно-земельных металлов на процесс фотосокращения и фотонабухания хлоропластов, поскольку предполагалось, что они вместе со светоуправляемым транспортом протонов играют центральную роль в контроле светозависи-мых объемно-структурных изменений хлоропластов.
В опытах с рядом солей дивалентных катионов (М^+, Са2+, Mriи др.) наблюдалось обратимое фотосокращение гран и целых хлоропластов /96, 120/. В случае наличия полностью диссоциированных моновалентных ионов типа Na+ происходит интенсивное набухание хлоропластов при их освещении /71, 168, 176/. При этом в одних исследованиях /168/ с увеличением концентрации иаСІ от 0,035М до 0,ЗМ амплитуда этого процесса возрастала. В других же работах /193/ в пределах концентраций иаСІ от 0,1М до 1,0М амплитуда светоиндуцируемого набухания хлоропластов была приблизительно одинаковой. В присутствии ФМС или К5?е (Стт)б некоторые исследователи /33/ наблюдали, что амплитуда фотонабухания хлоропластов была большей при 0,05М, чем при 0,35М їїаСІ. При рН среды от 5,0 до 8,0 и в области концентраций иаСІ от 0,1М до 0,35М под действием ак-
тиничного света происходит более чем двухкратное увеличение объема хлоропластов /70/.
При сопоставлении эффективности моно- и дивалентных катионов обнаружено, что более действенны такие дивалентные катионы, как Mg2+, Мп2+, Са2+ и др. Причем требуется меньшая их концентрация, чем моновалентных катионов для активации в одних и тех же условиях одинаковой степени объемно-структурных изменений хлоропластов /93 112, 161/. Максимум фотосокращения наблюдался при концентрации NaCI около 50 шМ, а для MgCIg и CaCL) насыщающей была концентрация примерно в 20*25 тМ.
Опыты по влиянию концентрации органических осмотиков (сахарозы, глюкозы) на светозависимые изменения объема хлоропластов показали /108/, что степень фотосокращения их монотонно убывает с увеличением концентрации осмотика в пределах от 0,1 до 1,0М. Делается вывод, что сахароза подавляет светоиндуцируемое сокращение хлоропластов /102/. В случае фотонабухания хлоропластов, активируемого метиламином, а также их фотосокращения в присутствии атебрина максимальная амплитуда этих процессов наблюдалась при концентрации сахарозы 0,02М, а минимальные изменения были при 0,45М /III/.
Перечисленные выше факты свидетельствуют о высокой зависимости фотосокращения и фотонабухания хлоропластов не только от кофакторов электронного транспорта, но также от условий инкубации, в литературе содержатся часто противоречивые данные относительно влияния того или иного химического или физического фактора на каждый из этих процессов. К тому же сложность применяемых инкубационных сред часто не способствует прояснению картины. Представляется, что для выяснения
механизмов фотоструктурных изменений хлоропластов дальнейшие исследования целесообразно проводить в условиях минимального количества воздействующих на хлоропласти факторов, особенно химических, то есть в условиях преимущественного функционирования эндогенного пула фотосинтетических медиаторов.
1.3. Механизмы активированных светом объемно-структурных изменений хлоропластов
Интенсивное изучение механизма фотоструктурных изменений хлоропластов было начато в 70-х годах /109, НО, 178, 179/. Зарегистрированный одновременно с фотоструктурными изменениями как в опытах in vitro /70, 71, 74, 120, 158, 159/, так и in vivo /160, 175/ активируемый светом обмен хлоропластов с окружающей средой рядом ионов привел исследователей к предположению, что конформация структурных элементов мембран и объем хлоропластов в целом тесно связаны с транспортом протонов, индуцируемым потоком электронов в электронтранспорт-ной цепи этих органелл.
Индуцируемый параллельно с фотосокращением или фотонабуханием хлоропластов поток (внутрь или наружу хлоропластов) различных ионов и воды /59, 68, 69, 73, 77, 161, 170, 171, 174/, как оказалось, в значительной степени зависит от природы ионов, находящихся в среде выделения хлоропластов /71; 72, 191/. При изучении процессов транспорта ионов и воды в освещенных хлоропластах было обнаружено /76, 77/, что кинетика регистрируемых изменений светорассеяния суспензией хлоропластов и обратимых потоков различных катионов через мембраны в значительной степени сходны между собой.
Как полагают /95, 96/, процесс протонирования хлоропла-
стов приводит к двум наиболее вероятным мемханизмам изменения структуры и объема хлоропластов in vitro и in vivo. Осмотический механизм представляет собой светозависимую аккумуляцию внутри или вынос наружу из хлоропласта (в зависимости от солевого состава среды) осмотически активных веществ (ионов) /77/. Неосмотический же механизм предполагает структурные изменения мембран хлоропластов вследствие непосредственного их протонирования /159, 182/.
Первоначальным событием, приводящим к изменению в структуре мембран, является конкурентное взаимодействие протонов и различных катионов (главным образом моно- и дивалентных) с отрицательно заряженными группами структурных элементов тила-коидов хлоропластов /49-51, 60, 75, 80, 81, 87, Ш, 149, 150, 159, 160, 165, 183, 189, 213, 220/. Экранировка карбоксильных групп различными ионами может приводить к модификации определенных участков мембран хлоропластов /53/, а значит - и к их структурным изменениям. Это подтверждается опытами /206/, в которых показано, что различные ионы могут оказывать неспецифическое влияние на скорость потока электронов и активность фотофосфорилирования. Изменение значений рН от 4,0 до 9,0 как в темноте, так и на свету при добавлении к суспензии изолированных хлоропластов щелочей или кислот также приводит к модификации структуры мембран /12, 60, 68, 70, 85, 159, 191, 217/.
По данным высокоразрешающей электронной микроскопии и фотоденситометрии /159/ понижение рН приводило к уплотнению упаковки тилакоидов в гранах, что сопровождалось увеличением светорассеяния под углом 90. Включение актиничного света вызывало аналогичный эффект. Предполагается /160, 189/, что
менения толщины мембран тилакоидов определенным образом обусловлены связыванием ионов с мембранами по неосмотическому механизму, аналогичному протонированию, а объемно-конфигурационные изменения внутри хлоропластов на уровне целых стопок тилакоидов (гран) регулируются, в первую очередь, осмотическим механизмом.
