Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 6
1. Pscudomonas aeruginosa как условный патоген 6
2. Классификация бактериофагов P. aeruginosa 8
2.1. Морфология бактериофагов P. aeruginosa 8
2.2. Гомология геномов бактериофагов P. aeruginosa 10
3. Модульная теория и эволюция бактериофагов 13
3.1. Модульная теория эволюции 13
3.2. Супергруппы бактериофагов 15
3.2.1. Фаги-транспозоны 16
3.2.2. Т4-подобные бактериофаги 17
3.2.3. Т7-подобные бактериофаги 19
4. Фаготерапия 21
4.1. Использование бактериофагов P. aeruginosa в фаготерапии 22
4.2. Проблемы использования живых вирулентных бактериофагов в фаготерапии 23
4.2.1. Общая и специализированная трапсдукция 24
4.2.2. Фаговая конверсия 25
4.2.3. Псевдолнзогения 25
5. Бактериофаг (J)KZ P. aeruginosa 27
5.1. Биологические свойства бактериофага <}>KZ 27
5.2. Структура частицы бактериофага ([)KZ 28
5.3. Геном фага cJiKZ 30
5.3.1. Основные свойства и организация генома 30
5.3.2. Предполагаемые промоторы и терминаторы 32
5.3.3 Внрус-кодирусмые тРНК 33
5.4. Предполагаемые генные продукты бактериофага 34
5.4.1. Сходство генных продуктов фага (J>KZ с известными белками 34
5.4.2. Интрои-коднруемые эпдонуклеазы 40
5.4.3. Генные продукты, вовлеченные в метаболизм нуклеотндов 41
5.4.4. Репликация ДНК 42
5.4.5. Белки фага ^KZ, родственные белкам других бактериофагов 42
5.4.6. Белки фаговой частицы <|>KZ 43
5.5. Бактериофаги группы <}>KZ 44
2 Экспериментальная часть 46
3 Материалы и методы 46
3 Результаты и обсуждение 54
1.ФКг-подобньіе бактериофаги 54
1.1. Сравнение биологических свойств фагов 54
1.1.1. Бактериофаги и их происхождение 54
1.1.2. Выделение новых фК2-подобных бактериофагов 55
1. 1.3. Фенотип негативных колоний фагов 55
1.1.4. Сравнение морфологии фаговых частиц 56
1.1.5. Псевдолизогения 56
1.1.6. Спектр литической активности 58
1.1.7. Способность к общей трапедукцни 61
1.1.8. Инактивация сывороткой 62
1.2. Сравнение геномов фК2-подобных фагов 63
1.2.1. Сравнение размеров геномов 63
1.2.2. Сравнение рестрикціїошіьгх профилей ДНК 63
1.2.3. Определение гомологии ДНК 66
1.3. Сравнение полнпептндного состава зрелых частиц 71
1.4. Некоторые особенности предполагаемых генііьіх продуктов фага фК2 73
1.5. Обсуждение 75
1.5.1 .Эволюция группы (JiKZ-ггодобных бактериофагов 75
1.5.2. Возможность использования фК^подобных фагов в фаготерапии 78
2.Бактериофаг фКМУ 81
2.1. Биологические свойства фага фКМУ 81
2.1.1. Выделение фагафКМУ и внешние признаки негативных колоний 81
2.1.2. Морфология фаговых частиц 81
2.1.3. Спектр литической активности 82
2.1.4. Рост и развитие фага 82
2.2. Изучение генома фага фКМУ 82
2.2.1. Размер и GC-состав генома 83
2.2.2. Рсстрикционнын анализ ДНК 83
2.2.3. Характеристика генома фКМУ, полученная на основе анализа полной последовательности ДНК 86
2.3. фКМУ-подобные бактериофаги 89
2.3.1. Выделение новых (J>KMV-подобных бактериофагов 89
2.3.2. Морфология фаговых частиц 90
2.3.3. Изучение генома новых фКМУ-подобных бактериофагов 90
2.3.4. Спектр лнтнческой активности 92
2.3.5. Феномен взаимодействия фКМУ-подобных и некоторых ([iKZ-ггодобных фагов 94
2.4. Обсуждение 95
2.4.1. Эволюция фКМУ-подобных фагов 95
2.4.2. Возможное практическое применение фагов вида фКМ-V 97
Выводы 98
- Классификация бактериофагов P. aeruginosa
- Бактериофаг (J)KZ P. aeruginosa
- Сравнение геномов фК2-подобных фагов
- фКМУ-подобные бактериофаги
Введение к работе
В последнее время резко увеличилось количество сообщений о появлении клинических нзолятов патогенных бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам (multi-drug-resistant bacteria). Как следствие этого возникла идея возрождения фаготерапии как метода лечения бактериальных инфекций. Однако введение фаготерапии в широкую практику ограничивается определенной опасностью при использовании бактериофагов (фаговая конверсия, трансдукцій и распространение островков патогенності! и др.). Поэтому во всех работах, где рассматривается возможность применения фаготерапии, считается обязательным всестороннее изучение используемых бактериофагов, вплоть до определения полной последовательности геномов.
