Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Гипоталамо-гипофизарная регуляция репродуктивной функции женского организма 16
1.2. Роль пинеальной железы в регуляции репродуктивной функции 40
1.3. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивной функции 50
1.4. Изменение содержания пинеального мелатонина при старении 57
1.5. Влияние пептидных биорегуляторов на репродуктивную функцию 61
1.6. Воздействие экзогенных нейротоксических ксенобиотиков толуола и 1,2-диметилгидразина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной системы 66
1.7. Воздействие эндогенного нейротоксического ксенобиотика L-гомоцистеина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции 82
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 92
2.1. Животные 92
2.2. Реактивы и препараты 92
2.3. Общая схема эксперимента 94
2.4. Выделение и препарирование структур мозга, осуществляющих регуляцию эстральных циклов 98
2.5. Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методом 100
2.6. Определение уровня половых гормонов в сыворотке крови радиоиммунологическим методом 101
2.7. Определение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием 102
2.8. Определение уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови иммуноферментным методом 103
2.9. Определение уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозга методом люминолзависимой хемилюминесценции 103 2.10. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с 2-тиобарбитуровой кислотой спектрофотометрическим методом 104
2.11. Определение содержания нитритов в сыворотке крови спектрофотометрическим методом 105
2.12. Определение моноаминооксидазной активности в структурах мозга спектрофотометрическим методом 105
2.13. Определение содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеси турбидиметрическим методом 106
2.14. Статистическая обработка результатов 107
ГЛАВА 3. Результаты исследования и обсуждение результатов 108
3.1. Содержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и уровень половых гормонов в крови на различных стадиях эстрального цикла 108
3.2. Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла 111
3.3. Циркадианный характер динамики содержания биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса 128
3.4. Влияние ксенобиотика 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса 133
3.5. Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса 135
3.6. Влияние метиониновой нагрузки (гипергомоцистеинемии) на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса 147
3.7. Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина, толуола и метиониновой нагрузки на образование активных форм кислорода в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови 152
3.8. Коррекция с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов нарушения катехоламинергической регуляции эстральных циклов, вызванного нейротоксическим воздействием (1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка) 157
3.9. Изменение катехоламинергической регуляции эстральных циклов у животных различных возрастных групп 169
3.10. Влияние мелатонина и эпиталона на динамику эстральных циклов у молодых и старых животных при различных световых режимах 175
Заключение 181
Выводы 192
Практические рекомендации 194
Список сокращений 194
Список литературы
- Изменение содержания пинеального мелатонина при старении
- Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методом
- Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла
- Коррекция с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов нарушения катехоламинергической регуляции эстральных циклов, вызванного нейротоксическим воздействием (1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка)
Изменение содержания пинеального мелатонина при старении
В литературе имеются данные о том, что глутаминовая кислота активирует норадренергические нейроны медиобазального гипоталамуса, что приводит к активации нейрональной NO-синтазы с образованием оксида азота (II). Последний, выделяясь из клетки диффузно и взаимодействуя с гонадолиберинергическими нейронами, стимулирует секрецию ГнРГ посредством активации гуанилатциклазы и циклооксигеназы [Caka J., 2006]. По мнению других авторов, хотя гонадолиберинергические нейроны и иннервируются напрямую глутаматергическими процессами [Goldsmith P. C. et al., 1994; Hrabovszky E. et al., 2012], N-метил-D-аспарагиновая кислота (NMDA) едва ли напрямую воздействует на гонадолиберинергические нейроны с целью высвобождения ГнРГ, поскольку лишь очень незначительная субпопуляция этих клеток продуцирует соответствующие рецепторы на протяжении всего препубертатного развития [Gore A. C. et al., 1996; Iremonger K. J. et al., 2010]. Вместо этого глутаматергические нейроны, по-видимому, используют каинатные рецепторы для прямой регуляции секреции ГнРГ, как это происходит в случае активации многих других нейросекреторных нейронов гипоталамуса [van den Pol A. N., Wuarin J.-P., Dudek F. E., 1990; Christian C. A., Pielecka-Fortuna J., Moenter S. M., 2009]. Стимуляция этих рецепторов усиливает секрецию ГнРГ из СВ гипоталамуса in vitro [Donoso A. O., Lpez F. J., Negro-Vilar A., 1990]. Образующийся в мозге из холестерина и других предшественников дигидроэпиандростерон (конвертируемый в тестостерон, который затем, как известно, под влиянием ароматазы Р450 преращается в эстрадиол) способен стимулировать NMDA-глутаматные рецепторы и модулировать другие нейромедиаторные системы (НА, ДА, 5-ОТ, вазопрессин, окситоцин и т.д.), связываясь с внутриклеточными цитоплазматическими и ядерными рецепторами и воздействуя на генную экспрессию рецепторов нейромедиаторов и нейропептидов, что в результате также может приводить к стимуляции синтеза и секреции ГнРГ [Моренков Э. Д., Петрова Л. П., 2009]. Дигидроэпиандростерон также является антагонистом ГАМК-рецепторов типа А, а синтез ароматазы, активность которой коррелирует с содержанием ГнРГ в медиобазальном гипоталамусе [Roselli C. E., Liu M., Hurn P. D., 2009], контролируется гонадотропными гормонами аденогипофиза и глутаминовой кислотой. При этом эстрадиол и глутаминовая кислота выступают в гипоталамусе антагонистами: глутаминовая кислота через NMDA-рецепторы активирует Ca2+-зависимый экзоцитоз вазопрессина и окситоцина, а эстрадиол через свои -рецепторы подавляет эффект глутаминовой кислоты [Somponpun S., Sladek C. D., 2002; Чернышева М. П., Коваленко Р. И., 2009].