В ряде работ /175, 235/ представлены материалы, свидетельствующие о механо-химическом механизме фотоструктурных изменений хлоропластов.
Представляется очевидным, что светоиндуцируемое поглощение протонов и возникающие при этом структурные перестройки мембран хлоропластов могут, в свою очередь, оказывать влияние на те процессы в мембранах, которые их вызвали. Это предположение, естественно, вытекает из многочисленных исследований /8-П, ІЗ, 18-20, 23, 25, 29, 122, 196/, свидетельствующих, что изменения внутренней структуры хлоропластов независимо от того, каким бы физико-химическим фактором они не были вызваны, всегда влекут за собой изменения их функциональной активности. Кроме того, опыты in vitro и in vivo показали /98, 99, 189/ возможность контроля над скоростями потоков электронов в электрон-транспортной цепи хлоропластов, а также активностью фотофосфорилирования /171, 233, 234/ посредством структурных изменений, возникающих в мембранах тилакоидов при их протонировании.
1.4. Методы изучения фотоиндуцированных объемно-структурных изменений хлоропластов
in vitro и in vivo
Огромный интерес исследователей во всем мире к фотоструктурным изменениям хлоропластов в значительной мере определил
многообразие используемых в лабораториях методов исследования этого явления: микроскопии (световая и электронная), кондуктометрии (счетчик Коултера), гравиметрии (метод микрокапилляров), вискозиметрии, нефелометрии и турбидиметрии. Поскольку in vivo применимость различных методов исследования сильно затруднена, большинство опытов по регистрации изменений объема и структуры хлоропластов проведено исследователями in vitro. При этом всегда оставалось существенно важным определение степени соответствия, фактов, полученных in
vitro И in vivo.
Сравнительные исследования высокоамплитудного фотонабухания и низкоамплитудного фотосокращения хлоропластов in vitro с помощью электронной микроскопии, турбидиметрии, нефелометрии, гравиметрии и кондуктометрии /68, 70, 109, 193, 194/ показали, что в большинстве случаев эти методы дают почти идентичную информацию о фотоструктурных изменениях хлоропластов. Наблюдались лишь различия в кинетике изменений процессов, изучаемых каждым из данных методов. Хотя совпадение результатов получаемых разными методами анализа достаточно велико, каждый из них имеет определенные преимущества и недостатки при сравнении друг с другом /188/.
Например, нефелометрический метод анализа является достаточно "мягким", то есть практически не нарушает нативность хлоропласта. Но этот метод не позволяет непосредственно измерять размер частицы, так как интенсивность светового потока, рассеиваемого частицей, одновременно определяется несколькими физическими явлениями, которые, в свою очередь, отражают не только изменение размера или формы частицы, но и ее рефрактивного индекса. Поэтому данные по нефелометрии в этом аспек-
те требуют сопоставления результатов с информацией, получаемой другими методами анализа /188/.
Кондуктометрический метод более статичен по своему принципу действия по сравнению с турбидиметрией или нефеломерией и не дает полной определенности в том, что размер биочастиц измеряется точно, например, вследствие эффектов их агрегации /151, 188/. На измерения этим более прямым методом, чем фотометрические, могут оказывать некоторое влияние поверхностный заряд биочастиц и их электропроводность /107, 149/.
На применение метода микрокапилляров накладываются определенные ограничения потребностью довольно высоких концентраций хлоропластов и специального центрифугирования, в процессе которого образец освещается. Следовательно, данный метод применим при наличии больших количеств экспериментального материала. Однако в концентрированных суспензиях нарушаются условия нормального функционирования хлоропластов, например, из-за неравномерного их освещения и др. /188/.
Расхождения по знаку данных о фотоиндуцированных объемно-структурных изменениях хлоропластов, полученных с помощью нефелометрии, турбидиметрии, гравиметрии, кондуктометрии и электронной микроскопии, были зарегистрированы в опытах с различным ионным составом инкубационной среды /68, 70, 71/.
Для случая низкоамплитудного обратимого фотосокращения хлоропластов в присутствии Na-ацетата и ФМС наблюдалось увеличение светорассеяния при у =90, абсорбции и уменьшение столбика осадка отцентрифугированных (метод микрокапилляров) хлоропластов /71/, то есть наблюдалось полное соответствие
данных по всем используемым методам. Однако в среде с наСІ увеличение размера хлоропластов на свету, регистрируемое электронной микроскопией, кондуктометрией и гравиметрией, сопровождалось незначительным усилением светорассеяния при J =90 и уменьшением абсорбции. По данным кондуктометрии и метода микрокапилляров, в присутствии хлористого аммония ОтНьСІ) на свету регистрировалось резкое увеличение объема хлоропластов, сопровождаемое уменьшением абсорбции и отсутствием изменений в светорассеянии при jf =90 /71/. В этих опытах наблюдения с помощью электронного микроскопа показали, что на свету: а) в среде с яа-ацетатом хлоропласты выглядели сильно сплющенными, а граны сильно сжатыми по сечению; б) в среде с яН^СІ хлоропласты были сильно набухшие, часть гран исчезла, а остальные набухли; в) в среде с NaCI хлоропласты оказались набухшими, а часть гран была либо слегка сжата по сечению или они частично исчез ли /71/.
По смещению пика кривой распределения по размеру (кон-дуктометрический метод) хлоропластов шпината был сделан вывод, что хлоропласты в условиях фотофосфорилирования сокращаются на свету /109/. Это подтверждалось и результатами, полученными с помощью метода микрокапилляров и вискозиметрии /109, 151/. Показано, что вязкость суспензии хлоропластов шпината обратимо уменьшалась на свету и восстанавливалась в темноте /151/. Однако при непосредственном сопоставлении результатов наблюдались заметные расхождения в скоростях между изменениями параметров, регистрируемых различными методами исследования. Скорости изменений по данным вискозиметрии и кондуктометрии были значительно медленней (время полного завершения процесса составляло около 10 минут), чем
изменений, фиксируемых оптическими (нефелометрия и турбиди-метрия) методами (время окончания наблюдавшегося процесса было порядка I минуты) /109, ПО, 151/.