Среди патогенных бактерий особое значение имеют бактерии Pseudomonas
aeruginosa. Они являются причиной раневых и ожоговых инфекций, осложнений после
хирургических операции и поражений различных органов при иммунодефицитных
состояниях и др. P. aeruginosa колонизирует легкие больных^наследствепным заболеванием
pi о
кистозным фиброзом, что в конечном итоге приводит к летальному исходу. Этот вид микроорганизмов является этнологическим агентом 15-20% всех внутрнбольпнчных инфекций. Такая частая встречаемость P. aeruginosa среди клинических нзолятов вызвана устойчивостью бактерий данного вида ко многим широко используемым антибиотикам а также их способностью легко и быстро образовывать бпонлснкн, непроницаемые для антибиотиков и ферментов, а также генетических векторов, несущих гены, коми лем еі пирующие дефектный ген CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene) при кистозном фиброзе.
В настоящей работе мы провели детальное исследование двух групп бактериофагов P. aeruginosa, представляющих большой научный и практический интерес.
Классификация бактериофагов P. aeruginosa
В природных условиях фагн встречаются там же, где размножаются их хозяева -бактерии соответствующих видов и штаммов. Частоты встречаемости фагов у разных видов бактерий в природных условиях существенно различаются. "Фаговые потенциалы" - количество разных видов фагов и разнообразие отдельных фагов в пределах их вида -также существенно различаются по величине для бактерий разных видов, даже в пределах родственных групп. Среди псевдоманад наибольшим фаговым потенциалом обладает Р. aeruginosa [Krylov V.N. et al, 1993], но даже и в этом случае многие виды фагов представлены единичным фагом [Шарибжанова Т.О. н др., 1992]. Расширение коллекции фагов и последующая их классификация до вида являются не только важной частью фундаментальных исследований. Они должны стать центральными аспектами фаготерапии, предваряющими выбор бактериофагов (особенно при терапии живыми природными фагами [Крылов В.Н,, 2001]. 2.1. Морфология бактериофагов P. aeruginosa. Фагн различаются по морфотппу вирусной частицы, тину нуклеиновой кислоты, несущей наследственную информацию, размеру генома и характеру его репликации. Имеется определенная корреляция морфотипа и типа нуклеиновой кислоты, используемой фагом в качестве генома. Например, все хвостатые фагн в качестве носителя наследственной информации используют, как правило, двунитевую ДНК, мелкие сферические фаги - кольцевую одпоннтевую ДИК, нитевидные фаги - кольцевую одпоннтевую ДНК [Крылов B.IL, 2001]. По морфологии частицы известные фаги относят к нескольким группам семейств вирусов [Classification and Nomenclature of Viruses, 1991]: Л. Группа семейств фагов с двупитевой ДНК в качестве генома. Хвостатые фаги: Myoviridae, Syphoviridae, Podoviridac. Бесхвостые фаги: Corticoviridae, Tectiviridae, Plasmaviridae, группа SSV1, Lipothrixiviridae. Б. Группа семейств фагов с одной нтевоіі ДНК в качестве генома: Micro viridae, Inoviridae - Plectovirus, Inoviridae - Inovirus. В. Семейство фагов с двупитевой РНК в качестве генома: Cystoviridae. Г. Семейство фагов с одноннтевой РНК: Lcviviridae. Типичные для бактерий хвостатые фаги не описаны среди вирусов эукариот.
Особенности морфотипа хвостатых фагов обусловлены активным способом введення в клетку генетического материала — адсорбция на специфических бактериальных рецепторах с использованием специфических белков хвоста, иногда - прокол наружных клеточных покровов после их предварительного разрыхления ферментами, иногда -использование тех пли иных пор в покровах бактерии. По классификации Международного комитета по таксономии вирусов [Classification and Nomenclature of Viruses, 1991, Ackcrmann, H.-W., M. DuBow, 1987,] вес бактериофаги P. aeruginosa относятся к отряду фагов с хвостовыми отростками (Tailed Phages) и имеют следующие признаки: Морфология: Вирусные частицы состоят из головки (капсида), хвостового отростка и фиксированных органелл. Головка изометрическая или вытянутая, в форме икосаэдра или производной от пего. Изометрические головки 45 - 170 им в диаметре, вытянутые - до 230 им в длину. Хвостовые отростки могут быть сократимыми или несократимыми, спиральными, длинными или короткими. Они могут иметь базальные пластинки, шипы нлп нити. Физико-хттческис свойства: M\V = 29-470 х 106Da , может быть больше. Плавучая плотность в CsCl = 1.41 - 1.55 г/см . Инфекционная активность устойчива к эфиру и хлороформу. Чувствительность к детергентам варьирует. Нуклеиновая кислота: Одна молекула линейной