Введение к работе
Актуальность темы. На протяжении многих лет антибиотики являются стандартным методом лечения бактериальных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, такими как Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. и другие. Появление все возрастающего количества резистентных к антибиотикам патогенных микроорганизмов представляет существенную проблему, как с клинических, так и с эпидемиологических позиций (Трапезов Е. В. и др., 1990; Кушнарева Н. В., 2000; Shasha S. M. et al., 2004; Borysowski J. et al., 2006).
Одним из перспективных средств воздействия для успешной профилактики гнойно-септических инфекций, вызванных патогенными бактериями, являются бактериофаги (Навашин С. М., 1997; Clarke T., 2003; Abedon S. T., 2012).
Терапевтическая эффективность бактериофагов к клеткам-хозяевам была показана на моделях in vitro и in vivo (Chibani-Chennoufi S. et al., 2004; Dixon B., 2004; Oliveira A. et al., 2009; Carmody L. A. et al., 2010). Успешное применение бактериофагов при гнойно-септических заболеваниях, вызванных бактериальными возбудителями, исследования, проведенные во Франции, Польши, России показали положительные результаты лечения от 81,5 % до 95,6% случаев. Проведение фаготерапии пациентов с поддиафрагмальным абсцессом тощей кишки, инфекцией после имплантации протеза бедра, артритом коленного сустава, остеомиелитом большеберцовой кости, при несрастании бедренной кости также дало положительные результаты (Lang G. еt al., 1979; Slopek S. еt al., 1983,1984,1985а,1985б,1987; Kochetkova V. A. еt al., 1989; . et al., 1994; . et al., 2000; ., Morris JG. Jr., 2001; Soothill J. et al., 2004; Abedon S. T. et al., 2011).
В последнее время ведутся исследования иммуномодулирующих свойств как очищенных фагов, так и коммерческих препаратов, которые кроме фаговых частиц содержат лизаты бактерий и, часто, компоненты культуральной среды (Филиппова Т. О., 2010). Не исключено, что и сам бактериофаг, как организм, содержащий белковый капсид и чужеродную ДНК, может обладать определенной антигенностью и вызвать иммунные реакция на фаготерапию.
Известно, что фаги при пероральном введении могут проникать через слизистую желудочно-кишечного тракта и длительное время персистировать в организме (Smith H.W., Huggins M. B., 1982; Reynaud A. еt al.,1992). При этом они проникают везде, от лимфатических узлов до селезенки, и могут оказывать прямое влияние на иммунокомпетентные клетки (Weber-Dabrowska B. еt al.,1987).
Степень разработанности темы исследования. Всесторонние исследования по изучению бактериофагов позволяют использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, биотехнологии, ветеринарии и медицине: косметологии, иммунологии, урологии, гинекологии, офтальмологии, эндопротезировании, гнойной хирургии, борьбе с нозокомиальными инфекциями и др., то есть фаготерапия является одним из перспективных направлений для практического здравоохранения (Щелкунов С.Н., 2004; Акимкин В. Г. и др., 2010; Красильников И. В. и др., 2010, 2011). Однако, вместе с этим, в литературе нет результатов морфологических исследований структуры органов иммунитета (в частности лимфоидных органов, таких как селезенка и лимфатические узлы) и печени в процессе использование бактериофагов in vivo.
Цель исследования. Определить результаты применения специфического бактериофага при пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), у крыс, и основные реакции печени, селезенки и лимфатических узлов после введения фага здоровым животным.
Задачи исследования:
-
Методами световой микроскопии исследовать состояние печени крыс после внутривенного и перорального введения бактериофага Р57.
-
Изучить основные изменения структурной организации селезенки после применения бактериофага Р57.
-
Выявить отличия реакций брыжеечных лимфатических узлов при различных способах доставки бактериофага Р57 в организм.
-
Оценить результаты использования бактериофага Р57 на фоне экспериментальной пневмонии, вызванной синегнойной палочкой.
Научная новизна. Впервые определена эффективность использования бактериофага Р57 на фоне экспериментальной пневмонии, вызванной синегнойной палочкой. Показано, что пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных.
Впервые продемонстрировано, что введение фаголизата бактериофага 57 непосредственно в пищеварительный тракт крыс сопровождается обширными некрозами паренхимы, выраженной диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрацией печени, что с связано с прямым поступлением в данный орган большой концентрации частиц бактериофага в сочетании с токсинами и антигенами синегнойной палочки. При внутривенном введении фаголизата изменения печени, по сравнению с интактным контролем, практически отсутствуют.