Некоторые исследователи /68, 71/ полагают, что такие методы анализа, как электронная микроскопия, кондуктометрия и турбидиметрия, дают результаты, по которым вполне можно судить об объемных изменениях хлоропластов с большой достоверностью, а нефелометрия как метод может давать совершенно противоречивые результаты. В ряде опытов /71/ при низких значениях рН (4,0*5,0) наблюдалось увеличение абсорбции суспензией хлоропластов, что должно указывать на их сокращение, тогда как данные, полученные с помощью электронной микроскопии и кондуктометрии, показали, что в действительности имеет место набухание хлоропластов. Авторы считают, что в данном случае происходило увеличение рефрактивного индекса мембран хлоропластов относительно рефрактивного индекса среды окружения из-за потери мембранами воды„ Это я приводило к усилению светорассеяния при у =90 /71/. По этой же причине могли происходить изменения светорассеяния суспензией хлоропластов, обусловленные воздействием других факторов /102/.
В связи с указанными противоречиями в результатах, полученных фотометрическими методами анализа, были проведены более детальные исследования изменений светопропуекания и светорассеяния при л =90 суспензией освещенных хлоропластов /159/. Показано, что с помощью фотометрических методов (при одновременной регистрации светопропускания и светорассеяния при у =90) можно получать достаточно подробную информацию о внутриструктурных и конфигурационных изменениях хлороплас-
тов. Это подтверждается также наблюдениями /159/ за объемно-структурными изменениями тилакоидов под действием актинично-го света с помощью электронной микроскопии. При регистрации фотосокращения хлоропластов были обнаружены расхождения в кинетике и характере изменений светорассеяния при J =90 и све-топропуекания. В случае светопропускания наблюдался двухфазный ответ. Первоначальное быстрое увеличение светопропускания по характеру совпадало с изменением светорассеяния под ^ =90, но затем наступала фаза более медленных и более высокоамплитудных изменений при Л =0.
С помощью быстрой фиксации препаратов хлоропластов при электронно-микроскопических наблюдениях исследователи /159/ пришли к выводу, что начальные изменения светопропускания и светорассеяния при jj =90 обусловлены изменениями в структуре мембран, а последующие более значительные и медленные изменения затрагивают толщину тилакоидов, расстояние между ними и объем хлоропласта как целой частицы. Причем интенсивность светорассеяния при у =90 определяется одновременно структурными изменениями мембран и более медленными конфигурационными изменениями тилакоидов хлоропластов /159/. К аналогичному заключению пришли и другие исследователи /68, 74, 149, 150, 158, 161, 214, 228/.
Подчеркивается / 68, 228/, что светопропускание является лучшим индикатором объемных изменений хлоропластов по сравнению со светорассеянием под большими углами ()(=90). Уменьшение или увеличение светорассеяния при У =90, отражая частично изменения объема целого хлоропласта и его внутренних компартментов (гран), накладывается на те изменения светорассеяния, которые индуцированы варьированием рефрактивного ин-
декса хлоропласта, В этом случае при фотоиндуцированных объемно-структурных изменениях хлоропласта светорассеяние при Jf =90, обусловленное изменением рефрактивного индекса и размера хлоропласта как целой частицы, а также его внутренних структур (тилакоидов), может оказаться одинаковым по знаку.
Предполагается /68/, что при фотосокращении хлоропластов изменения светорассеяния при I =90 обусловлены: I).структурными изменениями тилакоидов (наблюдается увеличение светорассеяния); 2) объемными изменениями целых хлоропластов (светорассеяние тоже возрастает). Поэтому быстрое и обратимое увеличение светорассеяния при j( =90 суспензией хлоропластов при их освещении можно рассматривать /74, 149/ как явление, в основном независимое от изменений размера целых хлоропластов и, скорее всего, тесно связанное с их внутри-структурными изменениями.
В опытах с морскими водорослями также было проведено /160/ сопоставление фотоиндуцированных изменений светопропу-скания и светорассеяния при % =90. Показано, что оба метода тесно коррелируют друг с другом в отношении кинетики и характера изменений при фотосокращении хлоропластов.
Использование электронной микроскопии при изучении фотоструктурных изменений хлоропластов позволяет существенно конкретизировать информацию о них. В то же время электронная микроскопия не обеспечивает информацию о динамике процессов, что существенно ограничивает возможности использования ее в обсуждаемых исследованиях /188/.
Изучение объемно-структурной реакции хлоропластов на свет in vivo проводилось с помощью фотометрических методов
(нефелометрия и турбидиметрия) /98, 160, 184/, световой и электронной микроскопии /175, 230/. В опытах с использованием электронного микроскопа были продемонстрированы /125, 158, 159, 184/ светоактивируемые изменения формы, объема и внутренней структуры (изменения в толщине мембран и расстояния между тилакоидами) хлоропластов. С помощью специальной приставки к фотометру и метода инфильтрации листьев различными веществами удалось зарегистрировать динамику изменений светопропускания и светорассеяния при jf =90 интактных листьев /184/. В дальнейшем это было сделано в условиях регуляции фотосинтетической активности хлоропластов путем изменения параметров среды окружения (газовый состав, освещенность и др.) /98/.
На сегодняшний день достаточно прецизионное измерение размера и даже формы биочастиц можно, по-видимому, осуществить с помощью метода малоуглового светорассеяния /82-84 , 105, 119, 128, 130-132, 135, 138, 142, 143, 148, 152-156, 200/. По точности данный метод не уступает микроскопии или кондуктометрии, сохраняя при этом полную нативность изучаемого объекта.
При сопоставлении различных методов, применяемых для изучения светоактивируемых объемно-структурных изменений хлоропластов, особый интерес, на наш взгляд, представляют фотометрические методы анализа как обеспечивающие сохранение нативности изучаемых объектов, наблюдение за кинетикой процессов и проведение исследований в широком диапазоне условий инкубации хлоропластов вплоть до in vivo. Однако интерпретация результатов, получаемых с их помощью, требует всестороннего понимания физических явлений, обусловливающих сложную картину рассеяния света такими гетерогенными по раз-
меру, форме и внутренней структуре биочастицами, как хлоропласти.
