Содержание к диссертации
Введение
1 Общая характристика работы 5
2 Обзор литературы Гетерохроматин D. melanogaster и эффект положения генов. 9
2-1 Гетерохроматин Х-хромосомы Drosophila melanogaster. 9
2-1-1 Цитологическая характеристика, 9
2-1-2 Компоненты гетерохроматина Х-хромосомы. 11
2-1-3 Генетические локусы Х-хромосомы. 13
2-2 Эффект положения мозаичного типа. 19
2-2-1 Временная регуляция и тканевая специфичность инактивации. 20
2-2-2 Интенсивность эффекта положения зависит от размера цис-действующего гетерохроматинового блока . 21
2-2-3 Эффект положения может быть обусловлен взаимодействием разобщенных блоков гетерохроматина. 22
2-2-4 Модификаторы эффекта положения. 24
2-2-5 Классификация генов-модификаторов эффекта положения. 25
2-2-6 Модели инактивации при эффекте положения. 36
2-2-7 Эффект положения гетерохроматиновых генов. 39
2-2-8 Инактивация гена-репортера в трансгенных конструкциях. 41
2-3 Роль структуры хроматина в регуляции экспрессии генов. 43
2-3-1 Перемоделирование нуклеосом. 43
2-3-2 Модификация ги стонов. 44
2-3-3 Замещение гистонов, 46
2-3-4 Инсуляторы. 47
2-3-5 Роль РНК в экспрессии генов и создании структуры хроматина. 49
3 Материалы и иетоды 51
3-1 Линии d.melanogaster и скрещивания 51
3-1-1 Линии с модификаторами эффекта положения 51
3-1-2 Линии с хромосомными перестройками 51
3-1-3 Скрещивания для оценки влияния модификаторов эффекта положения . 52
3-1-4 Линии и скрещивания для картирования Х-ЛВО 55
3-1 -5 Линии для картирования мутации glass-like 56
3-1-6 Линии с трансгенными конструкциями на основе Р-элемента 59
3-2 Молекулярные методы 59
3-2-1 Выделение ДНК из имаго D.melanogaster 59
3-2-2 Рестрикция ДНК 60
3-2-3 Гель-электрофорез ДНК 60
3-2-4 Включение метки в ДНК (метод случайной затравки) 60
3-2-5 Саузери-гибридизация 61
4 Результаты и обсуждение 62
4-1 Исследование транс-действия модификаторов на эффект положения в серии эу гетерохроматических перестроек D. melanogaster. 62
4-1-1 Структуры перестроек (Tolchkov et ai. 2000). 63
4-1-2 Анализ влияния модификаторов эффекта положения на инактивацию гена wapl в эу- гетерохроматиновых инверсиях и транслокациях . 64
4-2 Исследование эффекта положения гена wapl в нехватках, удаляющих фрагменты дистального гетерохроматина Х-хромосомы. 68
4-3 Сулрессор Su-var(3)RT оказывает особенно сильное влияние на инактивацию определяемую взаимодействием разобщенных фрагментов гетерохроматина, 72
4-4 Картирование гетерохроматинового локуса Х-АВО. 75
4-4-1 Молекулярная характеристика нехваток, использованных для картирования Х-АВО. 11
4-4-2 Оценка эффекта делеций дистального Х-гетерохроматина на плодовитость самок, несущих мутацию abo. 81
4-4-3 Локус Х-АВО удален в делеций Df(l) 1-1. 83
4-4-4 Большая часть регулярных тандемных повторов Stellate находится дистальнес области Х-АВО. 84
4-4-5 Гетерохроматиновый локус Х-АВО может частично перекрываться с районом повторов SCLR. 84
4-4-6 Обсуждение результатов картирования Х-АВО. 86
4-5 Поиск модификаторов инактивации репортерного гена mini-white, вызываемой гетерохроматиновыми повторами Stellate. 90
4-6 Получение мутации glass-like (gl-l). 92
4-7 Картирование мутации gl-l 94
4-7-1 Рекомбипационное картирование мутации gl-l. 96
4-7-2 Делеционное картирование мутации gl-l. 98
4-7-3 Тест на комплементацию. 98
4-8 Влияние мутации glass-like на экспрессию трансгенов. 99
4-8- 1 Мутация gl-l подавляет экспрессию mini-white в конструкциях, содержащих гетерохроматиновые повторы . 99
4-8-2 Эффект мутации gl-l на экспрессию трансгенного mini-white зависит от места
встройки конструкции в геном. 103
4-8-3 Мутация gl-l не влияет на экспрессию white при эффекте положения. 103
