Содержание к диссертации
Введение
Свойства и функции ЧСА 9
Связывание лигандов
Антиоксидантные свойства ЧСА 23
Энзиматические свойства ЧСА 25
Области и стратегии применения препарата ЧСА 27
Получение рекомбинантного ЧСА в различных системах экспрессии 40
Экспрессия рЧСА в прокариотических системах Escherichia coli и Bacillus subtili 40
Экспрессия рЧСА в дрооїсоїсах Saccharomyces cerevisiae 42
Экспрессия р ЧСА в дрожжах Kluyveromyces lactis 43
Экспрессия рЧСА в метилотрофных дрооїсоїсах Hansenula polymorpha (Pichia angusta) 45
Система экспрессии рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris 47
Преимущества системы экспрессии P. pastoris 47
Генетические основы экспрессии белков дрооїсоїсами P. pastoris 48
Экспрессия рекомбинантного ЧСА в дрооїсоїсах P. pastoris 49
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
Создание экспрессионного штамма GS115/ЧСА 51
Подбор оптимальных условий аналитической экспрессии 55
Оптимизация экспрессии целевого белка в условиях культивирования в ферментере;. 5б
Создание экспрессионного штамма GS115/ЧСА2 59
Очистка рЧСА из культуральной среды 63
Структурно-функциональные исследования рЧСА 677
Исследования биологической активности препарата рЧСА 74
ВЫВОДЫ 77
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 78
Химические реактивы и сопутствующие материалы 78
Методы работы с бактериями Esherichia coli. 81
Методы работы с дрожжами Pichia pastoris 83
Работа с нуклеиновыми кислотами 86
Хроматографические процедуры 94
Работа с белками 97
Масс-спектрометрический анализ
Эксперименты с участием лабораторных животных Ю4
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
- Связывание лигандов
- Экспрессия рЧСА в прокариотических системах Escherichia coli и Bacillus subtili
- Преимущества системы экспрессии P. pastoris
Введение к работе
Альбумин является наиболее распространенным растворимым белком позвоночных и, в то же время, представляет собой белок с самой высокой концентрацией в плазме. Для поддержания нормального осмотического давления у пациента, страдающего от потери жидкости, например, в случае хирургической операции, шока, ожога или отека, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) вводят в качестве заменителя плазмы. Для данной цели ЧСА в настоящее время производят путем фракционирования крови, собранной у доноров. Однако проблема дефицита донорской крови на данный момент не решена ни в мировом масштабе, ни в пределах Российской Федерации. За последние 15 лет доноров в России стало вдвое меньше. Так, в Европе на каждую тысячу населения приходится 30-35 доноров, в США и Канаде - 40, а у нас 12-13. Теоретически, донорами могут быть 10-15% населения, но, практически, в России их в 10 раз меньше - 1,6 %, а потребности в альбумине в отечественных медучреждениях удовлетворены в лучшем случае на 20%. Для примера: Московский банк крови производит 240 кг альбумина в год при потребности в 2 тонны. При наличии значительных объемов мировых запасов крови человека проблему получения ее отдельных замещающих компонентов можно было бы считать решенной, если бы не постоянный рост тяжелейших последствий применения препаратов полученных из донорской крови. К числу таких осложнений относится, прежде всего, возможность передачи реципиентам инфекционных агентов, в частности, вирусов иммунодефицита человека, вирусов гепатитов и других. Поэтому, в настоящее время, вся донорская кровь подвергается обязательной проверке на наличие в ней антител против ВИЧ. Однако данная проверка не дает абсолютно надежных результатов, поскольку антитела появляются в крови лишь спустя несколько месяцев после попадания ВИЧ в организм. Сходная проблема возникает и при проверке донорской крови на вирус гепатита В. Более того, долгое время не существовало серийных
методов выявления гепатита С - они разработаны лишь в последние годы. Даже если используемые производные плазмы согласно предпринятой проверке безопасны в отношении переноса ВИЧ, гепатита В и С, в них могут содержаться безоболочечные вирусы, такие как вирус гепатита А и парвовирус В19. Эти препараты потенциально способны переносить неизвестные инфекционные агенты, вызывающие болезнь Крейцфельда-Якоба (CJD) или новые варианты CJD, которые не обезвреживаются применяемыми способами инактивации и очистки в процессе производства. Поэтому переливание крови всегда связано с определенным риском. В связи с вышесказанным, клинически и экономически оправданным оказывается применение белковых препаратов факторов крови, полученных с привлечением современных методов генетической и белковой инженерии. По существующим мировым тенденциям можно предполагать, что в относительно недалеком будущем будет происходить постепенная замена препаратов крови на рекомбинантные белковые продукты.