двухцепочечнон ДНК. GC-состав обычно близок к GC-составу хозяина. Гены со связанными функциями часто объединены в один кластер. Белки: Вирусные частицы содержат много различных полнпептндов. Лнзоцнм локализован в конце хвостового отростка. Могут присутствовать другие ферменты. По структуре хвостового отростка фаги разделяют на три семейства. Семейство Myoviridae - фаги с сократимыми хвостовыми отростками. Хвостовой отросток сократимый, длинный (80 - 455 им), состоит из центрального стержня и сократимого чехла. Относительно большие капсиды. По строению капепда различают Myoviridae с изометрической головкой и Myoviridae с удлиненной головкоп. Некоторые представители: РВ-1, KZ, Lin68, PS17 - изометрическая головка; ф\ - удлиненная головка. Семейство Siphoviridae - фаги с длинными, несократимыми хвостовыми отростками. Хвостовой отросток несократимый, длинный (64 — 570 им). Некоторые представители: D3, SM, G101, фагн-трапепозоны. Семейство Podoviridae - фаги с короткими хвостовыми отростками. Хвостовой отросток короткий (около 20 им) и несократимый. Некоторые представители: РТВ2, {pmnF82, F116. По форме головки бактериофаги подразделяют на дополнительные морфотипы [Ackermann II.-W. et al., 1988]: фаги с изометрической головкой - Al, Bl, С1; фаги с удлиненной головкой (отношение длины к ширине 1.5 - 2) - Л2, В2, С2; фаги с очень длинной головкой (отношение длины к ширине более 2.5 - 3) - ЛЗ, ВЗ, СЗ. Буквы Л, В, и С указывают на принадлежность к семейству Myoviridae, Siphoviridae и Podoviridae соответственно. На рис. 1 представлены разные морфотипы бактериофагов P. aeruginosa по данным [Шарнбжапова Т.О. н др., 1992]. 2.2. Гомологии геномов бактериофагов P. aeruginosa
До недавнего времени основными методами классификации бактериофагов оставались методы морфологического и серологического сравнения. Такая классификация не может считаться полноценной, т.к. основана на характеристике только некоторых структурных генов, а не всего генома [Ackermann II.-W. et al., 1988]. В связи с этим в лаборатории генетики бактериофагов ГосІІИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов была проведена классификация до вида 113 бактериофагов P. aeruginosa с учетом сравнения гомологии геномов и электронной микроскопии фагоа [Шарнбжапова Т.О. и др., 1992; Krylov V.N. et al., 1993], Таким образом, для классификации фагов до вида необходимыми и достаточными являются признаки, полученные при исследовании перекрестной гомологии геномов и электронной микроскопии частиц [Шарибжапопа Т.О. и др., 1992; Krylov V.N. et al., 1993.; Крылов B.H. и др., 1989.; Ackermann, П.-W., et al., 1992]. Использование лишь одного из этих подходов не достаточно. Известны как случаи близкого генетического родства фагов, имеющих разную морфологию частицы, или случаи наличия ДИК-гомолопш у фагов разных видов, так и, напротив, отсутствие генетического родства морфологически идентичных фагов [Susskind М., Botstcin D., 1978; Крылов В.Н. и др., 1992; Korsten К. Н. et al., 1979; Ахиердяп В.З. и др., 19986.]. Для отнесения фагов к одному виду на основе исследования гомологии геномов принят тот же количественный критерии (70% гомологии и выше), который используется в классификации бактерии [Classification and Nomenclature of Viruses, 1991]. При использовании морфологического критерия фаги, относимые к одному виду, должны обладать идентичным морфоттюм и размерами [Ackermann H.-W., et al. 1992]. Иногда, кроме того, используют такие критерии, как GC-состав, размер генома, наличие специфических основании в нуклеиновой кислоте, данные серологического сравнения. 3. Модульная теоріїп и эволюция бактериофагов 3.1. Модульная теории эволюции Известно два возможных пути эволюционного процесса - дивергенция (расхождение признаков организмов в ходе эволюции) и конвергенция (сближение признаков у неродственных групп организмов), В способах эволюции фагов с использованием рскомбпнационпых процессов сейчас большое значение уделяется обмену модулей генетического материала. Модульная теория эволюции изначально была сформулирована на основе данных, полученных при анализе структурной и функциональной гомологии геномов лямбдондных бактериофагов Е. coli между собой и с фагом Р22 Salmonella [Harshey R.M., 1971; Botstcin D., Herskowitz J., 1974; Campbell A., 1977; Botstcin D., 1980]. Было установлено, что в сходных участках геномов родственных фагов расположены группы генов и сайты, отвечающие за сходные функции (репликацию, рекомбинацию, иммунитет, морфогенез головки и хвостового отростка, лнзнс клеток и др.).