Нейропептид Y также активно вовлечен в процесс транссинаптического контроля полового созревания у крыс [Ojeda S. R., Terasawa E., 2002]. Так, содержание нейропептида Y в целом гипоталамусе увеличивается у крыс после рождения и достигает максимальных значений к моменту наступления половой зрелости [Sutton S. W. et al., 1988]. Однократное интравентрикулярное введение нейропептида Y ускоряет открытие влагалища у молодых крыс и наступление первой овуляции у этих животных [Minami S. et al., 1990; Roa J., 2013].
Недавние исследования показали, что другой пептид, кисспептин (метастин), продуцируемый геном kiss-1 в антеровентральных перивентрикулярных и аркуатных адрах гипоталамуса [Ohtaki T. et al., 2001; Kotani M. et al., 2001; Clarkson J., Herbison A. E., 2011] и являющийся лигандом рецептора GPR-54 [Muir A. I. et al., 2001; Kauffman A. S., Clifton D. K., Steiner R. A., 2007; Hanchate N. K. et al., 2012], активно стимулирует секрецию ГнРГ как у грызунов [Navarro V. M. et al., 2009], так и у обезьян [Ramaswamy S., Gibbs R. B., Plant T. M., 2009; Smith J. T. et al., 2010] и овец [Smith J. T. et al., 2011].
Противоречивой на сегодняшний день остается гипотеза о прямом действии на гонадолиберинергические нейроны синтезируемого в жировой ткани и секретируемого в общий кровоток еще одного пептида – лептина. Лептин может стимулировать секрецию ГнРГ посредством возбуждающих и тормозных нейрональных субпопуляций, синаптически связанных с гонадолиберинергическими нейронами [Watanobe H., 2002; Reynoso R. et al., 2003; Seth A. et al., 2004; Louis G. W. et al., 2011; Roa J., 2013]. Поскольку лептин может синтезироваться в нейронах гипоталамуса крысы [Morash B. et al., 1999], вполне возможно допустить его участие в процессах, регулирующих секрецию ГнРГ посредством транссинаптических механизмов.
Норадренергические нейроны также играют важную роль в контроле импульсной секреции ГнРГ в качестве посредников стимулируемого половыми гормонами преовуляторного выброса ЛГ и ФСГ у грызунов [Barraclough C. A., Wise P. M., 1982; Ramirez V. D., Feder H. H., Sawyer C. H, 1984; Kalra S. P., 1986]. Не исключено, что НА в преовуляторный период эстрального цикла может изменять активность дофаминсодержащих нейронов, локализованных в области СВ-Арк гипоталамуса. Есть данные о том, что ДА участвует в контроле циклической секреции ЛГ, активируя процесс секреции ГнРГ из нервных окончаний на уровне СВ гипоталамуса [Бабичев В. Н., 2005].
С другой стороны, были получены убедительные доказательства того, что наступлению полового созревания у самок крыс предшествует постепенное снижение тормозного влияния ГАМК, секретируемой из МПО гипоталамуса [Goroll D., Arias P., Wuttke W., 1993; Moguilevsky J. A., Wuttke W., 2001], а гонадотропин-ингибирующий гормон быстро подавляет секрецию ЛГ у крыс, мышей и хомяков [Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009]. Опиоидные пептиды также подавляют импульсную секрецию ЛГ, а антагонист опиоидных рецепторов налоксон препятствует возникновению эффекта отрицательной обратной связи, вызываемого влиянием эстрадиола на высвобождение ЛГ и ФСГ у взрослых особей [Devorshak-Harvey E., Bona-Gallo A., Gallo R. V, 1987; Evans W. S. et al., 1992]. Глиальные клетки также регулируют секрецию ГнРГ, посредством двух связанных друг с другом механизмов, требующих участия факторов роста [Ojeda S. R. et al., 2000; Prevot V. et al., 2007].