1,5. Механизмы светорассеяния изолированными хлоропластами и их фрагментами
На основании сопоставления информации о светоактивиро-ванных объемно-структурных изменениях хлоропластов in vitro и in vivo, получаемой с помощью фотометрических и других (более прямых) физических методов (световая и электронная микроскопия, кондуктометрия и др.) анализа, некоторые исследователи /68, 70, 71, 96, 140, 158, 159/ объясняли изменения светорассеяния как вариацией объема хлоропластов, так и их рефрактивного индекса. Другие же полагали /53, 68, 70, 74, 95, 158, 159, 161, 214/, что на изменения светорассеяния, в первую очередь, оказывают влияние объемно-структурные изменения тилакоидов, которые могут быть непосредственно не связаны с изменением размера и формы целых хлоропластов. Поэтому считалось /5, 68, 71, 74/, что невозможно точно идентифицировать изменения светорассеяния, связанные либо только с модификацией размера и формы хлоропласта как целой частицы, или только с вариацией толщины мембран и тилакоидов.
Аналогичные представления сложились и о фотоиндуцирован-ных изменениях светопропускания или абсорбции суспензией хлоропластов. Изменение абсорбции, по мнению некоторых исследователей /68, 93, 97, 145, 158, 159, 161, 228/, в первую очередь, дает информацию о внутриструктурных изменениях хлоропластов под действием актиничного света, а светопропуекание отражает изменения в размере целого хлоропласта и/или его внутренних компартментов (гран). По другим данным /76, 77,
112/, абсорбционный метод контроля изменения объема хлоро-пластов настолько же эффективен и чувствителен, как и метод малоуглового светорассеяния, возможно /бб, 93, 97, ПО, 228/, вследствие проявления эффекта "сита" /43, 61, 133, 134/«
Было показано /109/, что светопропускание отражает, наряду с изменениями размера хлоропластов, и трансформацию их формы. Авторы объясняют полученные данные, с одной стороны, влиянием на светопропускание дифракции и интерференции света частицами, сопоставимыми по размеру с длиной волны рассеиваемого ими света, а также влиянием селективного светорассеяния /54, 58, 65, 85, 126, 127, 136, 204, 217/, обусловленного изменением рефрактивного индекса структурных компонент хлоропластов, содержащих пигменты. Увеличение в светопропус-кании исследователи /109/ связывают с уменьшением светорассеяния под большими углами, регистрируемым, при фотосокращении хлоропластов.
Рассмотренные выше результаты нашли отражение в модели /150/ совокупных изменений в объеме и структуре хлоропластов на всех уровнях их организации (от макромолекулы до целой органеллы). Согласно этим модельным представлениям, конформа-ционные перестройки макромолекул в мембранах тилакоидов определяют вклад рефракции в рассеиваемый хлоропластами световой поток при у =90. Наряду с этим происходит более плотная стыковка тилакоидов. Уменьшение толщины тилакоидов определяет изменение вклада дифракции в светорассеяние. При этом, как и в предыдущем случае, наблюдается увеличение интенсивности светорассеяния при % =90. По мнению авторов, изменения в форме и/или размере целых хлоропластов должны слабо отражаться на интенсивности светорассеяния при jf =90. В услови-
ях однократного светорассеяния /91/ его интенсивность может возрастать как при сокращении, так и набухании хлоропластов /150/. Если это условие не соблюдается, то при сокращении хлоропластов интенсивность светорассеяния при jf =90 уменьшается и возрастает при их набухании. Аналогичная модель вклада объемно-структурных изменений различных уровней организации хлоропласта в суммарные изменения светорассеяния этими органеллами была представлена и другими исследователями /159/.
Таким образом, из вышесказанного следует однозначный вывод, что при фотоструктурных изменениях хлоропластов неизбежно меняется светорассеяние, которое несет информацию о размере этих органелл, их форме, рефрактивном индексе, концентрации в суспензии и др. Однако, интерпретация данных по светорассеянию представляет собой весьма непростую проблему. Поэтому для таких морфологически гетерогенных органоидов как хлоропласти определение природы рассеиваемого ими света при фотоиндуцированных изменениях их объема и внутренней структуры требует всестороннего рассмотрения вероятных оптических механизмов, которыми вызвано данное явление.
Согласно теориям приближения аномальной дифракции и приближения Рэлея-Ганса, рассеиваемый биочатицей (хлоропластом) световой поток, в первую очередь, определяется вкладом в него вариаций параметра ее размера (cL) (контролируется длиной волны рассеиваемого света и размером частицы) и относительного рефрактивного индекса (т) (контролируется индексом рефракции как частицы, так и среды, окружающей ее) /129, 134-136, 154/« Обе эти величины варьируют с изменением структуры и объема биочастицы на всех уровнях ее организации (мо-
лекулярном, надмолекулярном, мембранном и субклеточном).
В условиях однократного светорассеяния /91/ его интенсивность, измеренная под разными углами, определяется такими физическими процессами (без учета абсорбции), как: дифракцией световых волн на краях частицы, их преломлением (фазовый сдвиг проходящих через центр частицы и огибающих ее волн света) и отражением на границе раздела фаз системы среда-частица, а также внутриструктурными эффектами гетерогенных частиц /119, 134, 136, 143, 152-154/.
Поскольку диаметр хлоропластов порядка 3-Ю мкм, а их гран 0,2-0,5 мкм /37, 43/, и большинство наблюдений ведется в видимой области, то изменения размера этих органелл и их структурных компонент (гран) могут описываться как теорией больших частиц (приближение аномальной дифракции), так и теорией частиц средних размеров (приближение Рэлея-Ганса) /61, 62, 134/.
В приближении Рэлея-Ганса рассматриваются частицы, размер которых не очень мал по сравнению с длиной волны рассеиваемого ими света ( j ^ d ^ Ло ). По этой теории, полный световой поток, рассеянный частицей во всех направлениях, обусловлен деструктивной интерференцией /61, 62, 154/. При уменьшении размера частицы влияние деструктивной интерференции на интенсивность светорассеяния снижается. Это, в свою очередь, означает усиление (поду> 0) рассеяния света. Поэтому процесс сжатия такой биочастицы приводит к возрастанию полного рассеянного ею светового потока, а набухание - к его уменьшению /61, 134, 135/.