4-8-4 Мутация gl-l не влияет на экспрессию white с энхансером, окруженного инсуляторами. 104
4-8-5 Обсуждение возможной функции glass'like. 105
4-8-6 Перспективы исследования мутации glass-like. 107
4-9 Заключение 108
Выводы по
Приложение 1 113
Приложение 2 ' 114
Список литературы 115
Благодарности 125
- Интенсивность эффекта положения зависит от размера цис-действующего гетерохроматинового блока
- Скрещивания для оценки влияния модификаторов эффекта положения
- Анализ влияния модификаторов эффекта положения на инактивацию гена wapl в эу- гетерохроматиновых инверсиях и транслокациях
- 1 Мутация gl-l подавляет экспрессию mini-white в конструкциях, содержащих гетерохроматиновые повторы
Интенсивность эффекта положения зависит от размера цис-действующего гетерохроматинового блока
Анализ характера мозаичной пигментации глаз при эффекте положения по гену white (размер и локализация мозаичных пятен) показал, что инактивация происходит в конце первого личиночного возраста, затем инактивированный ген сохраняет это состояние в ряду клеточных поколений (Baker 1967). Временной контроль и тканеспецифичность эффекта положения исследовали с помощью трансгена lacZ (встроенного вблизи гетерохроматина), под промотором теплового шока на разных стадиях развития (Lu, Bishop et al. 1996). Результаты показали, что инактивация возникает в эмбриогенезе на стадии гаструлы и наиболее сильная инактивация достигается на стадии бластодермы. В личиночных имагинальных дисках, содержащих клетки-предшественники различных органов, наблюдалась сильная (практически полная) инактивация. В дифференцированных тканях, напротив, наблюдалась ослабленная (мозаичная) инактивация. Таким образом, авторы показали, что эффект положения может быть обратимым. Мозаичный фенотип, возникающий в процессе дифференцировки, объясняется ослаблением инактивации в части клеток, возможно, в результате разрушения нуклеосомной структуры хромосом (Lu, Bishop et al. 1996). Стероидный гормон экдизон, регулирующий дифференцировку, вызывал in vitro ослабление инактивации в культуре имагинальных дисков, содержащих перестройку, в которой рспортерный ген был встроен в гетерохроматин Y-хромосомы (Lu, Ma et al. 1998). Таким образом, экдизон может быть сигналом для изменения хромосомной структуры, Однако экдизон не оказывал действия на экспрессию LacZ в случае другой перестройки, в которой рспортерный ген находится вблизи центромеры третьей хромосомы. Различия в ответе на экдизон в этих двух случаях могут указывать на возможность существования специфичности ответа разных гетерохроматических доменов на регуляторные воздействия. В пользу этого предположения получены результаты исследования инактивации репортерных генов (mini-white и hsp70-Lac2) клонированными, тандем но-п о вторяющимися гетерохроматиновыми генами Stellate, в разных тканях взрослых мух и личинок (Наумова 2003). Характер инактивации оказался тканеспецифичиым: в одних тканях наблюдалась мозаичная инактивация (глаза, имагинальные диски и слюнные железы личинок), а в других - одинаковое снижение экспрессии во всех клетках ткани (мозг, половые железы самцов). Поскольку в дифференцированных тканях может наблюдаться как равномерная инактивация, так и мозаичная репрессия ре портерного гена hsp70-IacZ, эффект повторов Stellate, по-видимому, не связан с дифференцировкой, а зависит от типа ткани. Можно предположить, что в тканях с равномерной и мозаичной репрессией репортера формируется разная структура хроматина на тандемных повторах генов Stellate, возможно, с участием разных белков
Интенсивность эффекта положения зависит от размера цис-действующсго гетерохроматинового блока.