Другой сигнал, критически необходимый для осуществления преовуляторной секреции ГнРГ, имеет нейрональную природу и ежедневно поступает от центрального циркадианного осциллятора, супрахиазматических ядер (СХЯ) гипоталамуса, к нейрональным структурам, ответственным за синтез и секрецию этого нейрогормона [de la Iglesia H. O., Schwartz W. J., 2006; Tonsfeldt K. J., Chappell P. E., 2012], (рисунок 1.2). Исследование данного вопроса в прошлом столетии проводилось многими учеными в разных странах мира. Одними из первых, кому удалось найти экспериментальные доказательства существования данного механизма, были Дж. Эверетт и Ч. Сойер. В 1950 г. ими были опубликованы данные об открытии довольно непродолжительного периода времени, являющегося критическим для осуществления преовуляторного пика секреции ГнРГ у крыс. Блокируя секрецию нейрогормона барбитуратами в первую половину дня проэструса (в 14 ч), они наблюдали его выброс лишь с 24-часовым опозданием [Everett J. W., Sawyer C. H., 1950], причем применение барбитуратов спустя всего два часа (в 16 ч) оказывалось уже неэффективным. Позднее, в 1970-х гг., были проведены исследования, которые подтвердили вовлеченность циркадианной системы в регуляцию репродуктивной функции. Данные исследования проводились на овариэктомированных животных, у которых искусственно поддерживался постоянно высокий уровень половых гормонов. В этих условиях пики секреции ГнРГ возникали также с опозданием ровно в 24 ч [Legan S. J., Coon G. A., Karsch F. J., 1975; Legan S. J., Karsch F. J., 1975; Plas-Roser S., Hassani M., Aran C., 1977].
Ряд исследований того же периода связан с изучением влияния изменяющегося светового режима на секрецию ЛГ [Colombo J. A., Baldwin D. M., Sawyer C. H., 1974; McCormack C. E., Sridaran R., 1978]. Работы в этом направлении продолжаются и по сей день. Накоплен большой экспериментальный материал о синхронизации репродуктивных циклов с уровнем освещенности. Так, было установлено, что в условиях световой депривации нормальная эстральная функция сохраняется, тогда как при удлинении светового режима или в условиях постоянного освещения происходят различные нарушения в реализации репродуктивной функции, а именно: увеличение продолжительности эстрального цикла и даже развитие персистирующего эструса у мышей и крыс, снижение содержания ЛГ и увеличение содержания ФСГ в гипофизе крыс, повышение порога чувствительности гипоталамуса к действию половых гормонов по механизму отрицательной обратной связи у самок крыс, у женщин – укорочение продолжительности менструального цикла, появление на протяжении суток двух укороченных пиков секреции ЛГ вместо одного [Swann J. M., Turek F. W., 1985; Анисимов В. Н., Виноградова И. А., 2008]. При этом репродуктивная функция в условиях постоянного освещения оказывалась более уязвимой по сравнению с локомоторной яктивностью и температурой тела экспериментальных животных. Так, в ранних работах было показано, что нормальная эстральная функция самок крыс нарушалась при помещении животных в условия постоянного освещения всего на три дня, тогда как циркадианный ритм локомоторной активности сохранялся в течение двух месяцев и окончательно пропадал спустя лишь три месяца содержания животных в условиях постоянного освещения
Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методом
ГЦ и гомоцистеновая кислота относятся к известным факторам риска развития сердечнососудистых и нейродегенеративных заболеваний, и высокий уровень содержания этих соединений в периферической крови (ГГЦ) является опасным проявлением дизрегуляции метаболизма, оказывающим особо разрушительное действие на развивающийся организм [Bayadas G. et al., 2007; Махро А. В. и соавт., 2008]. Однако механизм повышения содержания этих опасных эндогенных ксенобиотиков в крови пока остается недостаточно изученным, в связи с чем исследователи используют различные экспериментальные модели для изучения влияния ГГЦ на физиологические и биохимические показатели структур мозга.
Экспериментальная ГГЦ является наиболее распространенным инструментом исследования механизмов нейротоксичности ГЦ. В ранних работах ГГЦ индуцировали путем введения животным производных ГЦ, в частности S–аденозил–L–гомоцистеина [Fonlupt P., 1979]. Впоследствии было установлено, что ГЦ, образуемый в процессе метаболизма L-метионина, может достигать высокого уровня в компартментах клетки, недоступных для экзогенного ГЦ [Sauls D. L. et al., 2007]. Поэтому внутриклеточный уровень метаболически генерируемого ГЦ в различных органах, в том числе и в нервной системе, может значительно превышать его содержание при экзогенном введении ГЦ, даже несмотря на повышенный уровень ГЦ в крови. По этой причине в последующем стали широко применяться экспериментальные модели ГГЦ, основанные на хроническом введении животным L-метионина (метиониновая нагрузка).