Согласно теории аномальной дифракции, рассеянный крупной частицей (с1^л0 ) свет обусловлен вкладом в него дифрак-
ции и интерференции волн света, проходящих вокруг частицы и через нее /61, 62, 105, 134, 135, 154/. При уменьшении размера частицы должен уменьшаться вклад дифракции в полный рассеянный световой поток. Одновременно с этим происходит увеличение фазового сдвига световых волн, проходящих через частицу, что вызвано вариацией ее рефрактивного индекса. Если ре-фрактивный индекс частицы меняется обратно пропорционально ее объему, то в процессе ее сокращения, как указывает теория, вклад от интерференции возрастает, что усиливает светорассеяние /61, 134, 135/. Отмечается, что изменения в фазовом сдвиге волн рассеиваемого частицей света зависят от ее исходного размера.
В области, где размер частицы совпадает с длиной волны рассеиваемого ею света, приближения Рэлея-Ганса и аномальной дифракции предсказывают одинаковую картину светорассеяния. Эти теории отражают процессы светорассеяния от целой частицы без учета ее внутренней гетерогенности и не учитывают эффекты поверхностного отражения /61/.
Для частиц cm—-і и <*.»1 (у хлоропластов эти параметры в таких же пределах) в видимой области спектра при углах, близких к ^ =90, светорассеяние связано /129, 135/ в основном с вариацией (т), а при углах, близких к ^=0, оно преимущественно отражает модификацию (<*). Расчеты показывают /135/, что для суспензии таких же частиц, но гетерогенных по размеру и форме, интенсивность рассеиваемого ими света должна возрастать под большими углами приема (^-^90) при их сокращении.
Наличие гетерогенных структур внутри хлоропласта, бесспорно, определенным образом влияет на полное светорассеяние
(особенно под К=90) /61, 62, 129, 130, 134, 135/, поскольку в процессе фотоиндуцированных объемно-структурных изменений этой органеллы возможен преимущественный вклад изменения (га) в рассеиваемый световой поток от таких внутрихлоропласт-ных элементов, как граны или даже субмембранные частицы, при незначительном влиянии изменения (d) хлоропласта как целостной системы /217/. Этот тип светорассеяния на сильно поглощающих свет биочастицах (хлоропласты, эритроциты и др.) обусловлен явлением аномальной дисперсии, то есть избирательным рассеянием света в области полос поглощения пигментов, содержащихся внутри этих частиц /43, 58, 65, 85, 109, 126, 127, 136, 212/. Что касается хлоропластов, то характер селективного светорассеяния ими в значительной степени зависит от их структурной целостности и физико-химических свойств среды окружения /54, 60, 65, 85, 204, 217/. Показано, что явление аномальной дисперсии вносит существенный вклад в фотоиндуцированные изменения светорассеяния хлоропластами и отражает внутрихлоропластные структурные изменения /54,60, 85, 204, 217, 227/.
Таким образом, под разными углами приема на интенсивность светорассеяния изолированными хлоропластами самое различное влияние могут оказывать такие факторы, как: исходный размер хлоропластов, их форма /130, 132/ и структурные неоднородности, рефрактивный индекс этих органелл и среды их окружения, абсорбция ими света, гетерогенность по размеру и форме хлоропластов, их ориентация /132/, длина волны измеряющего света, угловое разрешение фотометра (т.е. его конструктивные особенности) /129/ и др.
Многие годы основным тестом на структурное состояние
хлоропластов явля лея их объем как наиболее доступный для прямого измерения. Поэтому даже при использовании таких непрямых методов анализа, как фотометрические, для изучения светозависимых объемно-структурных изменений хлоропластов интерпретация результатов традиционно осуществлялась в терминах их фотосокращения и фотонабухания. Проведенный выше анализ методов регистрации объемно-структурных изменений хлоропластов, а также природы и характера светорассеяния в этой связи показывает, что изменения внутренней структуры хлоропластов не всегда могут отражаться на их объеме (форме). Хотя характер изменений светорассеяния хлоропластами, как сейчас очевидно, не всегда совпадал с истинным характером их объемных изменений, из этого анализа следует, что изменения в структуре хлоропластов на молекулярном, надмолекулярном и мембранном уровнях могут оказывать влияние на интенсивность светорассеяния этими органеллами. Поэтому представляется более целесообразным использовать в качестве основного теста на структурные изменения хлоропластов изменение ими светорассеяния. Тем более, что не объем хлоропластов, а именно их внутреннее структурное состояние в данный момент непосредственно определяет функциональную активность хлоропластов.
Влияние условий инкубации на фотоиндуцированные объемно-структурные изменения хлоропластов in vitro и in vivo
Переход к опытам in vitro открыл возможность решения вышеуказанных задач, так как позволил последовательно проводить модификацию исходного структурного состояния хлороплас-тов воздействием различными факторами (температурой, концентрацией водородных ионов, концентрацией солей и др.) при одновременном варьировании интенсивности и спектрального состава актиничного света.
Изучение in vitro и in vivo спектра действия фотоинду-цированных объемно-структурных изменений хлоропластов различных видов растений, а также влияние на эти изменения интенсивности актиничного света, показало, что они тесно связаны с поглощением света пигментными системами фотосинтетического аппарата хлоропластов /69, 76, 89, 98, 101, 102, 116, 122, 145, 168, 173, 175, 191, 201, 230-235/.
Фотосокращение хлоропластов наблюдали (in vitro и in vivo ) при возбуждении во всей видимой области (400 700 нм) с максимумами в синей и красной полосе спектра действия. Иными словами, спектр действия фотосокращения совпадает со спектром поглощения фотосинтетических пигментов хлоропластов /5, 76, 98, 116, 172, 173, 231, 232/.
Относительно спектра действия фотонабухания в литературе нет достаточно исчерпывающих данных. Некоторые исследователи наблюдали in vitro данный тип объемно-структурных изменений хлоропластов в красной СЛ 600 нм) области видимого спектра при различной интенсивности актиничного света /47, ИЗ, 191, 198, 220, 228/. Другие индуцировали набухание хлоропластов in vitro белым светом с уровнем освещенности порядка 1,2 3,5 Ю4 лк /157, 193, 194, 209, 211/.
