Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Лейкоциты и их роль в иммунитете 8
1.2. Рецепторы лейкоцитов, относящиеся к надссменству иммуноглобулинов...24
1.3. FCUL и IFGP субсимейства FcR-нодобных белков 44
1.4. Эволюции белков надесмейстиа иммуноглобулинов 48
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52
2.1. Материалы и реактивы 52
2.2. Биологические материалы 53
2.3. Культивирование эукариотическнх клеточных линий 54
2.4. Выделение мононуклеарных клеток из крови человека и мыши 54
2.5. Мнтогсниан стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови
человека 54
2.6. Выделение субнопуляцпй клеток крови 54
2.7. Выделение и очистка нуклеиновых кислот 55
2.8. ОТ-ПЦР 57
2.9. Гсль-электрофорсз 58
2.10. Методы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов 59
2.11. Определение пуклеотнднон последовательности 62
2.12. Нозсрн блот-гпбрндтацпн РНК 64
2.13. Дот блог-гпбридпзацпи 65
2.14. Выделение рекомбппаптного hIFGP6-His белка 65
2.15. Иммунизации животных 65
2.16. Нммунофермснтный анализ 66
2.17. Пммуноблогппп' 67
2.18. Временная трансфекцпн эукариотическнх клеток 67
2.19. Иммупоцитохнмнчсскос окрашивание эукариотическнх к легок 68
2.20. Иммунофлуорссцентпос окрашивание эукариотическнх клеток 68
2.21. Компьютерный анализ последовательностей 69
2.22. Филогенетический анализ последовательностей 70
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 71
3.1. Анализ экспрессии IFGP1-IFGP5 генов человека 71
3.2. Альтернативные траискринты IFGP1 и IFGP2 генов человека 75
3.3. Анализ экспрессии IFGP1-IFGP3 генов мыши 79
3.4. Изучение IFGP6 генов человека и мыши 82
3.5. Изучение IFGP6 белка человека 100
3.6. Эволюция генов FcR семейства 108
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126
ВЫВОДЫ 129
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 130
- Лейкоциты и их роль в иммунитете
- Выделение и очистка нуклеиновых кислот
- Анализ экспрессии IFGP1-IFGP5 генов человека
Введение к работе
Актуальность исследования t В основе иммунитета позвоночных лежит сложная система межклеточных взаимоотношений, опосредуемых рецепторами и секрстпруемыми медиаторами. На сегодняшний день часть компонентов этой молекулярной системы остаются неопределенными или неизученными. Механизмы тонкой регуляции ряда иммунных реакций также не ясны.
Среди известных белков, обеспечивающих иммунный ответ организма, центральная роль принадлежит белкам падсемейства иммуноглобулинов (IgSF). Характерной чертой представителей этого падсемейства является наличие хотя бы одного Ig-подобіюго домена, т, е, полипептидиого модуля, свернутого в глобулярную структуру из двух р-слоев. IgSF белки не обнаружены у низших эукариот (дрожжей) и их распространение связывают с эволюцией многоклеточных. В наиболыпей степени экспансия падсемейства происходила в период
Щ филогенеза позвоночных. Подавляющее большинство известных IgSF белков позвоночных образуют совершенно новую, отсутствующую у беспозвоночных, систему межбелковых взаимодействий, ответственных за выявление и элиминацию чужеродных макромолекул (Williams and Barclay, 1988). Поиск и изучение новых IgSF белков может стать основой для более тонкого понимания функционирования иммунной системы па молекулярном уровне. Кроме того, это семейство представляет значительный интерес для эволюционной биологии, поскольку является ярким примером того, как из нескольких предковых Ig-подобных генов \k путем дупликаций и дивергенции возникла сложная генетическая система.
Объектом настоящего исследования является FcR семейство, входящее в состав IgSF. К белкам этого семейства относятся лейкоцитарные Fc-рецепторы (FcR), играющие важную ш роль в иммунной защите организма. Их основная функция заключается в связывании антитсло-аптпгенных комплексов через константные области тяжелых цепей Ig. Кроме того, недавно были идентифицированы еще два субсемейства FcR-подобных генов, названных FCRL и IFGP. Белки FCRL субссмейства экспрсссируются в В-лпмфоцитах. Их лпганды па сегодняшний день не известны (Chikacv et al., 2005; Davis et al., 2002; Facchctti et al., 2002; Mechetina et al., 2002a). Функциональная роль белков IFGP семейства также не определена. Гомология с FcR, играющих важную роль в специфическом и неспецифическом иммунном ответе, позволяла считать, что IFGP белки принимают участие в регуляции клеток иммунной системы.
