Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура и антигенная изменчивость вирусов гриппа а 8
1.1. Краткая характеристика основных белковых компонентов и антигенной структуры вирусов гриппа А. 8
1.2. Происхождение пандемических и эпидемических штаммов вируса гриппа А 18
Глава 2. Использование моношюнадьных антител в изучении структуры и изменчивости поверхностных антигенов вирусов гриппа собственные исследования 24
Глава 3. Материалы и методы 38
3.1. Сбор материала от диких птиц для вирусологических и серологических исследований 38
3.2. Характеристика мест сбора биологического материала 38
3.3. Методы выделения и идентификации вирусов 40
3.4. Иммунологические методы 45
3.5. Методы изучения биологических свойств вирусов гриппа 47
3.6. Биохимические методы исследования 48
3.7. Получение гибридомных моноклональных антител к вирусу А/чайка озерная/Казахстан/470/79 49
3.8. Получение антигенных вариантов с использованием моноклональных антител 49
3.9. Приготовление эритроцитарного диагностикума на основе моноклональных антител . 50
3.10. Статистическая обработка результатов 52
Глава 4. Изоляция вирусов гриша от диких птиц в казахской сср 54
4.1. Выделение и идентификация вирусов гриппа 54
4.2. Иммунологический анализ вирусов НІШ, изолированных от диких птиц, с использованием моноклональных антител 60
Глава 5. Изучение специфичности моноклональных антител к вирусу а/чайка 03ерная/казахстан/470/79 65
Глава 6. Моделирование антигенного дрейфа вирусов ніж различного происхождения 78
6.1. Селекция и иммунологический анализ антигенных вариантов вирусов А/чайка озерная/Казахстан/ 470/79 и А/СССР/090/77 с использованием монокло-нальных антител. 78
6.2. Сравнительное изучение биохимической структуры и биологических свойств селектированных вариантов 86
Обсуждение результатов 92
Выводы 109
Литература 111
- Происхождение пандемических и эпидемических штаммов вируса гриппа А
- Использование моношюнадьных антител в изучении структуры и изменчивости поверхностных антигенов вирусов гриппа собственные исследования
- Получение гибридомных моноклональных антител к вирусу А/чайка озерная/Казахстан/470/79
- Иммунологический анализ вирусов НІШ, изолированных от диких птиц, с использованием моноклональных антител
Введение к работе
кШШШ9&М80йЗШ.* Согласно современным представлениям, антигенный дрейф вируса гриппа обусловлен селекцией иммунной популяцией спонтанно возникающих вирусных мутантов с измененными антигенными свойствами. Исследование механизмов минорной изменчивости поверхностных антигенов вируса необходимо для определения возможностей прогнозирования эпидемий и совершенствования профилактических вакцин.
В последнее время благодаря появлению гибридомной техники синтеза моноклональных антител ( Kohler,Milstein ,1975, 1976) появились новые возможности подхода к исследованию структурно-функциональных свойств антигенов. Весьма информативным оказалось использование этих высокоспецифичных антител для моделирования антигенного дрейфа поверхностных гликопротеидов вируса гриппа.
Поскольку популяции диких птиц могут рассматриваться как один из возможных источников возникновения новых антигенных вариантов вируса гриппа (Жданов и др., 1978; Львов, ІКданов, І98Е), изучение изменчивости выделяемых от диких птиц штаммов имеет важное значение. Особый интерес представляют птичьи изо-ляты, имеющие сходство с эпидемическими вирусами гриппа.
]Щ*и!кЛШтЛ&5330ШШ' Основная цель настоящего исследования состояла в изучении минорной антигенной изменчивости вирусов гриппа, изолированных от диких птиц, с использованием моноклональных антител в качестве иммунного пресса. В соответствии с этим, были определены следующие задачи:
провести серологическое и вирусологическое обследования диких птиц;
получить моноклональные антитела к гемагглютинину вирусов гриппа, выделенных от диких птиц;
провести моделирование антигенного дрейфа гемагглютинина вирусов гриппа птичьего происхождения с использованием монокло-нальных антител;
изучить антигенную и биохимическую структуры, а также биологические свойства селекционированных вариантов и родительских вирусов в сравнительном аспекте.
#&385~М9ШШ.' Впервые в СССР от диких птиц изолированы вирусы, принадлежащие к серогруппе НІНІ. С использованием моно-клональных антител установлено сходство выделенных штаммов по антигенной структуре гемагглютинина с эпидемически актуальным вирусом А/СССР/090/77.