Были проведены сравнительные опыты по действию голубого и красного света различной интенсивности на размер, форму и внутреннюю структуру хлоропластов in vitro и in vivo /89, 163, 230-235/. in vitro голубой ( мах#=484 нм) свет низкой интенсивности (2,5 3,3 10 эрг/сьг сек) вызывал увеличение поверхности хлоропластов, а при высоких его интенсивностях (8«Пг 5«105 эрг/см2»сек) наблюдалось ее уменьшение. Красный свет ( мах#=бб8 нм) при всех интенсивностях вплоть до 8«Ю5 эрг/см2»сек индуцировал только увеличение поверхности хлоропластов /231, 232/. in vivo было измерено поперечное сечение хлоропластов при изменении интенсивности голубого (370 500 нм) и красного (600 850 нм) света /233/. При возрастании интенсивности красного света от 0,06 Вт/м2 до 400 Вт/м2 наблюдалось увеличение поверхности хлоропластов с одновременным уменьшением их толщины. Это параллельно приводило к уменьшению объема хлоропластов примерно на 10% как при высокой, так и при низкой интенсивности освещения в указанном диапазоне. В случае голубого света подобный эффект наблюдался лишь при низкой его интенсивности (0,06 Вт/м2). При высоких интенсивностях (400 Вт/м2) голубого света происходило значительное уменьшение поверхности хлоропластов, а также их объема (на 35%) по сравнению с темновым контролем. Как в случае красного, так и голубого света наблюдаемые изменения конфигурации и объема хлоропластов были обратимыми при выключении актиничного света /233/.
Изменения поверхности хлоропластов в интактных клетках листьев шпината вызывались /89/ голубым (370 500 нм) и красным (600+850 нм),светом с интенсивностью от Ю2 эрг/см2 сек до 5-Ю5 эрг/см2»сек. Красный свет приводил к увеличению по-верхности хлоропластов от 11,9 до 19,4 пропорционально интенсивности и времени (до 2-х часов) освещения. Низкая интенсивность (10 эрг/см2»сек) голубого света вызывала увеличение поверхности (до 12,5/ 2) хлоропластов по сравнению с темновым контролем (11,9/л-2), а высокие его интенсивности (5-Ю5 эрг/см2«сек) заметно уменьшали (до 7,5/-2) ее /89/.
Показано /235/, что голубой и красный свет высоких ин-тенсивностей (30 нЭйн/см2»сек) оказывают противоположное влияние на объем и форму хлоропластов. На красном свету наблюдалось увеличение поверхности хлоропластов, а голубой свет стимулировал ее уменьшение в течение двух часов непрерывного освещения. За этот период времени происходило уменьшение объема хлоропластов на голубом свету и увеличение его на красном. Однако в течение первых 30 минут освещения в обоих случаях (голубой и красный свет) объем хлоропластов сначала уменьшался. А затем на красном свету наступала фаза медлен- -ного набухания хлоропластов. При низких интенсивностях (до 3 нЭйн/см2»сек) голубого и красного света характер изменений объема хлоропластов был одинаковым. В этих условиях за первые 30 минут освещения хлоропласты максимально сокращались, и в дальнейшем (в течение 2-х часов наблюдений) их объем не менялся /235/.
Исследованиями обоих типов объемно-структурных изменение хлоропластов in vitro и in vivo выявлено, что они отличаются друг от друга по кинетике и обратимости в зависимости от рН среды, температуры и др. Амплитуда фотооокращения сильно зависит от рН среды (максимальная при рН 5,5 6,5), а фо-тонабухания - слабо, хотя его максимум наблюдался при рН 7,8 8,0/5, 70, 76, 102, 160, 180, 184, 191, 198, 210, 222/.
Фотонабухание хлоропластов более чувствительно к температуре инкубации (степень и скорость возрастают с увеличением температуры), чем фотосокращение (уменьшается с увеличением температуры) в области физиологических температур от +5С до +35С /103, 150, 168, 191, 198, 216). Однако для фотосокращения хлоропластов как in vitro, так и in vivo оптимальной является температура +20 25С /150, 172), а в некоторых случаях - +30 35С /2/. При изучении реакции гран на свет с изменением температуры от +18С и ниже показано, что их фотосокращение сменяется фотонабуханием /74/.
К числу химических веществ, действие которых на указанные процессы было исследовано, относятся кофакторы электронного транспорта, его ингибиторы и разобщители, кофакторы фо-тофосфорилирования, ионный состав реакционной среды и др.
Методы изучения фотоиндуцированных объемно-структурных изменений хлоропластов in vitro и in vivo
Огромный интерес исследователей во всем мире к фотоструктурным изменениям хлоропластов в значительной мере определил многообразие используемых в лабораториях методов исследования этого явления: микроскопии (световая и электронная), кондуктометрии (счетчик Коултера), гравиметрии (метод микрокапилляров), вискозиметрии, нефелометрии и турбидиметрии. Поскольку in vivo применимость различных методов исследования сильно затруднена, большинство опытов по регистрации изменений объема и структуры хлоропластов проведено исследователями in vitro. При этом всегда оставалось существенно важным определение степени соответствия, фактов, полученных in vitro И in vivo.
Сравнительные исследования высокоамплитудного фотонабухания и низкоамплитудного фотосокращения хлоропластов in vitro с помощью электронной микроскопии, турбидиметрии, нефелометрии, гравиметрии и кондуктометрии /68, 70, 109, 193, 194/ показали, что в большинстве случаев эти методы дают почти идентичную информацию о фотоструктурных изменениях хлоропластов. Наблюдались лишь различия в кинетике изменений процессов, изучаемых каждым из данных методов. Хотя совпадение результатов получаемых разными методами анализа достаточно велико, каждый из них имеет определенные преимущества и недостатки при сравнении друг с другом /188/.
Например, нефелометрический метод анализа является достаточно "мягким", то есть практически не нарушает нативность хлоропласта. Но этот метод не позволяет непосредственно измерять размер частицы, так как интенсивность светового потока, рассеиваемого частицей, одновременно определяется несколькими физическими явлениями, которые, в свою очередь, отражают не только изменение размера или формы частицы, но и ее рефрактивного индекса. Поэтому данные по нефелометрии в этом аспекте требуют сопоставления результатов с информацией, получаемой другими методами анализа /188/.
Кондуктометрический метод более статичен по своему принципу действия по сравнению с турбидиметрией или нефеломерией и не дает полной определенности в том, что размер биочастиц измеряется точно, например, вследствие эффектов их агрегации /151, 188/. На измерения этим более прямым методом, чем фотометрические, могут оказывать некоторое влияние поверхностный заряд биочастиц и их электропроводность /107, 149/.