Наиболее распространенным способом метиониновой нагрузки является потребление животными в хроническом эксперименте L-метионина с питьевой водой. При использовании этой модели ГГЦ был получен ряд интересных данных, раскрывающих молекулярные механизмы нейротоксичности ГЦ. Так, было установлено, что ГГЦ вызывает повышение чувствительности нервных клеток к эксайттоксическому окислительному повреждению in vivo и in vitro [Streck E. L. et al., 2003; Bayadas G. et al., 2006; Boldyrev A., 2010]. По другим данным, у крыс, находящихся на диете с высоким потреблением L-метионина, снижено содержание 5-ОТ и ДА в коре головного мозга [Gao L. et al., 2012]. После интраперитонеального введения самцам мышей ГЦ в дозе 0,5-1.0 г/кг (1 раз/день, 36 дней) наблюдалось повышение в стриатуме в среднем на 30% уровня ГЦ, а также достоверное снижение уровня 3,4-ДОФУК и ГВК в этой структуре (но не в коре и гиппокампе), а также снижение уровня иммунореактивности к тирозингидроксилазе в черной субстанции [Lee E.-S. Y. et al., 2005]. Через 19 дней после однократного интранигрального введения ГЦ (0,25-1,00 мкМ) самцам крыс в стриатуме наблюдалось снижение уровня ДА, 3,4-ДОФУК и ГВК, которое при введении ГЦ в дозе 1 мкМ сопровождалось уменьшением числа иммуноположительных к тирозингидроксилазе нейронов в стриатуме и черной субстанции [Chandra G. et al., 2006]. При этом уровень 5-ОТ и 5-ОИУК в стриатуме не претерпевал значительных изменений. Введение ГЦ (1 мкМ) в дорсальное ядро также не приводило к изменению содержания 5-ОТ, НА и ДА в стриатуме, черной субстанции, гипоталамусе, мозжечке, коре мозга и спинном мозге. Продолжительное потребление L-метионина с пищей (стандартное питание с добавлением 1,7% L-метионина в течение шести недель) вызывыло у крыс повышение уровня ГЦ в крови (около 5,0 мкМ) по сравнению с контролем (около 3,2 мкМ), сопровождающееся снижением уровня ДА и 3,4-ДОФУК, 5-ОТ и 5-ОИУК в медиальной зоне префронтальной коры, а также уровня 3,4-ДОФУК и 5-ОИУК в гиппокампе [Gao L. et al., 2012].
Другие исследователи, используя модель ГГЦ, вызванную диетой с дефицитом фолиевой кислоты, также отмечали изменения метаболизма моноаминов и снижение содержания глутатиона в мозге животных [Kronenberg G. et al., 2008]. У больных, страдающих нейропсихическими заболеваниями, обнаружено снижение уровней 5-ОИУК, ГВК и 3-метокси-4-гидроксифенилгликоля в спинномозговой жидкости [Bottiglieri T. et al., 2000]. У самок крыс, находившихся в течение 38 дней на диете с отсутствием фолиевой кислоты, наблюдалось значительное повышение уровня ГЦ в крови (125 мкМ) по сравнению с контролем (9 мкМ). Изучение уровней биогенных аминов (НА, ДА и 5-ОТ) и их метаболитов (ванилилминдальная кислота и 3-метокси-4-гидроксифенилгликоль, 3,4-ДОФУК и ГВК, 5-ОИУК) в гипоталамусе и хвостатых ядрах стриатума (каудатных ядрах) таких животных выявило только снижение содержания ДА и его метаболитов 3,4-ДОФУК и ГВК в каудатных ядрах и снижение отношения 5-ОИУК/5-ОТ в гипоталамусе [Gospe S. M. Jr. et al., 1995].
Изменение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга под влиянием повышенного уровня ГЦ в крови может объясняться тремя возможными механизмами нейротоксического действия ГГЦ: окислительным стрессом, гиперстимуляцией NMDA-рецепторов глутаминовой кислоты и апоптозом. В настоящее время еще не найден ответ на вопрос, каким из этих механизмов в большей степени осуществляется воздействие ГЦ на моноаминергические системы мозга. Открытым также остается вопрос и о том, какая степень повышения уровня ГЦ в мозге обусловливает проявление его нейротоксических свойств [Troen A. M., 2005]. В норме уровень ГЦ в цереброспинальной жидкости человека (0,28-0,66 мкМ) [Hyland K., Bottiglieri T., 1992] и в ткани мозга крыс (0,76 мкМ/кг) [Ueland P. M. et al., 1984] на порядок ниже, чем в плазме крови (6,04-16,20 мкМ) [Troen A. M., 2005]. Четкие же нейротоксические эффекты ГЦ in vitro и ex vivo проявляются только в концентрациях около 100 мкМ, что гораздо выше, чем повышение ГЦ в плазме крови на уровне десятков микромоль, достаточное для развития ГГЦ [Troen A. M., 2005]. Тем более повышение уровня ГЦ в цереброспинальной жидкости и ткани мозга при ГГЦ в среднем не может достигать таких величин. Вместе с тем не может быть исключено локальное повышение уровня ГЦ в синапсах или внеклеточном пространстве в условиях метаболического стресса вплоть до нейротоксических концентраций.
Умеренное повышение уровня ГЦ, возможно, не является токсичным для дофаминергических нейронов, однако ксенобиотик может снижать порог чувствительности этих нейронов к другим токсическим агентам или оказывать токсическое действие на уже поврежденные нейроны [Kruman I. I. et al., 2000; Lee E.-S. Y. et al., 2005]. В таких нейронах синтез ДА может повышаться, что, возможно, является компенсаторным эффектом для восстановления нормального уровня нейромедиатора в ткани [McCormack A. L. et al., 2002].