Связывание лигандов
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) является основным белком плазмы крови, концентрация которого достигает 42±3.5 г. на литр плазмы. В каждый момент времени около 160 г ЧСА циркулирует в кровяном русле. ЧСА - мультифункциональный, отрицательно заряженный, негликозилированный мономерный глобулярный белок, состоящий из 585 аминокислот с молекулярной массой 66.5 кДа [1], содержащий в своей аминокислотной последовательности значительное количество остатков лизина и аспарагиновой кислоты. Согласно данным рентгено-структурного анализа ЧСА имеет форму эллипса с приблизительными размерами 80x80x30 А. Вторичную структуру белка на 60-55% составляют а-спирали и на 15-10% В-структуры, соответственно [2]. В составе альбумина выделяют три гомологичных домена (I—III), каждый из которых подразделяют на два субдомена (А и В) [3]. Каждый А и В субдомен содержит шесть и четыре сс-спирали, соответственно, соединенных гибкими петлями, образующимися за счет остатков пролина (рис. 1). ЧСА содержит в своей аминокислотной последовательности 35 остатков цистеина, 34 из которых замкнуты в 17 дисульфидных связей, стабилизирующих третичную структуру альбумина. Свободная -SH группа цистеина (34Cys) обеспечивает около 80% восстановительного потенциала плазмы крови и доступна для ацилирования (ЧСА-S-R) и нитрозилирования (ЧСА-S-NO) при некоторых функциях in vivo. В физиологических условиях ЧСА в основном находится в восстановленной форме, называемой меркаптоальбумином. Тем не менее, небольшая часть альбумина (менее 10%) представлена в виде смеси дисульфидов (ЧСА-S-S-R), где (R) представляет собой низкомолекулярные, тиол-содержащие вещества плазмы, такие как цистеин и глутатион [4]. Удельная доля смеси дисульфидов может увеличиваться при старении организма [5] и различных болезнях.
Формирование димеров (4CA-S-S-4CA) теоретически возможно, но не происходит in vivo из-за стерического ограничения. Тем не менее, формирование димеров альбумина имеет место ex vivo в процессе очистки и хранения.
ЧСА синтезируется в виде препроальбумина в полисомах гепатоцитов (10-15 г/день), что составляет около 10% от суммарного белка, продуцируемого печенью. Синтез белка в клетках является постоянным процессом, регулируемым как на уровне транскрипции, так и на уровне посттранскрипциональных модификаций. Регуляция синтеза осуществляется осморецепторами, расположенными в экстраваскулярном пространстве в печени, и зависит от осмотического и онкотического давлений и осмолярности [6]. Синтез альбумина повышается под действием соматотропного, адренокортикотропного гормонов, инсулина, кортикостероидов, тестостерона. Альбумин является преимущественно внеклеточным белком - более 50% альбуминов в организме находятся вне сосудистого русла. В плазме крови содержится около 40% альбумина, остальная часть представлена его обменными депо в тканях, преимущественно в коже (40%), а также в мышцах и органах (20%). При изучении катаболизма радиоактивно меченого альбумина у здоровых людей выявлено, что период полураспада составляет в среднем 14,8 дней [7]. В процессе высвобождения предшественника альбумина в полость эндоплазматического ретикулума отщепляется сигнальный пептид (препептид) [8]. Дальнейшая модификация белка происходит в аппарате Гольджи, где с помощью Са -зависимой диаргинил специфической "конвертазы" отщепляется пропептид Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg [9]. Зрелый белок с N-концевой аминокислотной последовательностью Asp-Ala-His-Lys-секретируется в кровеносный поток [3].