На применение метода микрокапилляров накладываются определенные ограничения потребностью довольно высоких концентраций хлоропластов и специального центрифугирования, в процессе которого образец освещается. Следовательно, данный метод применим при наличии больших количеств экспериментального материала. Однако в концентрированных суспензиях нарушаются условия нормального функционирования хлоропластов, например, из-за неравномерного их освещения и др. /188/.
Расхождения по знаку данных о фотоиндуцированных объемно-структурных изменениях хлоропластов, полученных с помощью нефелометрии, турбидиметрии, гравиметрии, кондуктометрии и электронной микроскопии, были зарегистрированы в опытах с различным ионным составом инкубационной среды /68, 70, 71/.
Для случая низкоамплитудного обратимого фотосокращения хлоропластов в присутствии Na-ацетата и ФМС наблюдалось увеличение светорассеяния при у =90, абсорбции и уменьшение столбика осадка отцентрифугированных (метод микрокапилляров) хлоропластов /71/, то есть наблюдалось полное соответствие данных по всем используемым методам. Однако в среде с наСІ увеличение размера хлоропластов на свету, регистрируемое электронной микроскопией, кондуктометрией и гравиметрией, сопровождалось незначительным усилением светорассеяния при J =90 и уменьшением абсорбции. По данным кондуктометрии и метода микрокапилляров, в присутствии хлористого аммония ОтНьСІ) на свету регистрировалось резкое увеличение объема хлоропластов, сопровождаемое уменьшением абсорбции и отсутствием изменений в светорассеянии при jf =90 /71/. В этих опытах наблюдения с помощью электронного микроскопа показали, что на свету: а) в среде с яа-ацетатом хлоропласты выглядели сильно сплющенными, а граны сильно сжатыми по сечению; б) в среде с яН СІ хлоропласты были сильно набухшие, часть гран исчезла, а остальные набухли; в) в среде с NaCI хлоропласты оказались набухшими, а часть гран была либо слегка сжата по сечению или они частично исчез ли /71/.
По смещению пика кривой распределения по размеру (кон-дуктометрический метод) хлоропластов шпината был сделан вывод, что хлоропласты в условиях фотофосфорилирования сокращаются на свету /109/. Это подтверждалось и результатами, полученными с помощью метода микрокапилляров и вискозиметрии /109, 151/. Показано, что вязкость суспензии хлоропластов шпината обратимо уменьшалась на свету и восстанавливалась в темноте /151/. Однако при непосредственном сопоставлении результатов наблюдались заметные расхождения в скоростях между изменениями параметров, регистрируемых различными методами исследования.
Влияние некоторых условий инкубации хлоропластов на характер их фотоструктурной реакции
На рис. 3 и 4 представлены экспериментальные данные по влиянию на светорассеяние суспензией хлоропластов красного актиничного света различного спектрального состава в присутствии ФМС, ФМН, MB и MgCL). Как видно из кривых, изображенных на этих рисунках, изменения светорассеяния являются двухфазными. При включении актиничного света ( с А 670 нм) интенсивность светорассеяния (рис. 3-І) первоначально быстро уменьшается (первая компонента кривой). Если после насыщения этого процесса свет выключить, интенсивность светорассеяния вновь, примерно с такой же кинетикой, уменьшается с выходом на стационарный уровень (темновая релаксация второй компоненты). Последующее включение света приводит к обратимому в темноте увеличению светорассеяния (вторая компонента кривой). Принципиально то же самое видно и из кривых 2 и 3 на рис. 3. Однако, если в момент насыщения первой компоненты актиничный свет не выключать, то уменьшение светорассеяния постепенно сменяется противоположным процессом.
Аналогичные результаты получены в опытах, где актиничный свет с широким спектральным интервалом (Л 670 нм) был заменен на свет узкой полосы (дЛ=12 нм) с максимумом при Л=663 нм (рис. 4). Следовательно, ближний красный свет с узким спектральным интервалом не вносит принципиальных изменений в картину светорассеяния хлоропластами в рассмотренных выше условиях их инкубации.
Таким образом, общая картина функционально обусловленных изменений светорассеяния хлоропластами всегда является результатом взаимодействия двух указанных выше компонент, которые можно разделить в эксперименте, попеременно включая и выключая актиничный свет.
Если же свет относительно продолжительное время не выключать, то сложение двух компонент светозависимых изменений светорассеяния суспензией хлоропластов выглядит так, как это представлено на рис. 5. Видно, что падение светорассеяния под Jf =90 (увеличение светопропускания) со временем насыщается, и затем меняет направление на противоположное. Нам представляется, что в данных условиях эксперимента в начале освещения превалирующий вклад в изменения светорассеяния связан с первой компонентой, а в последующем он перекрывается вкладом второй.
Из рассмотренных выше рисунков следует, что в идентичных условиях инкубации хлоропластов в присутствии ФМС, ФМН и МБ картина индуцируемых светом изменений светорассеяния одинаковая. Как известно /I, 21, 46, 203, 225/, в аэробных условиях электронный транспорт с этими кофакторами осуществляется с участием двух фотосистем. Условия освещения в нашем эксперименте также обеспечивали включение обеих фотосистем.
Из двух компонент фотоиндуцированных изменений светорассеяния, представленных на рис. 3 и 4, вторая соответствует известным в литературе /52, 68, 70, 77, I08-II0, 179, 187, 190, 191, 198, 208, 211/ фактам, интерпретируемым как фотосокращение целых хлоропластов. Первая же компонента требует более обстоятельного рассмотрения. С одной стороны, она в значительной степени соответствует литературным /33, 47, 70, 170, 191, 194, 209, 210/ фактам, известным как фотонабухание целых хлоропластов. Однако, как мы уже отмечали, фотонабухание хлоропластов имеет место только при их суспендировании в солевых растворах /70, 71, 146, 157, 191, 193, 194, 198,209/.
Типичное фотонабухание хлоропластов /168, 190, 191, 193, 194, 209, 210/ весьма существенно отличается по кинетике от первой компоненты активированных светом изменений светорассеяния. Если насыщение изменений светорассеяния достигается за 3-5 минут (рис. 3, 4, 5-І), то процесс фотонабухания хлоропластов завершается в течение примерно I часа /190, 191, 193, 194, 209, 210/. Однако следует учесть тот факт, что наши исследования выполнены на хлоропластах гороха, в то время как данные по истинному фотонабуханию получены на хлоропластах шпината. Возможно, что в этом заключается причина расхождения в кинетике процессов.