Цели и задачи исследовании
Целью данной работы является изучение структуры, экспрессии и эволюции генов IFGP субсемейства у теплокровных. і Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: ~ 1. Анализ экспрессии 1FGP1-5 генов человека и IFGPJ-3 генов мыши.
Поиск новых /FG/'-иодобных генов у человека и их характерпзация.
Изучение ^тЛ-подобных генов у представителей теплокровных животных на основе анализа геномных последовательностей и последующего филогенетического анализа. Оценка механизмов образования этих генов в процессе филогенеза теплокровных.
Научная новизна ^ Найдены два новых гена IFGP семейств человека и мыши, обозначенные MFGP6 и mIFGP6, соответственно. Установлено, что IFGPJ-IFGP6 гены человека и JFGP3 ген мыши дифференциально экспрессируются в различных субпопуляцпях основных типов клеток
Ш иммунной системы человека, а именно в субпопуляциях В-, Т- и NK-лимфоцитов. Уровень экспрессии HIFGP6 в субпопуляциях клеток периферической крови является чувствительным индикатором различного рода дисбалансов иммунной системы. Экспрессия IFGPI и IFGP2 генов мыши пе ограничивается клетками иммунной системы. Выявлено, что МІМІК IFGPI. IFGP2 и IFGP6 человека подвергается альтернативному сплайсингу.
Ген HIFGP6 охарактеризован на белковом уровне. Кодируемый этим геном белок имеет молекулярный вес в 60 кДа и экспрессируется на клеточной поверхности.
IT Впервые идентифицированы гены FcR семейств у собаки, опоссума и курицы.
Установлено, что в процессе эволюции основными механизмами генерации генов FcR семейства были межгенные и внутригенпые рекомбинации, делеции и дупликации генов или щ экзопов. а также потери отдельных экзонов за счет накопления мутаций. Предполагается, что первым образовалось IFGP субссмсйство, затем после разделения млекопитающих и птиц появились FcR н FCRL генные субсемейства.
Научно-практическая ценность
Полученные и настоящей работе данные вносят вклад в молекулярную иммунологию человека и мыши. Они могут быть использованы для более детального представления о дифферепцировке и функционировании В-, CD8+ Т- и NK-клеток, а также для диагностики раковых новообразований клеток крови и/или аутоиммунных заболеваний. Выявленные различия в количестве, структуре и экспрессии генов IFGP субсемейства у человека и мыши имеют значение для понимания отличий в механизмах иммунорегуляцни у этих видов.
Идентификация новых FcR-подобиых генов у собаки, опоссума и курицы расширяет представления о генетике и иммунологии этих видов, а также представления об эволюции иммунной системы и механизмах филогенетической экспансии генов IgSF.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на:
11-м Международном иммунологическом конгрессе, Стокгольм, Швеция, 2001;
Международном симпозиуме «Сигнальная трап еду кция в клетках растений и животных», Киев, Украина, 2001;
2-м Международном симпозиуме «Эволюция жизни на Земле», Томск, Россия, 2001;
Конференциях молодых ученых-грантодержателей биологических институтов СО РАМ, Новосибирск, Россия, 2001, 2003, 2004;
9-м Международном ISDCI конгрессе, Ст. Андрго, Шотландия, 2003;
12-ом Международном симпозиуме «Сигналы и сигнальная транедукция в иммунной системе», Шопрон, Венгрия, 2003;
12-м Международном иммунологическом конгрессе, Монреаль, Канада, 2004;
Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, Россия, 2004;
Отчетной сессии аспирантов Института цитологии и генетики СО РАН в 2004.
Лейкоциты и их роль в иммунитете
Однако, основная роль всегда принадлежит лейкоцитам. Другие клетки (например, тканевые) вносят свой вклад в иммунный ответ, посылая сигналы лейкоцитам и/или отвечая на выделяемые лейкоцитами цитокипы.