Впервые предпринята попытка "экологического" подхода к моделированию антигенного дрейфа путем селекции антигенных вариантов двух вирусов HInI птичьего и человеческого происхождений.
Обнаружено сходство лабораторных дрейф-вариантов штаммов HlNl, выделенных от диких птиц и человека.
Црактдч^с45а^цндо^т.ь_. Вирус А/чайка озерная/Казахстан/470/ 79, а также селекционированные антигенные варианты А/чайка озер-ная/Казахстан/470/79/вариант и А/СССР/090/77/вариант депонированы в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР (номера депозитов соответственно 1816, 1850, I860).
На основе моноклональных антител к гемагглютинину штамма А/чайка озерная/Казахстан/470/79, полученных в совместных иссле-
дованиях с Институтом молекулярной биологии АН СССР, приготовлен высокочувствительный и специфичный эритроцитарный диагностику^ для экспресс-индикации вирусов гриппа HINI.
Оствёт^тО^тт^ШттШё^т^Ш^т.' Штаммы вируса гриппа A/HlNl/, изолированные в результате вирусологического обследования диких птиц в Казахской ССР в 1979 году, обнаруживают сходство с эпидемическими вариантами 1950 и 1977 гг. выделения.
Под действием иммунного пресса моноклональных антител, специфичных к гемагглютинину вирусов гриппа HINI птичьего и человеческого происхождений, выделенные от птиц штаммы и близкие к ним эпидемические вирусы проявляют одинаковую способность к антигенному дрейфу.
^0ОйШ53^й9Ш- Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Советско-Американском симпозиуме по гриппу и ОРЗ (Алма> Ата, 1980), Ш объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Казахстана (Алма-Ата, 1980), научной конференции молодых ученых Института вирусологии АМН СССР (Москва, 1981), научной конференции молодых вирусологов г.Алма-Аты (Алма-Ата, 1981), I конференции вирусологов Казахстана, посвященной памяти академика X.Ж.Щуматова (Алма-Ата, 1982), научной конференции отдела экологии вирусов Института вирусологии АМН СССР (Москва, 1982), 16 конференции федерации Европейских биохимических обществ (Москва, 1984), Республиканской конференции по генетике и селекции (Алма-Ата, 1984).
Диссертация обсуждена и одобрена секцией вирусологии Ученого совета Института микробологии и вирусологии АН КазССР (1984) и на расширенном заседании отделов вирусологии Научно-исследовательского института эпидемологии, микробиологии и инфекционных
болезней МЗ КазССР и Института микробиологии и вирусологии АН КазССР (1984).
&!&шаіш>^вежил!^ По материалам диссер-
тации опубликовано 13 работ.
0$ШЫЬ8ШШВ&М98В2Ш' Работа изложена на 140 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, включающего 2 главы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Материалы диссертации иллюстрированы 17 таблицами и 5 рисунками. Библиографический список включает 255 отечественных и иностранных источников.
Происхождение пандемических и эпидемических штаммов вируса гриппа А
Уникальная изменчивость поверхностных белков вируса гриппа является основной причиной, затрудняющей борьбу с этой инфекцией.
Как известно, имеется два вида антигенной изменчивости гем-агглютинина и нейраминидазы вируса гриппа: крупные изменения, обозначаемые термином " shift" ("скачок", "сдвиг"), и минорные изменения структуры антигенов - " drift " ("дрейф"). "Шифтовые" изменения приводят к возникновению новых антигенных вариантов вируса, вызывающих крупные эпидемии и пандемии. В вопросе о происхождении и механизме появления пандемических штаммов вируса гриппа в настоящее время продолжают существовать две альтернативные концепции. С точки зрения сторонников так называемой "антро-понозной" гипотезы (Смородинцев, 1975; 1984; Беляков и др., 1983; Карпухин, Голубев, 1983), вирусы гриппа прошлых пандемий сохраняются в человеческой популяции и реализуют свои патогенные потенции без участия генетического материала "чуждых" им по антигенной структуре вирусов другого происхождения.