Ген, кодирующий ЧСА, представлен в геноме одной копией [10], расположен на четвертой хромосоме в локусе qll-22 [11] и содержит 15 экзонов и 14 интронов. Он отличается высоким полиморфизмом, и в настоящее время известно более 80 генетических вариантов ЧСА (аллоальбумины) [12]. Условно все аллоальбумины подразделяются на три варианта:
1). Более двадцати вариантов альбумина, содержащего единичные точечные замены [13].
2). Несколько вариантов, содержащих мутации в С-концевой области (570-585 аминокислотные остатки). Например, аллоальбумин Ge/C за счет делеции в 580 кодоне и последующим сбоем рамки считывания содержит аминокислоты [14]. Вариант Venezia (587 аминокислот) возникает за счет трансляции нетранслируемого в норме 15ого экзона, в то время как 14 экзон (кодирующий 572-585 аминокислоты) не транслируется вовсе [15].
Экспрессия рЧСА в прокариотических системах Escherichia coli и Bacillus subtili
В случае бактериальных клеток Е. coli нуклеотидная последовательность альбумина была клонирована под контролем индуцибельного trp-промотора триптофанового оперона в составе векторов pBR322 [156] и pXL276 [157]. Полученными генетическими конструкциями были трансформированы клетки штаммов К-12. Исследователями установлено, что продуцируемый клетками рЧСА в обоих случаях накапливался в цитоплазме в виде нерастворимых агрегатов.
Почвенная грамположительная бактерия В. subtilis прекрасно освоена микробиологической промышленностью. Бактерия В. subtilis по степени изученности следует за Е. coli. Для них характерен нечасто встречающийся среди бактерий процесс споруляции, и в этом плане они представляют значительный теоретический и практический интерес. В. subtilis имеют важное практическое значение: они широко используются в различных процессах ферментации при промышленном получении антибиотиков и ферментов и в этом отношении обладают рядом ценных свойств, таких как способность секретировать синтезируемый белковый продукт в культуральную жидкость, способность расти на дешёвых синтетических субстратах и обладать продуктивностью на один-два порядка выше, чем у грамотрицательных бактерий-продуцентов. Однако данная бактерия имеет свои недостатки: рекомбинантные плазмиды в В. subtilis характеризуются нестабильностью, выражающейся в перестройках и делециях ДНК; бациллы секретируют в культуральную среду большое количество протеаз, что существенно усложняет вопрос максимализации продукции целевого белка бациллами-продуцентами. Для изучения экспрессии рекомбинантного ЧСА прокариотическими клетками В. subtilis было создано несколько генетических конструкций (как интегрирующих в бактериальный геном, так и автономно реплицирующихся в цитоплазме клетки), содержащих нуклеотидную последовательность ЧСА вместе с промоторными и лидерными последовательностями каждого из двух генов Bacilus amyloliquefaciens P. — гена а-амилазы (я/иуватр) и нейтральной протеазы (л/я ватр) [152]. При экспрессии полученных конструкций в клетках штаммов BR151 и 1S53 В. subtilis установлено, что в процессе секреции эффективность удаления лидерных пептидов обратно пропорционально количеству рЧСА, продуцируемому клетками, что приводит к итоговому незначительному уровню экспрессии правильно процессированного целевого белка [152].
ЭкспрессиярЧСА в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
Система экспрессии в дрожжах S. cerevisiae наиболее популярна для получения гетерологичных эукариотических белков в связи с тем, что она обеспечивает общие для эукариотических клеток процессы процессинга, фолдинга и посттрансляционной модификации белков. Популярности этой системы экспрессии среди ученых-исследователей способствовали детальные исследования по генетике и биохимии этих организмов [158]. В работе [159] было создано несколько генетических конструкций на основе эписомальных и интегративных векторов, содержащих последовательность кДНК гена ЧСА вместе с комбинацией нескольких промоторных и лидерных последовательностей. При анализе культуральной жидкости было установлено, что при экспрессии генетических конструкций, содержащих лидерные пептиды куриного лизоцима (CLY) и собственного лидерного пептида ЧСА (HSA), происходит некорректный процессинг секретирующегося белка. При отщеплении последовательности CLY у экспрессирующегося ЧСА отсутствовали две N-концевые аминокислоты, а в случае собственного лидерного пептида ЧСА секретировалась смесь трех форм полипептидов: N-концевая аминокислотная последовательность одной из форм совпадает с таковой нативного ЧСА, у другой отсутствовали две N- концевые аминокислоты а у третьей - четыре.