Была исследована инактивация гена wapl в серии родственных эу-гетерохроматиновых перестроек Х-хромосомы (Tolchkov, Rasheva et al. 2000). Перестройки различались размером гетерохроматинового блока, сохранившегося вблизи исследуемого гена, причем эу-гетерохроматиновая граница сохранялась неизменной во всех перестройках. Разные части гетерохроматина Х-хромосомы удалялись от гена wapl в результате инверсии или транслокации, но сохранялись в геноме (это обстоятельство важно в связи с обсуждением результатов настоящей работы). Было показано, что уменьшение размера инактивирующего гетерохроматинового блока сопровождается ослаблением эффекта положения. Это единственная работа, в которой удалось продемонстрировать зависимость интенсивности эффекта положения от величины и состава прилегающего гетерохроматинового блока. Предпринимаемые ранее попытки (Howe, Dimitri et al. 1995) оказались неудачными, поскольку были использованы перестройки с разной эу-гетерохромати новой границей.
Эффект положения может быть обусловлен взаимодействием разобщенных блоков гетер охр омати на.
Из общего ряда перестроек, исследованных в работе Е.В. Толчкова с соавторами, особый интерес представляет перестройка г20 (рисунок 4), отличающаяся но структуре и характеру инактивации.
В большинстве перестроек эффект положения распространяется от гетерохроматинового блока, содержащего центромеру. Однако в перестройке г20 инактивация распространяется от небольшого блока (h34). Интенсивность инактивации гена wapl, расположенного близко к блоку h34, сильнее, чем гена dor, локалазованного ближе к прицентромерному блоку. Более того, особи, несущие г20 в гетерозиготе с \ делецией Df{l)JA52, удаляющей 4 жизненно важных локуса в районе 2Е (расположенном рядом с блоком п34), летальны. В то же время, самки, несущие г20 в гетерозиготе с делецией Df(l)sta, удаляющей 17 жизненно важных локусов в районе 1С (рядом с прицентромерным блоком), характеризуются нормальной жизнеспособностью. Эти результаты свидетельствуют о том, что инактивация в перестройке г20 распространяется от блока h34, который в других перестройках не вызывает эффект положения. Способность маленького блока вызывать инактивацию в данной перестройке, по-видимому, определяется его близостью к большому прицентромерному блоку. Можно предположить, что происходит агрегация этих фрагментов гетерохроматина, увеличивающая инактивационный потенциал фрагмента п34 (см. рис. 16 в Результатах и обсуждении).
Скрещивания для оценки влияния модификаторов эффекта положения
Для анализа эффект положения по гену wapl использовали линию
174(wapl) pn wa ct v /FM7/ w+Y. 174 - летальный аллель (Gvozdev et al. 1973, 1975) гена wapl (wings appart like) (Gvozdev et al. 1973, 1975) (Verni, Gandhi et al. 2000). Интенсивность инактивации гена wapl оценивали по доле крыльев, несущих вырезки у самок r/174; Mod/+ по сравнению с их сестрами r/174; Sb/+ (г - одна из перестроек, 174 - летальный аллель гена wapU Mod - один из модификаторов, Sb - контрольная хромосома), получаемых в результате описанных ниже скрещиваний (рисунок 11). Синтез хромосомы i74 BsYl; несушуй фрагменты гетерохроматина X и Y-хромосом, использованной для ослабления эффекта положения гена wapl, проводили как показано на рисунке 2.