Выживание пандемических вариантов обеспечивает чередованием фаз эпидемического распространения и резервации. Вирусы гриппа А человека рассматриваются как подвид, находящийся в экофизио-логической и пространственной изоляции с подвидом вирусов гриппа животных ( Карпухин, Голубев, 1983) и имеющий ограниченное количество сероподтипов, способных создать пандемическую ситуацию (Смородинцев, 1975, 1984).
Широкое распространение получила вторая, "зооантропонозная", концепция (Закстельская, 1973; Львов и др., 1973; Львов, 1977, 1983; Жданов и др., 1978; Львов, Жданов, 1979, 1980;Alexander, 1982; Kaplan ,1982; Bachmann ,1984)., связывающая возникновение антигенных сдвигов с пересортировкой (рекомбинацией) генов вирусов гриппа А человека и животных, которые, согласно современной номенклатуре (Бюллетень ВОЗ, 1980), не имеют принципиальных антигенных различий. Предполагается, что вирусы находятся в неустойчивом равновессии с человеком как строго облигатные паразиты, для выживания которых необходимо наличие в популяции значительного числа восприимчивых особей (Кильбурн, 1978). Основным положением концепции является утверждение о возможности сохранения генов эпидемических штаммов вирусов гриппа в природе. Серологические исследования и многочисленные случаи изоляции подтверждают, что штаммы, прекратившие циркуляцию среди людей, продолжают свое существование в популяциях животных. В настоящее время получены экспериментальные свидетельства возможности прямого перехода вирусов гриппа, инфицирующих свиней,от животных к человеку (Beare et al. ,1980). Классическим примером передачи вируса в естественных условиях является вспышка среди новобранцев в Форд-Диксе, вызванная "свиным" штаммом, принадлежащим к антигенному комплексу НІНІ (Kendal, et al. ,1977a). Однако глобального распространения инфекции, вызванные этим вирусом, по-видимому, иметь не могут ( Bachmann ,1984).
Возможность генетической рекомбинации вирусов гриппа различного происхождения была неоднократно доказана в эксперименте в системах in vitro и in vivo ( Tumova, Pereira ,1965; Kilbourne ,1968; Webster ,1970; Webster et al. ,1972, 1973; Подчерняева с соавт., 1972, 1976, 1980; Блинова с соавт., 1975). Используя в качестве родительских штаммов птичьего происхождения (H2N3 и H6N2),Д.К.Львов с соавт. (1979) получили ре-комбинант, представляющий собой антигенный аналог эпидемического "азиатского" вируса Н2Я2,
Птицы представляют собой обширный резервуар генов эпидемических вирусов. К настоящему времени от них выделены все известные разновидности вирусов гриппа А. Особенно высокий уровень инфицированности гриппом среди птиц водного комплекса. Так, в результате 4-летнего обследования водоплавающих птиц в ГДР R.Sirmecker et al. (1983) от внешне здоровых уток, лебедей, крачек, гусей и чаек вьщелили вирусы гриппа, относящиеся к 14 подтипам. Гемагглю-тинины изолятов преимущественно принадлежали к тем, которые ранее считались собственно "птичьими", однако имелись также вирусы с гемагглютининами Н2 и HI. Многочисленные данные свидетельствуют об инфицированности птиц "человеческими" штаммами гриппа, в том числе, относящимися к серогруппе Н 1ЭД. Вирусы HPI были изолированы от индюков (Ковтун, и др., 1980), а также различных видов диких птиц ( Ромвари ,1979; Iftimovici et al.,I980). Птицам отводился особая роль в качестве резервуара и "транспортного средства" вирусов гриппа. Домашние животные, в их числе и птицы, могут служить, с точки зрения обсуждаемой концепции, "промежуточным звеном" между людьми и дикими животными. Предположение о сохранении у цыплят вируса ЩНЇ до момента его возвращения в популяцию людей было высказано К.Ф.Шортриджем с соавт. (1978, 1979) на основании результатов серологического обследования домашней птицы в Гонконге. Серологические данные об инфицированности цыплят вирусом НШ подучены также Chu Chiming (1978).