Имеются также данные о том, что введение ГЦ увеличивает содержание X-бокс-связывающего белка-1 в нескольких отделах мозга мышей, таких как гиппокамп, гипоталамус и кора. Известно, что X-бокс-связывающий белок вовлечен в патогенез болезней центральной нервной системы [Hosoi T., Ogawa K., Ozawa K., 2010]. Пренатальная ГГЦ, моделируемая посредством метиониновой нагрузки при беременности, вызывает снижение когнитивных функций у потомства [Bayadas G. et al., 2008; Арутюнян А. В., Козина Л. С., Арутюнов В. А., 2010]. Показано, что токсический эффект ГЦ и гомоцистеиновой кислоты на процессы созревания мозга в условиях ГГЦ реализуется путем воздействия на метаботропные глутаматные рецепторы [Арутюнян А. В., Козина Л. С., Арутюнов В. А., 2010; Arutjunyan A. et al., 2012], а также путем изменения экспрессии нейроспецифических белков, принимающих участие в дифференциации нейронов и синаптогенезе [Bayadas G. et al., 2008]. Тест с нагрузкой L-метионином используется также в клинике для оценки состояния метаболизма ГЦ, особенно при диагностике умеренной ГГЦ, протекающей бессимптомно [Refsum H. et al., 1998; Хубутия М. Ш., 2004]. По результатам ряда исследований ГЦ запускает в нейроне ряд процессов, приводящих клетку к апоптозу [Жиляева Т. В., 2012]. Величина и скорость эффекта в эксперименте зависела от концентрации ГЦ: при концентрации 250 мкМ ксенобиотик вызывал апоптоз почти всех нейронов гиппокампа в культуре клеток in vitro в течение 28 ч, а при концентрации 0,5 мкМ (что является нормой in vivo) в том же эксперименте происходил отставленный апоптоз около 40% нейронов в течение четырех-шести суток [Kruman I. I. et al., 2000]. В исследовании группы немецких ученых было обнаружено, что ГЦ связывает ионы Cu2+, которые являются кофактором цитохром-С-оксидазы в митохондриях, что приводит к инактивации этого фермента, окислительному стрессу и апоптотической гибели нейронов [Linnebank M. et al., 2006]. В культуре гранулярных нейронов мозжечка ГЦ в дозе более 300 мкМ в течение 16-22 ч также вызывал гибель нейронов, опосредованную воздействием на NMDA-рецепторы и продукцией свободных радикалов [Kim W. K., Pae Y. S., 1996]. В работе японских ученых [Imamura K. et al., 2007] была продемонстрирована дозозависимая токсичность ГЦ в дозах 0–50 мМ в отношении мезенцефальных дофаминергических нейронов в культуре клеток. Причем внутриклеточный ДА усиливал цитотоксичность ГЦ. В этом же эксперименте было показано, что изучаемые эффекты ассоциированы с окислительным стрессом. Эти результаты, безусловно, нельзя переносить на ситуацию in vivo хотя бы потому, что вряд ли могут нормальные концентрации ГЦ вызывать гибель нейронов. Так, существуют данные о наличии in vivo протекторных веществ, таких как карнозин, параоксоназа-1, нейтрализующих действие ГЦ на нервную ткань [Linnebank M. et al., 2006; Borowczyk K., Shih D. M., Jakubowski H., 2012]. Тем не менее, они демонстрируют наличие токсичности ГЦ в отношении нервной ткани. И если ГЦ в концентрациях более 100 мкМ вызывает гибель нейрона через воздействие на NMDA-рецепторы, то в дозах менее 100 мкМ воздействие на NMDA-рецепторы, возможно, имеет другие последствия, что требует дальнейшего изучения. Еще одна группа ученых из ФРГ продемонстрировала в эксперименте, что ГЦ и его окисленные производные оказывают сильное ингибирующее влияние на активность нейрональных сетей. Так, если ГЦ ингибирует спонтанную активность нейросети в достаточно больших концентрациях, то его окисленные производные, в частности гомоцистеиновая кислота, оказывают этот эффект даже в малых концентрациях [Grtz P. et al., 2004; Арзуманян Е. С., Степанова М. С., 2010]. Причем это влияние опосредуется также через воздействие на NMDA-рецепторы нейронов [Kruman I. I. et al., 2000; Linnebank M. et al., 2006; Boldyrev A. A., 2009]. Гомоцистеиновая кислота инициирует вход Ca2+ в клетки и накопление свободных радикалов, способных приводить к апоптозу, а при более длительном воздействии и к некрозу клеток [Linnebank M. et al., 2006].
Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла
Исследование уровня ДА в МПО и НА в СВ-Арк гипоталамуса не выявило суточной динамики содержания этих нейромедиаторов ни в группе контроля, ни в группе животных, подвергшихся метиониновой нагрузке.