Бактериофаг (J)KZ P. aeruginosa
Общие свойства бактериофага tj KZ. Бактериофаг } KZ образует на бактериях Р. aeruginosa PAOl мелкие негативные колонии с характерной голубой опалесцепцнеп. Однако размер, морфология и опалесценция негативных колоний фага )KZ в существенной степени могут изменяться в зависимости от штамма, используемого в качестве хозяина [Крылов В.Н., Жазыков И.Ж., 1978]. Для фага (f»KZ характерны необычайно высокие выходы фага при получении методом сливного лизиса. Конечный выход фага в расчете на одну чашку при стандартных условиях составляет 10 - 10 частиц. Препараты фага } KZ, не подвергнутые скоростному центрифугированию, обладают высокой вязкостью. Инактивация частиц фК2 различными агентами. Бактериофаг (J KZ проявляет большую устойчивость к обработке различными агентами по сравнению с бактериофагом Т4 Е. coli [Крылов В.Н., Жазыков И.Ж., 1978]. Фаг (J)KZ устойчив к осмотическому шоку. В условиях, когда фаг Т4 ипактпвпруется на 97%, инактивации фага KZ практически не происходит. (JKZ существенно устойчивее фага Т4 к тепловой инактивации в бульоне: после прогревания в течение 60 минут при 60 С смеси фагов инактивпруется 99% фага Т4 и лишь 60% фага (} KZ. Фаг (J KZ незначительно устойчивее фага Т4 к облучению ультрафиолетом, и на кривой инактивации имеется плечо при слабых дозах облучения. Фаг ([)KZ достаточно чувствителен к додецнлеульфату натрия. Обработка (-iKZ данным агентом при 45 С приводит к быстрой утрате фагом жизнеспособности: после _Л трехминутной обработки выжинает 3% исходного фага, спустя 30 мин - менее 10 исходного фага [Крылов В.Н., Жазыков И.Ж., 1978]. Цикл роста фага фК2. Продолжительность минимального латентного периода для фага (J KZ составляет 60 - 65 минут при 37 С [Крылов В.П., Жазыков И.Ж., 1978]. Урожаи, определяемый после 2 часов инкубации, составляет от 80 до 300 частиц на клетку. Бактериофаг KZ имеет затянутый период лизиса. Через 120 минут после заражения лнзнрованы лишь единичные клетки [Смирнова Т.А. н др., 1983]. Способность к oUiifeii транедукции. Бактериофаг KZ является общетранедуцнрующим фагом [Джусупова А.Б. и др., 1982].
Его трапедуциругощая активность обнаружена при использовании в качестве реципиента штаммов, несущих плазмиду Rmsl48, относящуюся к 1псР7 группе [Jacoby G.A., 1982], ннгпбирующей внутриклеточное развитие f»KZ. 5.2. Структура частицы бактериофага ([ KZ Фаговая частица (J)KZ. относится к основному морфотипу А1 по классификации Бредлн-Аккермана [Ackermann H.-W. et al., 1984]. Частица бактериофага (J KZ обладает очень большими размерами: диаметр головки составляет 120 им, несокращенный хвостовой отросток имеет длину 180 им и ширину 20 им [Крылов В.Н. и др., 1978.]. Головка имеет форму икосаэдра с ребром, равным 60 им. Внутренний объем головки фага ifKZ превышает внутренний объем головки бактериофага Т4 в 2,7 раза. У фага ()KZ имеется структура типа воротничка, расположенная в проксимальной части хвостового отростка, дистальный конец отростка снабжен нитями. Хвост KZ ригидный и состоит из сократимого чехла и сердцевины с центральным стержнем. Несокращенный чехол имеет поперечную исчерчепиость. Сокращение чехла сопровождается его утолщением и перегруппировкой его субъедшшц. Уникальное свойство (JiKZ. - присутствие в фаговом капенде специфичной внутренней структуры, видимой in situ на электронных микрофотографиях [Крылов и Жазыков, 1978., Крылов В.Н. и др., 1978]. Эта структура состоит из внутренней части с низкой электронной плотностью, названной "центральное тело" н внешней части, которая видна как тонкие нити, намотанные на центральное тело по принципу катушки (рис. 2). Центральное тело представляет собой цилиндр диаметром около 35 им и длиной порядка 90 им. Расположение этого центрального тела внутри ннтактного капсида обычно совпадает с продольной осью хвостового отростка фага. После разрушения фаговой частицы замораживанием-оттаиванием внутреннее тело выходит из головки в относительно неповрежденном виде. Частицы ( KZ, адсорбированные на клеточной поверхности, обычно имеют сокращенный чехол и не имеют внутрнкапсиднон структуры, в отличие от ннтактных частиц, но иногда содержит материал, похожий на остатки центрального тела. Предполагается, что центральное тело исчезает после ДНК-ннъекцин [Krylov V.N. ct al., Исследование ультратонкнх срезов инфицированных бактериальных клеток Р. aeruginosa на разных этапах внутриклеточного развития фага KZ позволило наблюдать формирование конденсатов ДНК в виде "пружины", намотанной на стержень -внутреннее тело [Смирнова Т.А. и др., 1983]. Таким образом, предполагается, что фаг )KZ обладает необычным способом упаковки ДНК, а спиралевидное образование цилиндрической формы внутри фагового калсида представляет собой нуклеопротеидную структуру с ДНК, упакованной в виде "катушки ниток" [Krylov V.N. et al., 1984]. 5.3. Геном фага (J KZ Геном фага { KZ представляет собой линейную двухцепочечную ДНК [Крылов В.Н. и др., 1978].