Синтез генотипов, используемых для картирования Х-АВО (см. приложение 2). Для оценки достоверности различий между генотипами использовали критерий Стъюдента (считали в программе SAS). Линия abo /SMl, Су была получена из центра Bloomington. Аллель abo1 (далее abo) вызван инсерцией мобильного элемента Doc (Berloco, Fanti et al. 2001). Мутация glass-like (gl-l) индуцирована облучен ие\ї ренигепом (3,5 кР) самцов у w67c23, несущих конструкцию P[mini-white; 6Ste] (подробнее см. Результаты). Для рекомбинациониого картирования мутации glassike были использованы следующие линии: y76d8 ras g, у1Ш ct6 g/C(l )/Y, у2 scD! w ct6. Для делеционного картирования - линии с делениями в районе ct - ras: Df(l)KA14 (7F1-8C6), Df(l)C52 (8E-9C), Df(l)M38-C5 (8B-8E), Df(l)18.1J5($C\$-m\-2) (из коллекции Bloomington) и Df(])ED6957 (8B6-8C13) (получена от H. Stocker). В таблице 1 перечислены линии с инсерциями конструкций на основе Р-элемента в районе 8CI0-8E, проверенные на комплементацию с мутацией glass-like.
Окраска глаз самцов gl-Г и gl-1 , обусловленная экспрессией трансгенного white, проявляется на фоне мутации геномного локуса white. Визуально оценивали окраску глаз самцов gl-l, несущих одну копию конструкции. Таких самцов получали, скрещивая самок у w67c23 gI-l/FM7 с самцами из линий с трансгеиными конструкциями.
Для исследования влияния мутации gl-l на экспрессию гена-репортера использовали следующие линии с трансгенными конструкциями на основе Р-элемента: 1) у w67c23; V[mini-white; 6Ste] (Tulin, Naumova et al. 1998). 2) 2) у w67c2i\ [mini-white; 3Su(Ste)] (Gvozdev, Aravin et al. 2003). 3)yw67c23; P[mmi-white; SteLacZ] (Aravin, Naumova et al. 2001). 3) у w67c ; V[mini-white; 134SteLacZ\ (Aravin, Naumova et al. 2001). 4) 5) у w+; V[SUPor-P] (Roseman, Morgan et al. 2001). 6) w1118 ; PfAhmad and Henikoff) (Misra, Crosby et al.). 7) У w67c2 ; P[hsp26-i T\ (Wallrath and Elgin 1995) (линии получены от L. Wallrath) 8) у wJ ; [fWP-2] (Gehring 1984); (Mason, Haoudi et al. 2000) (линия получена от J. Mason).
Анализ влияния модификаторов эффекта положения на инактивацию гена wapl в эу- гетерохроматиновых инверсиях и транслокациях
Исследовали влияние ряда супрессоров эффекта положения, локализованных в третьей хромосоме D. melanogaster, на инактивацию в серии эу-гетерохроматических перестроек Х-хромосомы. Эффект положения во всех перестройках сопровождался инактивацией гена wapl. В числе исследованных модификаторов супрессоры эффекта положения - мутации генов Su(3)9 (метилтрансфераза гистонов и негативный регулятор транскрипции гистонового кластера), Su(3)6 (фосфатаза, дефосфорилирующая хромосомные белки), - и энхансер эффекта положения - мутация гена Trithorax-like (кодирует транскрипционный активатор GAGA-фактор). Также были исследованы супрессоры эффекта положения неизвестной молекулярной природы Su-var(3)80! , Su-var(3)40i , Su-var(3)301 и Su(3)RT (последний был выявлен В.И. Рашевой и Е.В. Толчковым в результате анализа эффекта положения в линии рп2а).
Интенсивность инактивации оценивали по доле крыльев, несущих вырезки (результат инактивации гена wapl) у самок т/174; Mod/+ по сравнению с самками r/I74; Sb/+ (г - одна из перестроек, 174 - летальный аллель гена wapl, Mod - один из модификаторов, Sb — хромосома с доминантным маркером Sb). Оказалось, что хромосома Sb сама обладала существенным суп рессорным эффектом. Например, в случае перестройки г4 в присутствии этой хромосомы количество крыльев с вырезкой уменьшалось с 68% (генотип х4Н74\ +/+) до 47% (генотип гА/174; Sb/+) (Таблица 2).