Определение же среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса при объединении данных, полученных во всех трех временных точках (5 ч, 9:30 ч и 11 ч ЦВ), показало, что после принудительного перорального введения L-метионина в течение месяца происходит достоверное (U=409; p 0,05) повышение содержания нейромедиатора по сравнению с контролем. В группе животных, получавших L-метионин, оно составило 27,2±1,0 нг/мг белка, а в контрольной группе – 23,7±0,9 нг/мг белка.
В результате изучения среднесуточных уровней ДА и 5-ОИУК в МПО гипоталамуса статистически значимые различия при сравнении контрольных и опытных животных выявлены не были. Так, среднесуточное содержание ДА в этой гипоталамической структуре в группе животных, потреблявших L-метионин, достоверно не отличалось от содержания нейромедиатора в группе контроля и составило: 27,0±0,9 нг/мг белка и 24,9±1,1 нг/мг белка, соответственно. Имела место лишь тенденция к повышению содержания среднесуточного уровня этого биогенного амина при введении L-метионина. В литературе имеются данные о повышении содержания НА в данной структуре гипоталамуса при метиониновой нагрузке. По мнению авторов, ГЦ индуцирует увеличение секреции ЛГ гипофизом. Это происходит вследствие ингибирования активности КОМТ в СВ-Арк гипоталамуса, в результате чего и происходит накопление НА в МПО гипоталамуса [Ladosky W., Azambuja H. M., Schneider H. T., 1983].
Также при объединении данных, полученных во всех трех временных точках (5 ч, 9:30 ч и 11 ч ЦВ), нами не было выявлено статистически значимых различий в среднесуточном содержании НА, ДА и 5-ОИУК в СВ-Арк гипоталамуса между контрольной и опытной группами животных. Так, например, среднесуточное содержание НА в этой гипоталамической структуре в группе животных, потреблявших L-метионин, достоверно не отличалось от уровня нейромедиатора в группе контроля (27,0±0,9 нг/мг белка и 24,9±1,1 нг/мг белка, соответственно). Имела место лишь тенденция к повышению содержания данного биогенного амина при введении L-метионина.
Согласно современным представлениям, ДА и особенно НА считаются позитивными регуляторами синтеза ГнРГ в МПО гипоталамуса самок крыс. Активация норадренергических нейронов, иннервирующих данную гипоталамическую структуру, в дневные часы на стадии проэструса играет важную роль в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ [Herbison A. E., 1997].
Что же касается секреции ГнРГ из СВ гипоталамуса, то ДА, в противоположность НА, рассматривается как негативный регулятор. В отношении 5-ОТ известно его ингибирующее влияние на продукцию ГнРГ. Как было показано выше, для исследованных нами биогенных аминов на стадии проэструса характерна суточная динамика их содержания в МПО и СВ-Арк гипоталамуса, связанная с регуляторной ролью этих нейромедиаторов в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ.
Отмеченное в данном исследовании изменение суточной динамики и среднесуточного содержания катехоламинов при метиониновой нагрузке в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, подтверждает адекватность использования для создания ГГЦ модели принудительного кормления животных L-метионином. Можно предположить, что исчезновение суточных ритмов содержания НА и ДА в данной модели ГГЦ связано с изменениями в работе центрального осциллятора циркадианных ритмов и является характерным начальным признаком нарушений нормального функционирования репродуктивной функции.
Приведенные результаты указывают на то, что повышенное содержание общего ГЦ вызывает нарушение катехоламинергической регуляции эстральных циклов у самок крыс, оказывая влияние на норадренергическую систему в МПО гипоталамуса и дофаминергическую систему в СВ-Арк гипоталамуса, что свидетельствует о негативном действии ГГЦ на процессы синтеза и секреции ГнРГ, находящиеся под контролем этих нейромедиаторных систем. Полученные данные дают основание рассматривать повышенное содержание общего ГЦ в качестве фактора, одним из проявлений нейротоксичности которого является нарушение гипоталамической регуляции овариальных циклов, что ставит его в один ряд с другими ранее изученными в нашей лаборатории ксенобиотиками.
Обнаруженные нами изменения в содержании отдельных нейромедиаторов в структурах гипоталамуса самок крыс при ГГЦ требуют дальнейшего исследования. В последнее время интерес к ГГЦ в основном связывают с изучением дегенеративных заболеваний нервной системы, при которых все больше исследователей отмечают повышенный уровень общего ГЦ в сыворотке крови. Однако механизм этого повышения пока еще остается недостаточно изученным, поэтому исследователи используют различные экспериментальные модели для изучения влияния ГГЦ на физиологические и биохимические показатели структур мозга. Так, рядом ученых было обнаружено, что у крыс, находящихся на диете с высоким потреблением L-метионина, снижено содержание 5-ОТ и ДА в коре головного мозга [Gao L. et al.,. 2012]. Другие исследователи, используя модель ГГЦ, вызванную диетой с дефицитом фолиевой кислоты, также отмечали изменения метаболизма биогенных аминов и снижение глутатиона в мозге животных [Kronenberg G. et al., 2008]. Имеются сведения о том, что введение ГЦ увеличивает содержание X-бокс-связывающего белка-1 в таких отделах мозга мышей, как гиппокамп, гипоталамус и кора. Известно, что X-бокс-связывающий белок-1 вовлечен в патогенез заболеваний ЦНС [Hosoi T., Ogawa K., Ozawa K., 2010]. Таким образом, можно предположить, что искажение нормальной суточной динамики и среднесуточного содержания катехоламинов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса в рассмотренной нами модели ГГЦ, вызванной введением L-метионина, может обусловливать нарушения в центральной регуляции эстральных циклов. Однако механизмы этого явления нуждаются в дальнейшем изучении. Полученные нами данные позволяют рассматривать ГЦ, концентрация которого в организме самок крыс возрастает при метиониновой нагрузке, в качестве эндогенного ксенобиотика, вызывающего нарушение центральной регуляции репродуктивных циклов.
Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина, толуола и метиониновой нагрузки на образование активных форм кислорода в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
Помимо суточных изменений содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, в МПО гипоталамуса также были обнаружены суточные изменения генерации АФК. Образование АФК в этой структуре в дневное время существенно (U=4; p 0,05) превосходило значения данного показателя в утренние и ранние ночные часы (рисунок 3.27). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена зависимость уровня люминолзависимой хемилюминесценции в этой гипоталамической области от временного показателя (Н=9,156; p 0,05). Необходимо отметить, что суточная динамика генерации АФК в МПО гипоталамуса имела характер, противоположный соответствующим изменениям содержания биогенных аминов в той же структуре (рисунок 3.22).
Коррекция с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов нарушения катехоламинергической регуляции эстральных циклов, вызванного нейротоксическим воздействием (1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка)
Известно, что для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ необходимо взаимодействие двух основных сигналов – гормонального, заключающегося в повышении в крови уровня половых гормонов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного, ежедневно поступающего от СХЯ к МПО гипоталамуса и СВ. Оба этих сигнала передаются гонадолиберинергическим нейронам опосредованно через нейромедиаторные системы, среди которых важная роль принадлежит катехоламинергическим и опиодным нейромедиаторам. У молодых нормально циклирующих самок крыс гиперсекреция ГнРГ наблюдается во второй половине дня проэструса. Непосредственно перед этим происходит повышение стимулирующей активности указанных нейромедиаторных систем с одновременным снижением ингибирующих влияний, в вечерние же часы действие стимулирующих эффектов снижается, а ингибирующих – вновь возрастает [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005; Kriegsfeld L. J., Silver R., 2006; Kelly M. J., Rnnekleiv O. K., 2008; Разыграев А. В. и соавт., 2010]. Подобные изменения содержания нейромедиаторов необходимы для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ [Yin W., Gore A. C., 2006]. Известно, что вазопрессин [Palm I. F. et al., 1999; 2001] наряду с ВИП [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005] являются ключевыми нейромедиаторами, посредством которых осуществляется контроль процесса запуска преовуляторной гиперсекреции ГнРГ со стороны центрального осциллятора циркадианных ритмов СХЯ гипоталамуса. Проекции этих нейронов, тела которых расположены в СХЯ, направляются к кисспептинергическим и другим эстрогенчувствительным нейронам МПО гипоталамуса.
В настоящем исследовании особое внимание было уделено выяснению роли моноаминергических систем в процессе формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ. Нами было обнаружено, что в узком временном интервале, совпадающем по времени с завершением преовуляторной секреции этого нейрогормона, происходит снижение содержания НА в МПО гипоталамуса и повышение содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса. Предположение о стимулирующем действии НА на процесс формирования пика секреции ГнРГ уже высказывалось рядом других исследователей [MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1994; ThyagaRajan S., MohanKumar P. S., Quadri S. K., 1995; Temel S. et al., 2002], которые склонны связывать суточный ритм секреции нейрогормона исключительно 183 с изменением уровня половых стероидов в крови. Однако в специально проведенном эксперименте, учитывающем различные стадии эстрального цикла экспериментальных животных, нами было установлено, что обнаруженные суточные изменения содержания НА в МПО гипоталамуса и ДА в СВ-Арк гипоталамуса не зависят от уровня половых стероидов; кроме того, в условиях световой депривации нами наблюдалось сохранение суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса, что доказывает участие в ее формировании центрального осциллятора циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса. Вместе с тем суточный ритм содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса при помещении животных в условия световой депривации исчезал, что указывает на возможную зависимость суточной динамики содержания этого нейромедиатора в рассматриваемой гипоталамической структуре от уровня освещенности. Вопрос о неодинаковом влиянии СХЯ гипоталамуса на суточную динамику содержания катехоламинов в различных структурах гипоталамуса на сегодняшний день не представляется достаточно ясным и нуждается в дальнейшем изучении.