Генетическая карта j KZ кольцевая с кольцевыми пермутацнями и терминальной избыточностью [Тяглов Б.В. и др., 1980; Плотникова Т.Г. и др., 1982]. Недавно в результате совместной работы с лабораторией генной технологии Католического университета г. Левей, (Бельгия) и лабораторией Института бноорганической химии РАН была определена полной последовательности генома фага (j)KZ [Mesyanzhinov V.V. ct al., 2002]. Анализ полной последовательности ДНК проводился с помощью баз данных и набора компьютерных ыолекулярно-бнолотческих программ BLAST, GcneMark, PROSITE, РГага и др. [Borodovsky М., Mclninch, J. 1993; Bateman A. et al., 2000; Besemer J., Borodovsky M. 1999; Hofmann K. ct al., 1999]. 5.3.1. Основные свойства it организация генома $KZ. Геном бактериофага KZ содержит 280 334 п.н. Это самый большой из геномов вирусов бактерии с известной к настоящему времени полной последовательностью ДНК (для сравнения геном фага Т4 содержит 168 900 п.н. [Kuttcr Е. ct al., 1994]). Содержание GC-nap ДНК фага j KZ составляет 36.8 %, что сопоставимо с содержанием GC-пар у фага Т4 и существенно ниже, чем у бактерии-хозяина P. aeruginosa с GC-богатым (65 %) геномом [Stover С.К. et al., 2000]. ДНК (j KZ практически не содержит GC-богатых последовательностей в регионах, кодирующих белки, по некоторое повышение GC-состава наблюдается в межгенных участках, занятых фактор-независимыми транскрипционными терминаторами. Компьютерный анализ последовательности ДНК KZ показал наличие 306 потенциальных открытых рамок считывания (ОРС) (см. рис. 3), кодирующих полппептнды размером от 50 до 2237 аминокислотных остатков. Большинство ОРС инициируют трансляцию с AUG кодона, две - с GUG и 4 - с UUG кодонов. Геном } KZ содержит несколько генных кластеров, большинство ОРС ориентированы по часовой стрелке. Из 306 предполагаемых ОРС только 55 находятся в ориентации против часовой стрелки. GC-состав примерно одинаков для ОРС, ориентированных как по- так и против часовой стрелки. Самый большой кластер расположенных подряд генов с одинаковой транскрипционной ориентацией содержит 88 ОРС Как и у других хвостатых фагов с двухцепочечной ДНК [Kutter Е. et al., 1994; Juhala, R.J. ct al., 2000] OPC (J KZ организованы компактно, с небольшими промежутками между генами, которые обычно заняты предполагаемыми регуляторними последовательностями (промоторами и терминаторами). Однако, промежутками между некоторыми ОРС н внутри тРНК-кодирующих участков содержат относительно длинные последовательности ДНК, не кодирующие белки или какие-либо другие функции. 5.3.2. Предполагаемые промоторы и терминаторы.
Сравнение геномов фК2-подобных фагов
Новые фК2-подобиые фаги были выделены не одновременно, поэтому сравнение геномов фагов проводили последовательно. 1.2.1. Сравнение размеров геномов Геном бактериофага $KZ содержит 280 334 п.н. Одинаковый размер капсидов фаговых частиц исследуемых фагов и данные рестрикцпопного анализа свидетельствуют, что размеры геномов других фК2-подобпых фагов сопоставимы с размером генома (j KZ (больше 250 т.н.п.), у фагов EL и RU размер генома может быть чуть меньше. 1.2.2. Сравнение рестрикциоппых профилей ДИК Согласно данным Тяглова Б.В. и др. (1980) к данным, полученным на основе анализа полной последовательности, ДНК tj KZ устойчива к группе эндонуклеаз (Лгог1, Pstl, Sac\, Sitial, Х1ю\ и ХтаШ), сайты для которых имеют высокое содержание GC-nap. ДИК всех новых фкг-подобных фагов устойчива к обработке эндонуклеазамн Pst\ и Xliol, как и ДНК 0KZ. На рис. 8, 9 и 10 приведены результаты рестрикции ДНК ф -подобпых фагов эндонуклеаз ой НітіШ. Четырнадцать из шестнадцати бактериофагов обладают уникальным рестрнкцноиным профилем. По характеру рестрикции все ф -подобные фаги делятся на три группы. Первая группа - фаги NN, LBG20, LBG21, LBG23, и LBG26, а также фаги PBD - проявляют значительное сходство в рестрнкцношюм профиле с фагами вида фкг (фКг, Lin21 и РТВ80) и содержат много идентичных фрагментов ДНК. Особенностью группы фагов PBD в сравнении с фагами группы LBG является их меньшее отличие от фК2!, а фаги PBD1 и PBD3 различаются всего по одному рсстрнкцнопному фрагменту (см. рис. 10). Кроме того, у вновь выделенных фагов наблюдается сходство с другими рапсе изученными фагами вида { KZ (РТВ80 и Lin21) по наличию или отсутствию характерных рестрикциоппых фрагментов, отличающих их от $KZ, что свидетельствует о высокой частоте рекомбинации между ними в природных условиях. С другой стороны, можно отметить определенную ограниченность числа и распределения сайтов, чувствительных к рестрнкцноиным зі ідо нукл сазам, в геномах этой группы фКг-подобных фагов. Так, фаги PBD отличаются от фага NN минимальным количеством рестрикционных фрагментов (от 3 до 5), сам же фаг NN по рестрикционному профилю наиболее близок к фагу )KZ (различие всего по трем фрагментам). Всего же из 12 фагов, составляющих первую группу фКг-подобных фагов со сходным характером рестрикции, Фаги EL и RU имеют высокий уровень гомологии ДНК (рис. 14)..