Степень инактивации гена wapl в присутствии супрессоров Su(3)6, Su(3)S, Su(3)4, Su(3)3 была такой же, как и на фоне хромосомы Sb (таблица 3). Энхансер Trl приводил к усилению инактивации wapl во всех перестройках в одинаковой степени (таблица 2), Супрессор Su-var(3)RT обладал самым сильным супрессирующим действием на инактивацию во всех перестройках, независимо от количества гетерохроматина, прилегающего к эухроматину (табл 2). Супрессия наблюдается в отношении исходной инверсии рп2а (снижение доли крыльев с вырезкой на 19%) и прослеживается во всех остальных перестройках. Известный супрессор эффекта положения Su-var(S)9, кодирующий метилазу гистонов, оказывал значительно более слабый эффект. Таким образом, характер воздействия исследованных модификаторов на перестройки, различающиеся размерами прилегающего к эухроматину гетерохроматического блока, не дает никаких оснований для того, чтобы говорить о разнокачественности ответа на эти модификаторы тех перестроек, которые различаются размерами прилегающего гетерохроматического блока и молекулярной природой повторов, содержащихся в этом блоке. рассматриваемой выше серии перестроек, производных рп2а, разные фрагменты гетерохроматина Х-хромосомы, удаленные от гена wapl, тем не менее сохранены в геноме (в составе инверсий и транслокаций) и могут оказывать супрессирующее транс-действие на инактивацию. Поэтому представляет интерес исследование эффекта положения в серии нехваток, также производных рп2а, в которых разные фрагменты дистального гетерохроматина Х-хромосомы удалены из генома и инактивация гена wapl обусловлена только цис-действием прилежащего гетерохроматинового блока.
Нехватки Df(l)12, Df(l)82, Df(l)21, Df(l)57, Df(l)76, захватывающие участки дистального гетерохроматина Х-хромосомы и ген su(f) на эу-гетерохроматиновой границе, были получены Е.В. Толчковым и В.И. Рашевой облучением (4 кР) самцов рп2а, w. Мутация su(f) приводит к нарушению фасетирования («грубые» глаза) и практически к исчезновению пигментации глаза у мух wa su(?) (Lindsley and Zimm 1992). Облученных самцов pn2a, w скрещивали с самками W f su(f). В потомстве отбирали белоглазых самок с «грубыми» глазами с подозрением на делению su0 в облученной хромосоме. Хромосомы с предполагаемой делецией дистального гетерохроматина и гена su(j) поддерживали на балансере FM7, У sc wa v J В g . Делении в гомозиготном состоянии оказались летальны.
Хромосомы с предполагаемыми нехватками тестировали на наличие ядрышкового организатора, скрещивая самок D//FM7 с самцами инверсии In(!)sc4 sc R отсутствует ядрышковый организатор (NO) (Lindsley and Zimm 1992). Самки Df(l)12/In(l)sc4LscSR , Df(l)S2/ln(l)sc4Lsc8R и Df(})76/In(l)sc4lsc8R были жизнеспособны, то есть, в этих нехватках сохранен ядрышковый организатор. Самки Df(l)21/In(l)sc4LscSR и Df(l)57/ln(l)sc4LscSR не выживали, следовательно, в делециях Df(l)21 и Df(l)57 ядрышковый организатор удален (рис. 14) (Е.В. Толчков, В.И. Рашева неопубликованные результаты).
Таким образом, в нехватках Df(l)2I и Df(l)57 удален фрагмент, захватывающий, по меньшей мере, эу-гетерохроматиновую границу в районе 20F и организатор ядрышка (h29). В нехватках Df(l)21 и Df(l)57 отсутствуют все гетерохроматиновые Stellate (Г.Л. Коган, персональное сообщение), что является дополнительным подтверждением отсутствия в нехватках материала блока Ь26.
Для выравнивания генетического фона проводили скрещивание самок, несущих нехватку и FM7, с самцами FM7 из линии pn2a/FM7 на протяжении семи поколений.