Аналогичные исследования /168/, выполненные годом позже (1956 г.) также на хлоропластах шпината, показали, что при продолжительном освещении (более I часа) фотонабухание хлоропластов сменяется фотосокращением. В этой работе показано также, что фотонабухание хлоропластов имеет место в на порядок менее концентрированных растворах їїаСІ (0,035М), чем это наблюдали ранее /191, 193, 194, 211/.
Фотоструктурные изменения хлоро-пластов и транспорт электронов на участках электрон-транспортной цепи первой и второй фотосистем
Под действием красного актиничного света с широкой спектральной полосой (Л 600 нм) при Ло=470 и 510 нм наблюдается (рис. 24) противофазность изменений оветопропускания и светорассеяния. При выключении действующего света све-топропускание при Ло=510 нм (рис. 24-1) незначительно уменьшается, а при Ло=470 нм (рис. 24-2) оно не меняется. Одновременно с этим как при Ло=510 нм (рис. 24-3), так и при Л,=470 нм (рис. 24-4) наблюдается небольшое и почти одинаковое по амплитуде понижение уровня светорассеяния. Если вторично включить актиничный свет, то светопропуекание изменяется аналогично, как и при первоначальном освещении хло-ропластов, но с меньшей амплитудой, а интенсивность светорассеяния почти не изменяется.
Расхождение в знаках изменений оветопропускания и светорассеяния при выключении актиничного света можно объяснить разной степенью проявления второй и первой компонент фотоструктурных изменений хлоропластов при регистрации под этими двумя углами. При попарном сопоставлении амплитуд изменений оветопропускания (рис. 24-1,2) и светорассеяния (рис. 24-3,4) при Ло=510 нм и Ло=470 нм видно, что в первом случае ( -==0) она примерно в два раза больше. Аналогичная зависимость наблюдается и для Ло=702 и 663 нм при % =0 (рис. 25-2,4).
В случае, когда хлоропласты освещаются голубым (350 Л -600 нм) светом интенсивности порядка 2 102 Вт/м2 (рис. 25-1,3), наблюдается более чем двухкратное увеличение амплитуды изменений оветопропускания по сравнению с красным (Л 600 нм, 1=60 Вт/м2) светом (рис. 25-2,4). Кроме того, значительно. возрастает их обратимость. В остальном же характер светопро-пускания не меняется.
Поскольку основной уровень изменений светопропуекания (10) при длинах волн измеряющего света Ло=470 и 663 нм не меняется в противофазе по отношению к Л =510 и 702 нм, как это должно было бы иметь место в случае наличия изменений объема целых хлоропластов, а также частично внутренних ком-партментов (гран) вследствие проявления эффекта "сита", можно полагать, что наблюдаемая зависимость первой компоненты от длины волны измеряющего света обусловлена преимущественно явлением селективного светорассеяния, отражающим структурные изменения мембран хлоропластов.
Таким образом, наблюдаемая в эксперименте зависимость фотоиндуцированных изменений светопропускания и светорассеяния изолированными хлоропластами от длины волны измеряющего света и угла его регистрации свидетельствует, что они отражают одновременно объемно-структурные изменения нескольких уровней организации хлоропластов. С целью более однозначного решения этого вопроса несколько позже будут рассмотрены данные опытов, выполненных с изолированными гранами.
Поскольку фотоструктурные изменения хлоропластов наблюдаются только при наличии условий для электронного транспорта, естественно предположить, что они тесно связаны с переносом электронов в фотосинтетической электрон-транспортной цепи хлоропластов. Рядом авторов /71, 72, 76, 98, 99, 144, 173, 191,І 208, 211, 216/ выполнены специальные исследования по выяснению механизма активируемых светом объемно-структурных изменений хлоропластов. Поскольку кофактором электронного транспорта в этих опытах являлся ФМС, предполагается /76, 98, 99, 112, 122, 144, 173, 208, 214/» что фотосокращение хлоропластов сопряжено с работой ФС-І и обусловлено переносом электронов в циклической ЭТЦ.
Анализ приведенных выше наших экспериментальных данных (рис. 3 7, II, 20 22) показывает, что в присутствии ФМС в зависимости от условий инкубации хлоропластов можно наблюдать целую гамму их фотоструктурных изменений. "Фотосокращение" хлоропластов (проявление второй компоненты изменений светопропускания или светорассеяния) имело место (рис. 11,22) только в отдельных случаях. В большинстве же случаев наблюдается (рис. 3f7, 20, 21) развитие одновременно двух процессов: как "фотосокращения", так и "фотонабухания" (проявление первой компоненты изменений светопропускания или светорассеяния) хлоропластов. Соотношение этих компонент в каждом отдельном случае может изменяться и, в конечном счете, определять общий характер кривых изменений светопропускания или светорассеяния суспензией хлоропластов под действием актиничного света.
Поскольку кривые фотоиндуцированных изменений светопропускания или светорассеяния оказались в сущности не однокомпонентними, а двухкомпонентными, то, рассуждая в общепринятых терминах, следует признать, что хлоропласты на свету способны, по-видимому, осуществлять одновременно два процесса - "фотосокращение" и "фотонабухание". Поэтому появляется необходимость изучить, с каким участком электрон-транспортной цепи хлоропластов связано проявление первой компоненты их фотоструктурных изменений.
Как полагают исследователи, различие между фотосокращением и фотонабуханием хлоропластов заключается лишь в том, что первый процесс сопряжен с использованием макроэргов, образованных в процессе электронного транспорта /109, 179, 187, 190, 194-/» а второй - с электрогенным переносом ионов внутрь тилакоидов хлоропластов в обмен на протоны /31, 33, 68, 70, 157/. Следовательно, все концепции, касающиеся фотоструктурных изменений хлоропластов, включают протонирование внутрити-лакоидного пространства как основную движущую силу этих изменений и предполагают, что она реализуется в процессе образования мембранного протонного градиента и последующей индукции с его помощью градиента осмотических сил. Это позволяет объяснить как "фотосокращение", так и "фотонабухание" хлоропластов при условии, что оба процесса осуществляются последовательно, причем "фотосокращение" должно было бы всегда предшествовать "фотонабуханию". Наши же опыты показывают, что оба эти процесса, по-видимому, развиваются параллельно.