Кроме того, несмотря на то, что во второй половине дня проэструса нами не было обнаружено суточных ритмов содержания НА в СВ-Арк гипоталамуса и ДА в МПО гипоталамуса, изменение уровней этих нейромедиаторов в гипоталамических структурах подчинялось иной характерной зависимости и определялось стадией эстрального цикла, что, вероятно, связано с реализацией овариального сигнала запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ. Совпадающее по времени с завершением пика секреции этого нейрогормона снижение содержания НА в МПО гипоталамуса, а также повышение его среднесуточного содержания в СВ-Арк гипоталамуса на стадии проэструса подтверждает высказываемые рядом исследователей предположения о том, что данный нейромедиатор стимулирует преовуляторную секрецию ГнРГ. Повышение же содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса в вечерние часы и снижение его среднесуточного содержания в МПО гипоталамуса на фоне повышенного уровня эстрадиола и прогестерона в крови указывает на ингибирующее действие этого нейромедиатора на процессы, связанные с синтезом и секрецией ГнРГ. Однако при этом необходимо учитывать, что, помимо выполнения собственно нейромедиаторной функции, ДА является также предшественником НА. Данное обстоятельство в известной степени осложняет интерпретацию полученных нами данных. Поэтому при изучении участия катехоламинов в центральной регуляции репродуктивной функции целесообразным представляется исследование активности дофамин-3-гидроксилазы. Установив механизмы гипоталамической регуляции репродукции, в частности определив роль в этом процессе катехоламинергических систем (что возможно выполнить только в эксперименте, причем исключительно на молодых половозрелых самках с нормально протекающим эстральным циклом), можно оценить причины нарушений половой цикличности как в процессе физиологического старения, так и в модели преждевременного старения репродуктивной функции, вызванного воздействием нейротоксических соединений.
В настоящем исследовании было установлено, что с возрастом начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются нарушением нормальной суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса и ДА в СВ-Арк гипоталамуса. Ввиду того, что, как было показано, суточная динамика содержания НА в МПО гипоталамуса является следствием реализации циркадианного сигнала запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ, ее изменение в процессе естественного старения, вероятно, связано с нарушением работы центрального осциллятора циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса. Эти данные подтверждают предположение некоторых других исследователей о том, что в основе обусловленного возрастом нарушения суточной динамики содержания отдельных нейромедиаторов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродуктивной функции, лежит ослабление сигнала, поступающего от СХЯ гипоталамуса [Harney J. P. et al., 1996; Wise P. M. et al., 1997; Yin W., Gore A. C., 2006]. Это, в свою очередь, вызывает изменение амплитуды преовуляторного пика секреции ГнРГ и, следовательно, снижение секреции ЛГ. Помимо этого, при старении репродуктивной системы, в СХЯ гипоталамуса нарушается характерная суточная динамика содержания аргинина-вазопрессина [Hofman M. A., Swaab D. F. 1994], связанного с синтезом ВИП и цАМФ [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005], вследствие чего в этой структуре гипоталамуса нарушается образование самого нейромедиатора. По данным литературы, пересадка старым крысам эмбриональной ткани, содержащей СХЯ гипоталамуса, восстанавливает характерные для молодых животных суточные ритмы содержания катехоламинов [Cai А. et al., 1997]. В представленном нами экспериментальном исследовании показано, что нарушение суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса самок крыс происходит еще при сохранении его нормального среднесуточного уровня, снижение которого отмечается в более позднем возрасте, когда половая цикличность полностью прекращается. Анализ содержания НА и ДА в исследованных структурах гипоталамуса подтверждает предположение о том, что с возрастом снижение секреции ГнРГ предшествует нарушению синтеза этого нейрогормона.
Известно, что возрастное ослабление функциональной активности центрального циркадианного осциллятора сопровождается нарушением суточных ритмов активности моноаминергических и опиоидергических систем гипоталамуса [Wise P. M. et al., 1997]. Эти две нейромедиаторные системы выступают антагонистами друг друга и при этом тесно взаимодействуют: повышение активности одной из них приводит к снижению активности другой, и наоборот [Przekop F., Tomaszewska D., 1996]. Также была доказана зависимость от центрального осциллятора циркадианных ритмов активности опиоидной -эндорфинергической системы медиобазального гипоталамуса [Jamali K. A., Tramu G., 1999]. Данные, полученные в нашем исследовании, позволяют предположить вовлеченность центрального циркадианного осциллятора в процесс формирования суточных ритмов активности моноаминергических систем в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции овариальных циклов. Однако для более убедительного подтверждения этой гипотезы необходимо проведение дальнейших исследований, проводимых на экспериментальных моделях, позволяющих изучать суточные изменения содержания этих нейромедиаторов при неизменном уровне половых стероидов в крови, поскольку изменение их уровня может оказывать модулирующее воздействие на исследуемые суточные ритмы содержания моноаминов в гипоталамических структурах [Бабичев В. Н., 1995; 2005]. В качестве таких моделей можно использовать овариэктомированных животных (постоянный низкий уровень половых стероидов в крови), а также овариэктомированных животных, обработанных эстрогеном (постоянное содержание половых стероидов в крови). Кроме того, определенный интерес представляет исследование суточной динамики содержания катехоламинов в гипоталамусе на разных стадиях эстрального цикла у интактных животных, находящихся в условиях постоянного освещения и световой депривации.