Преимущества системы экспрессии P. pastoris
Система экспрессии рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris в короткие сроки зарекомендовала себя как удобный, сравнительно недорогой и технически доступный способ получения рекомбинантных продуктов [166]. Эта эукариотическая система обладает рядом преимуществ по сравнению с уже известными. В отличие от прокариотической системы экспрессии в Е. coli ей свойственны процессинг, фолдинг и посттрансляционные модификации рекомбинантных белков [167]. В тоже время она обеспечивает значительно более высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, чем бакуловирусная или система экспрессии в культуре клеток млекопитающих. Культура метанолотрофных дрожжей P. pastoris не требует для своего роста сложнокомпонентных сред, а достигает высокой плотности при росте на минимальной среде [168, 169]. Привлекательность этой системы, как в лабораторном, так и в промышленном производстве, обеспечивается также стабильностью интегрированных в геном дрожжей гетерологичных генетических элементов на протяжении длительных ферментационных процессов [170] и возможностью варьирования в широком диапазоне условий культивирования. Эта система предусматривает как внутриклеточный, так и секреторный варианты экспрессии. Серьезным преимуществом P. pastoris как системы экстраклеточной экспрессии является ограниченное количество секретируемых белков [166], что существенно облегчает очистку рекомбинантного продукта из среды. Также, секретируемые клетками Pichia рекомбинантные белки не подвержены гипергликозилированию по сравнению с S. cerevisiae. При просттрансляционном N-гликозилировании длина олигосахаридных цепей в Р. составляет 8-14 маннозных остатков, когда как в S. cerevisiae их длина составляет в среднем 50-150.
Генетические основы экспрессии белков дрожжами P. pastoris.
Метилотрофные дрожжи P. pastoris способны эффективно утилизировать метанол в качестве единственного источника углерода. Метаболизм метанола в дрожжевых клетках на первом этапе состоит в его окислении в присутствие кислорода до формальдегида под влиянием двух алкогольоксидаз АОХ1 и АОХ2. Поскольку высвобождающийся в процессе реакции пероксид водорода токсичен, то этот процесс протекает в специальных органеллах - пероксисомах. Алкоголь оксидазы характеризуются низкой аффинностью в отношении кислорода, а их высокая суммарная активность в клетках компенсируется синтезом больших количеств ферментов. При росте на метаноле в качестве источника углеводорода количество алкогольоксидаз составляет более 30% суммарного растворимого белка в клетке. Хотя последовательность гена АОХ2 более чем на 97% гомологична последовательности гена АОХ1, продукт гена АОХ1 обеспечивает значительно большую часть суммарной активности в клетках. Клетки с разрушенным геном АОХ1 растут на метаноле значительно более медленно, чем мутанты по гену АОХ2. Для них приняты обозначения Mut+ (имеет фенотип дикого типа) и Mut (имеет слабо выраженный рост на метанолсодержащей среде). Регуляция АОХ1 гена осуществляется по механизму репрессии/депрессии с одновременной индукцией метанолом. Репрессия промотора осуществляется углеводородами (глюкозой, глицерином, сорбитолом), а индуктором служит метанол. Индуцибельный АОХ1 промотор наиболее часто используется для экспрессии гетерологичных белков в Pichia. В ряде случаев используют также конститутивный GAP [171] и индуцибельный FLD [172] промотор генов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и формальдегид дегидрогеназы соответственно. Промоторы АОХ2, YPT1 и РЕХ8 используются значительно реже, вероятно из-за того, обеспечивают значительно более низкий уровень экспрессии рекомбинантных белков.
