Введение к работе
Актуальность проблемы. Использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в биологических исследованиях начиналось в 50-х годах XX века с применения Р-ортофосфата для введения радиоактивного фосфора в нуклеиновые кислоты. Исследования взаимосвязи падения инфекционности бактериофагов и радиоактивного распада фосфора-32, включившегося в состав вирусной нуклеиновой кислоты, дали мощный импульс к возникновению и развитию молекулярной биологии. Одновременно расширились сферы применения и номенклатура соединений, меченных фосфором-32, а позднее и фосфором-33. На первое место среди используемых соединений, меченных фосфором-32, вышли предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот - нуклеозид-5'-трифосфаты. Развитие с середины 1970-х годов методов секвенирования ДНК значительно изменило объем и характер исследований, проводимых в области молекулярной генетики, молекулярной биологии и биотехнологии. Потребление нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, в первую очередь аденозин-5'- [у-32Р] трифосфата, 2'-дезоксиаденозин-5'- [а-32Р] трифосфата и 2'-дезоксицитидин-5'- [а- Р] трифосфата, в мире в 80-х годах достигло очень большой величины - до 10 Ки ежемесячно. Разработка флуоресцентных автоматических секвенаторов и внедрение их в рутинную повседневную практику существенно снизило потребление меченых фосфором нуклеотидов, однако, в целом, разнообразные исследования с использованием радиоактивных изотопов фосфора, остаются в методическом арсенале ученых.
Главным преимуществом использования соединений, меченных фосфором-32, в различных биологических исследованиях является высокая чувствительность методов. Теоретически чувствительность таких методов определяется молярной (удельной) активностью используемых соединений и может достигать достоверного обнаружения и измерения 10" моль в исследуемом образце. Высокая чувствительность в сочетании с высокой специфичностью и простотой реализации делают использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, по-прежнему, важнейшим и распространенным инструментом исследователей.
Технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, имеют свои специфические проблемы и ограничения.
1. Высокая молярная активность вынуждает проводить синтезы с количеством
О Q
радиоактивного изотопа 10" - 10" моля, что соответствует активности 10-100 мКи.
-
Реакции, используемые для синтеза меченых соединений, не должны приводить к неконтролируемому изотопному разбавлению нерадиоактивным фосфором-31, и местоположение радиоактивного атома должно быть строго зафиксировано.
-
Фосфор-32 и фосфор-33 являются реакторными изотопами, т.е. нарабатываются в результате облучения соответствующих мишеней в нейтронном потоке ядерного реактора, и при получении этих изотопов с максимально высокой молярной активностью, в ходе первичной переработки облученного радиоактивного сырья, получается ортофосфорная кислота, меченная фосфором-32 или фосфором-33 соответственно. Следовательно, схемы получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, основываются на использовании в качестве исходного радиоактивного соединения (радиоактивного сырья) 32(33)Р-ортофосфорной кислоты.
-
При высокой объемной активности (1-10 Ки/мл) в реакционной смеси быстро накапливаются неидентифицированные продукты, индуцированные ионизирующим излучением, поэтому время проведения всех стадий процесса, включая анализ выхода промежуточных продуктов, необходимо минимизировать.
5. Количество синтезируемых веществ слишком мало, чтобы использовать
классические методы органического синтеза (перегонка, кристаллизация, осаждение и
т.д.) и существенно ограничивает возможности использования физико-химических
методов анализа: ЯМР-спектрометрию, масс-спектрометрию, УФ иИК-спектроскопию.
6. Высокая активность на рабочем месте требует определенных мер по соблюдению
техники радиационной безопасности и вынуждает проводить технологический процесс в
соответствующих защитных боксах.
Среди методов синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, можно выделить химические, химико-ферментативные и ферментативные методы. Высокая скорость вместе с высокой специфичностью и технологичностью делают ферменты незаменимым инструментов для проведения сложных радиохимических синтезов. Основным ограничением ферментативных и химико-ферментативных методов синтеза является доступность высокоочищенных ферментов и недостаточно полная информация об их субстратной специфичности и стабильности в условиях радиохимического синтеза. Поэтому прикладные разработки технологических ферментативных схем синтеза меченых нуклеотидов сопряжены с работой по получению очищенных ферментов и фундаментальными энзимологическими исследованиями.
Цель и задачи исследования. Цель исследования: создание технологий серийного производства нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, для
обеспечения исследований в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
-
Разработка эффективных методов синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в масштабе 100 мКи по радиоактивному сырью.
-
Разработка методов очистки целевых соединений.
-
Разработка методов промежуточного технологического контроля и контроля качества конечного продукта.
-
Создание ферментативной технологической базы, необходимой для реализации технологии получения нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.
-
Внедрение разработанных методов в серийное производство.
-
Создание эффективного радиопротектора, обеспечивающего увеличение срока годности синтезированных меченых соединений.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Проведенное исследование позволило создать технологию получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, основанную на использовании ферментов. Были разработаны ферментативные способы синтеза целевых соединений, их очистки с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также разработан и внедрен эффективный радиопротектор, замедляющий радиолитическое разрушение конечного продукта. Разработаны методы контроля качества нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, при их серийном производстве.
Внедрение полученных научных, технологических, конструкторских и организационных решений позволило создать эффективное серийное производство, а также в 1989 г. осуществить продажу части этой технологии на Кубу для организации там
^9 ^9 ^9
собственного производства [у- Р]АТР, [a- P]dATP и [а- Р]АТР.
Серийное производство нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, по разработанной ферментативной технологии в разные годы было реализовано на различных предприятиях: 1) предприятие «Радиопрепарат» Института ядерной физики АН УзССР, 2) Государственный научный центр - Физико-энергетический институт, 3) Государственное унитарное предприятие - Институт реакторных материалов.
Личный вклад автора заключается в формулировании и постановке целей и задач исследования, обосновании путей их решения и непосредственном выполнении
экспериментов, анализе, обобщении и оформлении полученных результатов, организации опытно-промышленного и серийного производства на основании разработанных технологических процессов.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 1) Ш-Международный симпозиум по органическим соединениям, меченным радиоактивными изотопами. 1988, Марианске Лазне, 2) 7 Всемирный съезде по ядерной медицине и биологии. 1998, Берлин, 3) II Всесоюзное совещание по проблеме «Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами» 1988, Звенигород,
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 5 глав экспериментальной части и выводов, списка литературы (104 наименований) и приложений. Основной текст диссертации изложен на 168 страницах, включая 24 рисунка и 17 таблиц.