Подтверждена возможность вертикальной передачи вируса гриппа птицам на основании последовательной изоляции штаммов с близким антигенным профилем от взрослых чаек и их эмбрионов (Рослая и др., 1984). По мнению авторов исследования, способность птиц передавать вирусы гриппа потомству через яйцо может быть одним из факторов, объясняющих широкое распространение этого вируса среди пернатых. Сравнительный анализ вирусов серогруппы НІНІ, выделенных от свиней и птиц, методом гибридизации показал, что гены гемагглютинина изолятов от свиней Северной Европы ближе к таковым изолятов от птиц Европы и Северной Америки, нежели к генам гемагглютинина штаммов, выделенных от свиней в США, Тайване и Италии (Scholtissek et al. , 1983). Эти данные позволили авторам предположить, что вирусы НВГІ могут передаваться от птиц к свиньям и/или наоборот, то есть, способны преодолевать межвидовой барьер. Существует гипотеза, что современные вирусы гриппа А ведут свое происхождение от общих предков, обитавших в организме птиц, у которых, как известно, эта инфекция протекает в бессимптомной форме ( Kaplan ,1982).
Таким образом, рекомбинационная концепция рассматривает вирусы гриппа типа А как "гетерогенную популяцию, циркулирующую в биосфере среди людей и животных" (Львов, Жданов, 1982). Относительно быстрая смена генераций у многих видов животных обусловливает меньшее давление коллективного иммунитета на старые штаммы. Социркуляция их с другими вирусами гриппа создает условия для рекомбинации и возникновения новых антигенных вариантов, среди которых могут быть штаммы с высоким эпидемическим потенциалом. В вопросе о механизмах антигенного дрейфа мнения исследователей единодушны. Согласно современным представлениям, дрейф является результатом селекции иммунной популяцией спонтанно возникающих мутантных вирусных частиц с измененными антигенными свойствами, обладающими преимуществами в росте.
Использование моношюнадьных антител в изучении структуры и изменчивости поверхностных антигенов вирусов гриппа собственные исследования
Принципиально новые возможности подхода к проблеме антигенной изменчивости вируса гриппа возникли благодаря появлению гиб-ридомной техники синтеза моноклональных антител ( Kohler, Milstein ,1975, 1976). Принцип метода заключается в создании непрерывной культуры клеточных гибридов (гибридом) путем слияния иммунокомпетентных и опухолевых клеток. Лимфоцитарные гибриды наследуют свойства обоих родителей: способность к антитело-образованию и к неограниченному росту. Клонированием такой культуры можно получить чистую линию клеток, продуцирующих молекулы антител, идентичные по специфичности и физико-химическим свойствам (моноклональные антитела). Будучи продуктами потомков одной В-клетки, моноклональные антитела обладают рядом преимуществ перед гетерогенными сыворотками. Обычная поликлональная сыворотка содержит, как известно, большой набор антител различной специфичности и аффинности. Относительный уровень моноспецифичности противогриппозной сыворотки может быть достигнут при соблюдении соответствующих условий иммунизации (использование рекомбинантных вирусов, очищенных белков и т.д.) и проведении ступенчатой адсорбции сыворотки (Ровнова и др., 1979; . .Стык и др., 1979; Исаева, Ровнова, 1983; Haaheim, Schild Д979). Моноклональные антитела обладают абсолютной специфичностью , позволяющей распознавать минорные различия в композиции антигенов, поскольку реагируют с индивидуальными эпитопами молекулы. Другим преимуществом является их стабильность (не только в отношении специфичности, но также аффинности и титра). Большое практическое значение имеет возможность выбора, в зависимости от целей исследования, антител с заранее заданными свойствами.
За последние несколько лет "гибридомная биотехнология" достигла больших успехов. Созданы системы, продуцирующие монокло-нальные антитела ко множеству антигенов различного происхождения: клеточным поверхностным антигенам, специфическим раковым антигенам, белкам крови, бактериям, искусственным химическим соединениям и т.д. ( Schroder ,1980; Staine, Lew ,1980; Петров, Березин, 1982).
Гибридомные антитела оказались высокоэффективным инструментом исследования в вирусологии (Новохатский и др., 1979; Oxford, 1982; Дашкевич, 1983; Новохатский, Жданов, 1984; Franze ,1984).
В главе I были приведены некоторые примеры применения моно-клональных антител при изучении композиции и изменчивости внутренних антигенов вируса гриппа. Использование этих гомогенных моноспецифических антител для иммунологического анализа поверхностных антигенов расширило возможности изучения эволюционных связей вирусов гриппа в пределах серогруппы. Так, сравнительный анализ дрейф-вариантов HINI с моноклональными антителами и хорьковыми сыворотками позволил определить разницу в степени антигенного дрейфа гемагглютининов вирусов А/Бразилия/П/78 и А/Лакланд/3/78 (первый в антигенном отношении был ближе к вирусу A/GCCP/090/77, нежели второй). Существенный дрейф гемагглю-тинина вируса А/СССР/090/77 в течение года после появления этого эпидемического штамма исследователи объясняли селекцией антигенных вариантов иммунной популяцией родившихся до 1957 года и/или высокой вариабельностью молекулы HI ( Webster et al., 1979).