Местами скопления лейкоцитов в организме являются лимфоидные ткани и органы (рис. 1). На основании функциональных различий лимфоидные ткани и органы делятся па центральные (первичные) и периферические (вторичные). К центральным лнмфоидпым органам относятся тимус и красный костный мозг; к периферическим - лимфоузлы, селезенка, миндалины, аденоиды, аппендикс, а также лимфоидная ткань по ходу пищеварительного и дыхательного путей, кровь и лимфа. Из первичных лимфоидных органов лейкоциты поступают в кровь, циркулируют в ней и затем мигрируют как в лимфоидные, так и в нелимфопдные ткани и органы для дальнейшей диффсрснцнровкн или участия в защитных реакциях. Некоторые лейкоциты способны повторно возвращаться из тканей в кровь, т.е. рсциркулировать (Kuby, 1991; Roitt et al., 1993).
Лейкоциты, несмотря на общее происхождение, морфологически и функционально неоднородны. Классификация лейкоцитов основана на ряде признаков, из которых ведущим служит присутствие (гранулоциты) или отсутствие (агранулоциты) в их цитоплазме специфических гранул. Гранулоциты по способности специфических гранул окрашиваться кислыми и/или основными красителями делятся на базофилы, эозпнофилы и нейтрофилы. К агранулоцитам (также называют мононуклеарными клетки периферической крови), не имеющим специфических гранул, относятся моноциты и лимфоциты. Последние также неоднородны. По основным функциям и специфическим маркерам на поверхности лимфоциты разделяют на Т-, В-, NK-лнмфоциты (Быков, 2002).
Гранулоциты, моноциты (макрофаги) и NK-клетки считаются главными клеточными элементами иеспецифнческой защиты организма. Эти клетки способны уничтожать микробы или измененные клетки фагоцитозом и нефагоцитарпымп механизмами. Последние заключаются в выбросе содержимого гранул (нейтрофилы и эозпнофилы) или секреции различных веществ в межклеточное пространство (моноциты и NK-клетки). Кроме того, гранулоциты и моноциты осуществляют выработку медиаторов воспаления, цитокшюв п/нли хематоксичеекпе факторов, обеспечивая вовлечение ряда клеток в защитные реакции организма и. тем самым, косвенно участвуя в специфических защитных реакциях.
Выделение и очистка нуклеиновых кислот
Пекло М.М. и Шевелевым А.Я., Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗРФ) (Sieber et al., 1980; пол ред. Клауса. 1990)
Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) культивировали в присутствии конканавалпиа A (ICN, США), и/или фитогемагглютииина (Pan Есо, Россия), и/или мптогепа лаконоса (Gibco, США) в концентрации 5 мкг/мл в течении трех дней при 37С в С02 i інкубаторе. Степень активации МПК оценивали по морфологическим критериям (появление клетокбластов, митоз) и по наличию маркеров CD25 и CD71 (не экспрессируются на поверхности покоящихся МПК)
Анализ экспрессии IFGP1-IFGP5 генов человека
Структурное сходство и гомология IFGP генов с FcR делают это субсемейство чрезвычайно интересным для дальнейшего изучения. Первоочередным этапом в функциональном исследовании IFGP генов является определение их экспрссснонного профиля. Поэтому основной задачей данной работы стало определение, в каких тканях или органах, а также клеточных субнопуляциях экспрессируются MFGP1-5 гены.
Исследование тканевого распределения hlFGP транскриптов проводили при помощи ОТ-ПЦР и Нозерн блот-гибрндизации. Было синтезировано по несколько пар праймеров для каждой пз пяти hlFGP кДНК. Праймеры для ОТ-ПЦР анализа предварительного проверялись па контрольных плазмидах и мРНК некоторых тканей человека. В результате было отобрано по одной паре праймеров, позволяющих специфично ампли фи пировать кДНК каждого пз IFGP генов (табл. 2.). В качестве зондов в Нозерн блот-гибрндизации использовали кДНК MFGP1 (241 пар оснований) и кДНК MFGP2 (227 пар оснований), соответственно, кодирующие первый внеклеточный домен hlFGPI и второй внеклеточный домен MFGP2.
Показал, что гены семейства hlFGP экспрессируются в миндалине и селезенке и не экспрессируются в тимусе. Транскрипты всех hlFGP-гсноа, за исключением MFGP2, обнаружены также в мононуклеарных клетках периферической крови (МПК). HIFGP3 может экспрессироваться в нелимфоидных тканях. Транскрипты этого гена обнаружены в коже (рис, 15А). Часть результатов, полученных в результате ОТ-ПЦР-апализа, подтверждали с помощью Нозерн блот-гибрндизации. Экспрессия генов IFGP семейства человека в таких тканях, как мозг, почки и сердце, не обнаружена (рис. 15Б).