Отличительной особенностью фагов EL и RU является полное отсутствие гомологии их ДНК с ДНК всех остальных фК2-подобных фагов (рис. 11, 13 и 14). Это позволяет отнести фаги EL и RU к новому отдельному виду фК2-подобных бактериофагов - виду EL. Таким образом, на основании данных по сравнению геномов фК7-подобные бактериофаги можно отнести к трем видам: фК, Lin68 и EL (Таблица 5): На рис. 15 и 16 представлены результаты электрофоретического разделения в денатурирующем полиакриламидном геле структурных белков зрелых частиц фагов изучаемой группы. Каждый из фагов содержит несколько мажорных белков, сходных по молекулярному весу с соответствующими белками других фагов. Общее количество выявляемых индивидуальных белков у разных фагов приближается к 40. Все фаги вида фКг не отличаются друг от друга по набору белков. Фаги Lin68 и LBG22 содержат меньшее количество видимых полипептидов и проявляют небольшое отличие между собой. Таким образом, фаги видов ( KZ и Lin68 отличаются не только морфологически, но На рис. 15 и 16 представлены результаты электрофоретического разделения в денатурирующем полиакриламидном геле структурных белков зрелых частиц фагов изучаемой группы. Каждый из фагов содержит несколько мажорных белков, сходных по молекулярному весу с соответствующими белками других фагов. Общее количество выявляемых индивидуальных белков у разных фагов приближается к 40. Все фаги вида фКг не отличаются друг от друга по набору белков. Фаги Lin68 и LBG22 содержат меньшее количество видимых полипептидов и проявляют небольшое отличие между собой. Таким образом, фаги видов ( KZ и Lin68 отличаются не только морфологически, но и по количеству определяемых в опыте полипептидов, входящих в состав капсида. Фаги вида EL отличаются по набору полипептидов от фагов двух других видов. В Таблице 8 приведено сравнение N-концевой последовательности главного белка капсида с молекулярным весом около 66 кДа у фагов трех видов. Обнаружено, что фаги двух видов, j)KZ и Lin68, несмотря на практически полное отсутствие гомологии ДНК, имеют идентичные последовательности, тогда как фаги EL и RU имеют другую последовательность этого мажорного белка фаговой частицы. Это подтверждает наши данные о том, что фаги вида Lin68 сохраняют большее родство с фагами вида })KZ, чем фаги вида EL. Как уже отмечалось выше (см. обзор литературы) в геноме $KZ идентифицировано 306 потенциальных открытых рамок считывания. Обращает па себя внимание несколько фактов. Прежде всего, доля генов, кодирующих продукты с известной функцией, не высока и составляет около 20% от общего числа генов.
Схожая ситуация характерна и для бактериофага Т4, у которого происхождение большинства фаговых генов не известно. Среди идентифицированных продуктов генов фага JtKZ большая часть представлена белками, связанными с метаболизмом предшественников нуклеиновых кислот; при этом следует отмстить, что несколько продуктов генов, по-видимому, являются вирус-специфическими РНК-пол нмеразами, что может способствовать расширению спектра используемых хозяев. Другая интересная особенность фК2 -отсутствие продуктов генов, сходных с какой-либо из известных ДНК-полпмсраз, что позволяет ставить важные вопросы о возможных способах репликации данного фага. Также не было найдено предполагаемых })К2-коднруемых белков, которые имели бы сходство с белками хозяина P. aeruginosa. Важной особенностью генома фага является наличие генов, кодирующих белки, которые гомологичны продуктам как различных Фаги [ KZ-rpynnLi проявляют значительное сходство по многим признакам (широкий спектр литнческой активности, внешний вид негативных колоний, особенности роста и развития, морфология фаговой частицы, размер генома и др.), что свидетельствует об их филогенетичеком родстве. Высокий уровень ДИК-гомолопш 12 изученных фагов: )KZ, РТВ80, Lin21, NN, четырех фагов серни LBG и фагов серни PBD позволяет отнести их к одному и тому же виду (} KZ. Фаги EL и RU, проявляющие гомологию между собой, но не с остальными фагами, отнесены к другому виду EL (по названию первого выделенного фага такого типа). Наконец, фаги Lin68 и LBG22, хотя проявляют только слабую гомологию с ДИК } KZ, и относятся к отдельному виду Lin68, по-видимому, сохраняют значительно большее родство с j)KZ, чем фаги вида EL. Подтверждением этого является сходство N-концевой последовательности главного белка капсида и наличие гомологии ДНК. Последние результаты анализа полной последовательности генома бактериофага EL [Henveldt К. et al., Genome comparison of Pseudomonas aeruginosa large phages, in press; Крылов В.II. и др., 2005] подтвердили отсутствие какой либо гомологии с фагом (J KZ на уровне ДНК. В то же время 81 из 201 генных продуктов фага EL оказались гомологичными белкам фага фК2, что подтверждает филогенетическое родство данных фагов, причем около половины этих белков не встречаются пи у одного из организмов. Проведенный анализ показал значительные различия в организации геномов фагов [ KZ и EL, которые свидетельствуют об особенностях эволюции этих фагов. Фаги группы ()KZ часто встречаются а природных популяциях. Это обусловлено тем, что ф -подобные фаги имеют очень широкий спектр литнческой активности в пределах вида P. aeruginosa її часто инфицируют штаммы, устойчивые ко всем остальным известным вирулентным фагам этого вида бактерии. Причин этому может быть несколько. Во-первых, фагн с большими геномами как у J KZ могут содержать гены, замещающие функции бактериальных генов, обязательных для развития других фагов (в том числе и те, функции которых подавляются плазмидамн).