С использованием моноклональных антител было проведено сравнительное изучение тонкой антигенной структуры вирусов H3N2, выделенных в СССР в 1978-1980 гг. (Ямникова и др., 1980).
Данные, полученные при анализе первичной структуры гемагглютинина природных дрейф-вариантов, свидетельствующие об изменениях в аминокислотном составе этих молекул ( Laver et al. ,1974, 1980а), не могут быть непосредственно применены к исследованию антигенных свойств, поскольку не все обнаруженные структурные перестройки могут быть ответственны за антигенные изменения. Се-лещия мутантных вирусов с использованием моноклональных антител в качестве иммунного пресса позволяет с большей вероятностью получать именно те изменения биохимической структуры молекулы, которые влияют на эпитопы, комплементарные селектирующему антителу. Вирусы с эпитопом, который не "сочетается" с соответствующим участком этого антитела, имеют селективное ростовое преимущество, то есть, способны реплицироваться в присутствии антител, подавляющих родительский штамм.
Антигенные варианты, селектируемые в течение одного пассажа при сверхнейтрализующей концентрации моноклональных антител, имеют, как правило, одну аминокислотную замену и незначительные отличия от родительского вируса в отношении антигенных свойств. Такие варианты представляют собой единичные точечные мутанты "дикого" штамма. Иммунологическая характеристика этих мутантов с использованием гибридомных антител создает возможность для более детального анализа антигенной структуры поверхностных полипептидов вируса гриппа. Большое количество работ посвящено моделированию антигенного дрейфа гемагглютинина, имеющего наибольшее значение для биологии вируса гриппа.
В исследованиях W. Gerhard (1978) оказалось возможным выделить около 50 антигенных участков молекулы гемагглютинина (штамм A/PP/8/34), каждый из которых индуцирует образование специфических антител. Однако являются ли эти участки дискретными или перекрываются, в работе установлено не было. В дальнейшем, основываясь на том, что индивидуальные мутации модифицируют определенные эпитопы, W. Gerbard et al. (1981) определили наличие четырех антигенных сайтов в молекуле гемагглютинина вируса А/РР/8/34. Имея в распоряжении достаточно широкий набор (58) антител, исследователи создали эпитопную карту молекулы, позволившую подразделить 34 селектированных варианта на 4 мутантные группы, каждая из которых характеризует определенный антигенный сайт, способный подвергаться независимым изменениям. Два из них ( Sa и БЪ ) были отнесены к штаммоспецифическим, а два других ( Са и СЬ ) - к перекрестно-реагирующим. Анализ природных вариантов НІїїТ с теми же моноклональными антителами позволил авторам сделать вывод, что механизмы антигенного дрейфа действуют неодинаково на различные сайты, идентифицированные в данном исследовании. Использованный "операциональный" метод создания эпитопных карт может, по мнению авторов, быть применен в отношении других природных антигенов, хотя он имеет определенные ограничения при соштнесении с физической структурой молекул. Оригинальный подход к решению этой задачи был предложен J.W. Yewdell et al. (1979). Сравнивая инфекционную активность вируса A/PR/8/34 в отсутствии и при наличии моноклональных антител, исследователи обнаружили, что антигенные изменения в индивидуальных сайтах возникают со средней частотой 10 .
Получение гибридомных моноклональных антител к вирусу А/чайка озерная/Казахстан/470/79
В качестве иммун-пресса для моделирования антигенного дрейфа использовались моноклональные антитела к гемагглютинину вируса А/чайка озерная/Казахстан/470/79 ("а" и "в") и А/Бразилия/П/78 (нс2, нсЗ, нс22, нс29, нсІ42, нс170). Селекцию вариантов проводили на основе метода W.U.Gerhard,R.G.Webster (1978).