Впервые показано, что применение фага не вызывает значительных изменений в структуре селезенки, пероральный способ введения фаголизата активирует меньше реакций со стороны данного органа, относительно внутривенных инъекций.
Впервые изучены реакции лимфатических узлов после перорального и внутривенного введения бактериофага. Обнаружено, что расширение герминативных центров лимфоидных узелков брыжеечных лимфатических узлов в сочетании с высоким содержанием деструктивно измененных клеток, наличие эозинофилов, а так же большое содержание макрофагов в синусах мозгового вещества происходят при введении фаголизата непосредственно в пищеварительный тракт, что обусловлено прямым поступлением в данные органы непосредственно частиц фага в сочетании с токсинами и антигенами разрушенных бактерий синегнойной палочки. Внутривенное введение фаголизата способствует практически полной сохранности структуры указанных лимфатических узлов.
Теоретическое и практическое значение работы. Получены новые знания об особенностях изменений печени, селезенки и лимфатических узлов при различных способах доставки бактериофага в организм. В связи с тем, что пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных показано применение этого фага для лечения всех инфекционных процессов, главным этиологическим фактором в которых является синегнойная палочка. Так как в легких крыс после фаготерапии пневмонии на фоне введения синегнойной палочки были обнаружены признаки абсцедирования, в печени - дистрофические изменения гепатоцитов, а в селезенке - гипертрофия и гиперплазия лимфоидных узелков, требуется разработка и применение специфических мер профилактики и лечения указанных осложнений. Для лечения каких-либо инфекций посредством применения бактериофага более целесообразно его внутривенное введение. Пероральное использование позволяет создать высокую концентрацию в органах желудочно-кишечного тракта, но, вместе с этим, в печени происходят выраженные дистрофические и даже некротические изменения. Перед применением бактриофага in vivo требуется тщательная очистка препарата не только от остатков микроорганизмов – хозяев фага, но и от компонентов питательной среды для культивирования этих бактерий.
Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Диссертация основана на результатах применения специфического бактериофага для лечения пневмонии, вызванной синегнойной палочкой, и сравнительного морфологического исследования изменений печени, селезенки и брыжеечных лимфатических узлов 108 крыс-самцов инбредной линии Wag.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных.
-
Введение фаголизата бактериофага 57 Pseudomonas aeruginosa непосредственно в пищеварительный тракт крыс сопровождается обширными некрозами паренхимы, выраженной диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрации печени. При внутривенном введении фаголизата изменения печени, по сравнению с интактным контролем, практически отсутствуют.
-
Применение фага не вызывает значительных изменений в структуре селезенки.
-
Пероральное введение фаголизата сопровождается расширением герминативных центров лимфоидных узелков брыжеечных лимфатических узлов, высоким содержанием деструктивно измененных клеток, наличием эозинофилов, большим количеством макрофагов в синусах мозгового вещества. Внутривенное введение фаголизата способствует практически полной сохранности структуры указанных лимфатических узлов.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации. Все использованные методические приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные и доступные анализу результаты. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном материале с использованием сертифицированного оборудования, современных высокоинформативных методов исследования и анализа результатов. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.
Основные положения диссертации доложены на научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009), ежегодных международных научных конференциях «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2010, 2013), Х региональной научно-практической конференции урологов Западной Сибири «Актуальные вопросы диагностики и лечения урологических заболеваний» (Барнаул, 2011), научно-практической конференции с международным участием «Технологии единого лапароскопического доступа в абдоминальной» (Москва, 2011), IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2011» (Санкт-Петербург, 2011), 4 ежегодной Русско-Корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» (Новосибирск, 2012), межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора А.Н. Горячева «Риски в современной травматологии и ортопедии» (Омск, 2013) и на заседании научного персонала лабораторий стволовой клетки, восстановительной медицины и персонализованной медицины Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, 2013).
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в научно-исследовательскую работу «Центра новых медицинских технологий» Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск, Россия).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 12 печатных работ, из них ??? – в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований, и 2 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных результатов с их обсуждением, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и 6 приложений. Работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, содержит 10 таблиц, иллюстрирована 50 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список литературы включает 273 источника (177 отечественных и 96 иностранных). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