фКМУ-подобные бактериофаги
Учитывая уникальные свойства бактериофага фКМУ, мы решил» выяснить, на сколько широко такие фаги распространены в природе. Основным признаком при отборе новых фагов служил вид негативной колонии (крупная, прозрачная, с характерным ореолом). При изучении проб из различных природных водоемов и коммерческих фаготерапевтнческнх препаратов, были отобраны 8 бактериофагов, сходных по виду негативных колоний с фКМУ. Фаги PRA5, PRA6, PRA7 - выделены из природных водоемов Москвы и Московской области, PGR - выделен в Германии из Дуная, PRA1, PRA3, PRK, и FMV - выделены из коммерческих фаготерапевтнческнх препаратов различных производителей. Фаг PRK образует еще более крупные негативные колонии, Первая группа - это фаги PRA5, PRA6, PRA7 и PGR - имеют абсолютно идентичные с фКМУ рестрикционные профили по всем использованным рестриктазам (EcoKV, Hindlll, SalGl, Smal, Xbal). Рестрикционные профили фагов второй группы - PRA1, PRA3 и PRK -идентичны. Они минимально отличаются от рестрикционных профилей фагов первой группы (при использовании эндонуклеаз EcoRV и Hindlll) или не отличаются вовсе (при использовании эндонуклеаз SalGl, Smal, и Xbal). Третью группу составляет единственный фаг FMV, который при использовании рестриктаз EcoRV и Hindlll в большей степени отличается по рестрикционному профилю от фагов первых двух групп. Однако, при обработке ДНК FMV "крупнощепящей" рестриктазой Xbal рестрикцикционные профили фагов FMV и фКМУ оказались идентичными. Это может свидетельствовать о большой консервативности геномов фКМУ-подобных фагов и исчерпании ими возможностей мутационной изменчивости. Гибридизационный анализ. На рис. 21 представлены результаты гибридизации ДНК фагов всех трех рестрикционных типов (фаги PRA3, фКМУ и FMV) с меченой Р ДНК фага фКМУ (гибридизацию фКМУ с ДНК фагов, идентичных фКМУ или PRA3 по рестрикционному профилю, не проводили). Все рестрикционные фрагменты фагов PRA3 и FMV имеют высокий уровень гомологии с ДНК фКМУ.
Полученные данные позволяют отнести все фаги исследованной группы к одному новому виду фКМУ. Чтобы выяснить, есть ли какие-либо легко определяемые биологические различия между фагами вида фКМУ, сходными по электрофоретическому профилю фрагментов ДНК, мы сравнивали спектры литической активности всех фагов данной группы на клинических изолятах P. aeruginosa на штаммах с плазмидамн и на фагоустойчивых мутантах, отобранных к различным бактериофагам. Фагн исследованной группы различались по росту на клинических изолятах / . aeruginosa и могли лизнровать около 25% всех исследованных клинических штаммоіі. Из исех использованных в опыте плаз.мнд (PMG73, Rmsl39, PMG1, PMG35, RmsI65, Rip64, RPL1 1, Rmsl63, Rmsl48 и Pmg53) только PMG53 ограничивает рост фагов вида фКМУ. Из 90 независимо отобранных фагоустойчнвых мутантов P. aeruginosa PAOl } KMV-нодобные фаги росли на 40 мутантах. При этом фагоустойчивыс мутанты, полученные к любому из фКМУ-подобных фагов, ограничивали рост всех фагов данной группы. Результаты опыта по изучению уровня адсорбции показали, что это ограничение вызвано утратой адсорбции фага. Это свидетельствует об одинаковой природе рецепторов, используемых для адсорбции всеми фагами фКМУ-тина. В таблице 13 представлены результаты сравнения фагов вида } KMV на нескольких клинических нзолятах бактерий. Все фаги можно распределить но спектру литнчсской активности и б групп: 1) PRA1, PRA3; 2) PRA5, PRA6, PGR; 3) PRA7; 4) PRK; 5) фКМУ; 6) FMV. Как можно видеть, в группах фагов, объединенных но сходству рестрнкщюнных профилей, есть фаги, отличающиеся по спектру литнчсской активности (например, в группе из 5 фагов - фКМУ, PRA5, PRA6, PRA7 и PGR- неотличимых от )KMV по характеру рестрикции, выявлено три разных типа по спектру роста, в другой группе из 3 сходных по рестрикцнонным профилям фагов - PRA1, PRA3 и PRK - найдено еще два других типа по спектру роста). Таким образом, ряд фагов в пределах групп, сходных по распределению сайтов рестрикции, имеют различия по спектру роста на клинических нзолятах бактерий, и, следовательно, имеют определенные отличия в геномах. 