Вируссодержащую аллантоисную жидкость (инфекционный титр -91g ЭВДзд/д 2 мл» ТИТР ГА-І/5І2-І/І024) смешивали с разведениями асцитической жидкости, содержащей моноклональные антитела (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, I/I60, 1/320, 1/640), в соотношении 1:10 (0,05 мл вируса + 0,5 мл разведения антител). После 0,5-1 ч контакта смесью "вирус+антитело" заражали 10-дневные куриные эмбрионы. Инфицированные эмбрионы инкубировали при 37С в течение 48 ч. Затем вирусеодержащую жидкость из каждого эмбриона проверяли в РТГА с моноклональными антителами и иммунными крыси-ньми сыворотками. Частоту появления антигенных вариантов (изменений) определяли как разность инфекционных титров вирусов, пассированных при наличии и в отсутствие моноклональных антител ( Yewdell et al. ,1979; Portner et al. ,1980).
Глобулиновую фракцию моноклональных антител из асцитической жидкости получали осаждением сернокислым аммонием при 40% насыщении.
В качестве носителя антител использовали бараньи эритроциты, фиксированные формалином по методу R.Weinbach (1958). Для устранения прямой агглютинации эритроцитов их обрабатывали нейрами-нидазой из нехолерного вибриона (Горьковский НИИЭиМ). К 5 мл 20% суспензии эритроцитов добавляли 0,42 ед нейраминидазы. Смесь инкубировали в течение 90 мин при 37С. (В табл.3 и 4 показана зависимость адсорбционной способности эритроцитов барана от времени обработки нейраминидазой и концентрации фермента). Затем остатки
фермента удаляли центрифугированием, эритроциты разбавляли 0,85% раствором ЫаС1 до концентрации 1% и проверяли их агглютина -бельность по отношению к вирусам гриппа. Присоединение сенситина к эритроцитам осуществляли 0,4% раствором амидола по модифицированному методу Ю.А.Кузьмина с соавт. (1982).
Чувствительность и специфичность препаратов проверяли микро -методом в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) на пластинах микротитратора "Такачи" (Венгрия). К последовательным двукратным разведениям вируссодержащей аллантоисной жидкости (0,05 мл),приготовленным на 0,85% растворе WaCl со стабилизатором (рН 7,2), добавляли 0,5% раствор эритроцитарного диагностикума (0,25 мл). Учет реакции проводили через 2-2,5 ч при полном оседании эритроцитов в контрольных лунках.
Известно, что теория статистики позволяет вычислить степень достоверности результатов исследования, и методика такой работы изложена в многочисленных пособиях. В нашем исследовании мы пользовались изданием В»Ю.Урбаха "Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях" (1975). Определение стандартной ошибки. Материалы нашего исследования являются выборочной совокупностью, поэтому стандартную ошибку среднего значения определяли приближенно по формуле: где бр - стандартная ошибка; XI - число наблюдений. Например, было исследовано 108 сывороток, в 8 случаях был получен положительный результат, что составило 7,4%. Стандартная ошибка при этом равна:
Вычисление доверительного интервала. Широко применяемая формула для 95% доверительного уровня р + 1,9ббр при малых объемах выборок дает слишком неточные результаты, поэтому в статистической обработке была использована вспомогательная величина (преобразованная доля - вариант) по методу Р.Фишера. Последовательно выполнялось следующее вычисление: По таблице "Значениеtp (критерия Стьюдента)" определяем При 95%-ном уровне с учетом числа степеней свободы f ; здесь
Иммунологический анализ вирусов НІШ, изолированных от диких птиц, с использованием моноклональных антител
В дальнейшем был проведен тонкий анализ антигенной структуры изолированных штаммов HINI с набором моноклональных антител к гемагглютинину вируса А/Бразилия/П/78 (нс2, неЗ, нс2, нс9, нс142, нс170) и нейраминидазе вируса А/Денвер/1/57 ( NS1,HS7, NS1Q.). Результаты представлены в табл. 8 и 9.
Как видно из таблиц, титры взаимодействия в РТГА и РПНА с моноклональными антителами у всех четырех вирусов HINI птичьего происхождения одинаковы, следовательно, антигенную структуру гемагглютинина и нейраминидазы этих штаммов можно считать идентичной. Сравнение изолятов с вирусами НІИЇ разных лет выделения позволило установить, что по структуре гемагглютинина они сходны со штаммом А/СССР/090/77 и существенно отличаются от вирусов 1953-1957 гг. выделения. Хотя набор антител к нейраминидазе вируса А/Денвер/1/57, которым мы располагали, был ограничен, результаты РПНА свидетельствуют о том, что небольшие различия в антигенной структуре этого полипептида птичьих вирусов и человеческих штаммов (А/Денвер/1/57 и А/СССР/090/77) имеют место.