2.3.5. Феномен взаимодействия фКМУ-подобпых и некоторых фкг-нодобных фагов. Способность фКМУ-подобных фагов успешно инфицировать многие клинические изоляты P. aeruginosa делает их привлекательными для применения в фаготерапии. Однако, к фКМУ-подобным фагам легко отбираются фагоустойчивые бактерии, и поэтому эти фаги можно использовать только в смеси с фагами других видов, лизнрующими фагоустойчпиые бактерии. В этой связи представляет интерес обнаруженное в ходе данной работы свойство фКМУ-подобных фагов специфически взаимодействовать с фК-Z-подобнымп фагами вида EL, обладающими широким спектром лнтической активности. Эффект был обнаружен благодаря упомянутой выше способности фагов вида фК-MV расти в течение 2 — 4-х дней с увеличением размера негативных колоний па чашках с бактериальным газоном. При посеве уколом фагов вида фКМУ па свсжсзасеянным газон фага EL (в свою очередь нанесенный на свежий бактериальный газон) после 2-х суточной инкубации вокруг зоны роста фагов вида фКМУ становится видно кольцо опалесцепцнп, усиливающейся в ходе дальнейшей инкубации (рис. 22). Опалесценция означает обычно высокую концентрацию фага. Действительно, как было обнаружено, концентрация фага EL в ореоле на несколько порядков выше, чем вне его.
Хотя молекулярный механизм этого эффекта пока не исследован, если такое взаимодействие происходит и in vivo, оно представляет безусловный интерес для практической фаготерапии. 2.4. Обсуждение 2.4.1. Эволюция фКМУ-подобных фагов. Анализ полной последовательности генома фага фК-MV обнаружил его значительное родство с фагом Т7 на уровне гомологии белков и сходства их третичной структуры. Полное отсутствие гомологии фКМУ с Т7 (также как и с другими бактериофагами) на уровне ДНК говорит о том, что фКМУ можно рассматривать как фаг, эволюционно удаленный от других членов семейства Podoviridae (к настоящему времени семейство Podoviridae включает в себя 41 фаг). В то же время, гомология белков фагов фКМУ и Т7 свидетельствует о родстве Т7-подобных фагов энтеробактерий и фКМУ, инфицирующего псевдоманады. Полученные данные в основном согласуются с модульной теорией фаговой эволюции [Campbell Л., 1977; Botstein D., 1980], указывая на общее происхождение двухцепочечных ДНК-содержащнх фагов с короткими хвостами. По мере эволюции их общего предка возникла способность инфицировать различные виды бактерий и произошла дальнейшая дивергенция, направленная на адаптацию бактериофаг-хозяин [HendrixR. W.etal., 1999]. С научной точки зрения геном (J KMV даст возможность изучать генетические структуры, расширив спектр хозяев, ранее лимитированный Е. coli (Т7 и ТЗ) [Dunn J. J., Studier F. \V., 1983; Pajunen M. I. et al., 2002], Yersinia entcrolitica ( j)Ye03-12) [Pajuncn M. I. et al., 2001], Roseobacter (SlOl) [Rohwer F.L. et al., 2000] и некоторыми другими фагами, преимущественно эптсробактернй. Поэтому включение в этот список фагов P. aeruginosa обеспечивает лучшее понимание происхождения фагов семейства Podoviridae и их эволюционных путей развития. Большое соответствие в использовании кодонов между фагом J)KMV и его хозяином, а также отсутствие в геноме фКМУ сайтов узнавания для многих эндонуклеаз рестрикции свидетельствует о длительной истории взаимодействия фКМУ с P. aeruginosa. В то же время отсутствие гомологии между фКМУ и P. aeruginosa указывает на отсутствие горизонтальных переносов генов между ними. Обнаружение новых фКМУ-подобных фагов свидетельствует о том, что они достаточно широко распространены в природе. Все 8 вновь выделепных бактериофагов по совокупности свойств генома, морфологии фаговых частиц и феногенетнческим признакам отнесены к виду J KMV семейства Podoviridae. Характерными особенностями стратегии развития: фагов данного вида являются очень быстрое развитие фага и лизис хозяйской клетки при относительно небольшом выходе зрелых фаговых частиц.