Анализ антигенной структуры гемагглютинина вирусов Н1н1 разных лет выделения показал, что по характеру взаимодействия с моноклональными антителами вирус А/СССР/090/77 близок к штамму к/т/1/ЬО.
Таким образом, сравнительное иммунологическое изучение гемагглютинина вирусов HINI, выделенных от диких птиц, с использованием моноклональных антител позволило обнаружить их сходство со штаммом А/СССР/090/77 и с вирусом A/FW/I/50.
Представлялось важным определить, обладают ли изолированные штаммы той же способностью к антигенной изменчивости, которая свойственна вирусам человеческого происхождения.
В этой связи была поставлена задача изучить антигенный дрейф изолятов в условиях иммунного пресса, используя моноклональные антитела. Наибольший интерес представляла минорная изменчивость гемагглютининового антигена как компонента, индуцирующего образование вируснейтрализующих антител. Полная аналогия антигенного профиля гемагглютинина вирусов HINI птичьего происхождения и эпидемического варианта А/СССР/090/77 позволила провести эти исследования в сравнительном аспекте.
Селекцию и иммунологический анализ антигенных вариантов предполагалось провести с использованием антигемагглютининовых моноклональных антител. Поскольку моноклональные антитела реагируют с единичными эпитопами, представляющими весьма небольшие участки молекулы антигена, достоверность результатов анализа антигенной структуры определяется, главным образом, количеством использованных антител (при условии, что они различаются по специфичности, то есть, комплементарны разньм эпитопагл). В связи с этим, представлялось целесообразньм пополнить имевшуюся в нашем распоряжении панель из б антител к гемагглютинину вируса А/Бра-зилия/П/78, используя для получения гибридом один из выделенных штаммов - А/чайка озерная/Казахстан/470/79.
Культуру клеток мышиной миеломы (линия Sp 2/0 - Ag I4-I) поддерживали на среде Дульбекко- ДМЕМ (10% концентрат, " Plow laboratories ") с 10% фетальной сыворотки теленка, I0"3 М пирувата натрия, 5«10 М 2-меркаптоэтанола и антибиотиками (100 мг/мл стрептомицина и 100 мг/мл пенициллина).
Мышей линии BALB/c весом 14-18 г иммунизировали внутри-брюшинно очищенным препаратом вируса (400 мкг на мышь) в смеси с полным адъювантом Фрейнда (соотношение с антигеном - 1:1). Через I месяц (за 3 дня до гибридизации) повторно вводили такую же дозу антигена без адъюванта.
Селезенки 2 мышей гомогенизировали, клетки отмывали от эритроцитов 0,83% раствором хлорида аммония и суспендировали в среде ДМЕМ. В качестве гибридизирующего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля (молекулярная масса - 4000; "мегск "» ФРГ) на среде ДМЕМ. Слияние проводили, постепенно добавляя полиэтиленгликоль к смеси клеток миеломы и спленоцитов при постоянном встряхивании.
Для создания более тесного контакта клетки осаждали центрифугированием в течение 2-3 мин при 800 об/мин, затем добавляли 30 мл ДМЕМ. После повторного центрифугирования при тех же оборотах в течение 8 мин клетки суспендировали в селективной среде -HAT (50% концентрат, " Plow laboratories ", на среде ДМЕМ), содержащей 15% фетальной сыворотки, 10% аглобулиновой лошадиной сыворотки, L -глутамин, аминоптерин (4-Ю I), гипоксантин (10 М), тимидин (1,6 10 М) и антибиотики. К селективной среде для стимулирования роста гибридом была добавлена кондиционированная миеломная среда. Суспензию клеток наносиди на 96-луночные пластины по 0,2 мл (10-10 клеток) на лунку. Использовали как чистые пластины, так и пластины, на которые предварительно (за 1-3 дня) были посажены перитонеальные макрофаги и фиброблас-ты мьши (клетки получали промыванием перитонеальной полости 7,5% раствором сахарозы; отмывали центрифугированием и ресуспендиро-вали в среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки теленка до конечной концентрации 5 10 клеток в мл).