Исследование эффекта положения в делениях дистального гетерохроматина Х-хромосомы рп2а показало, что элиминация из генома фрагмента гетерохроматина, наиболее удаленного от точки разрыва перестройки, не оказывает заметного и достоверного цис-действия на инактивацию гена wapl. Так, доля крыльев с вырезками составляла 96% и 94,9% соответственно у самок Df(l)21H74 и Df(l)57ll74 с делецией фрагментов Ы6-29 и не отличалась от доли крыльев с вырезками у самок рп2а!174 (98,8%) (таблица 4). У самок с эффектом положения, ослабленным за счет введения в геном транслокации B?Y, несущей дополнительные фрагменты гетерохроматина Х- и Y-хромосомы (Lindsley and Zimm 1992), также не наблюдали различий между долей крыльев с вырезками у самок 0/(1)211174 и Df(l)57ll74 ffY (17,3% и 15,3%) по сравнению с рп2а/174 В У (18,7%). Таким образом, удаление в нехватках фрагмента гетерохроматина, включающего по меньшей мере блоки И26-29, не влияет на интенсивность цис-действия оставшегося гетерохроматинового блока.
1 Мутация gl-l подавляет экспрессию mini-white в конструкциях, содержащих гетерохроматиновые повторы
Из пяти линий у w67c2Sgl-i; P[mini-white; 6Ste\ несущих конструкцию [mini-white; 6Ste] в аутосомах (см. Таблицу 7), три характеризуются мозаичной окраской глаза, и две (район инсерции 39С и 64D) - немозаичной. Мутация gl-l приводила к полному подавлению экспрессии mini-white во всех линиях, кроме одной, несущей конструкцию в район 64D. Мутация gl-l полностью подавляла экспрессию mini-while в двух линиях, несущих конструкцию P[mini-white; 3Su(Ste)] с тремя гетерохроматиновыми повторами Suppressor of Stellate, гомологичными повторам Stellate (Gvozdev, Aravin et al. 2003). В одной из этих линий особи имели мозаичную окраску глаза, а в другой - равномерно красную (встройки в сайты 74А и 29D соответственно). Примечания к таблице 7. Окраска глаз самцов gl и gl ll , обусловленная экспрессией трансгенного white, проявляется на фоне мутации геномного локуса white (см. Линии, использованные в работе). Самцы gl-i1 несут одну копию конструкции. Трансген mini-white, входящий в состав всех Ste /toe-содержащих конструкций { [mini-white; 6Ste], P[mini-white; 3Su(Ste)], P[white; SteLacZj, V[white; Ste]34lacZ\), представляет собой фрагмент гена white с делецией длинного 5;-интрона, фланкированный на 5 -конце последовательностью -300 п.о., предшествующей старту транскрипции. Конструкции включают: P[mini-white; 6Ste] - 6 гетерохроматиновых повторов Stellate Х-хромосомы (8,5 т.п.о.). P[mini-white; 3Su(Ste)] - 3 повтора Supressor of Stellate (8,4 т.п.о.) (Gvozdcv, Kogan et al. 2000); [mini-white;SteLacZ] -слитный ген, включающий большую часть гена Stellate и ген LacZ (Aravin, Naumova et al. 2001); Y[mini-white; Stel34lacZ] 134 п.о. промоторной области гена Stellate слиты с геном LacZ (Aravin, Naumova et al. 2001); [SUPor-P] - окруженный инсуляторами ген white, с энхансером (Roseman, Morgan et al. 2001); P[EP] - трансген mini-white (w+m ) с делецией длинного 5 -интрона. (FlyBase); V[hsp26-pt\ - трансген mini-white (w+mWhs) с делецией длинного 5 -HirrpoHa(Wallrath and Elgin 1995)) Р[З Р-2] -фрагмент локуса white 12 т.п.о., включающий регуляторную последовательность (3 т.п.о.), отвечающую за взаимодействие white с геном zeste (Gehring et al. 1984).
Эффект мутации gl-l на экспрессию трансгенного mini-white зависит от места встройки конструкции в геном.
Мутация gl-l подавляла экспрессию mini-white, если рядом с геном-репортером находился лишь фрагмент гена Stellate или совсем небольшой его участок (134 п.о.). Самцы gl-l, [mini-white; SteLacZ] (две линии) имели белые глаза. Самцы gl-l; V[mmi-white; 134SteLacZ\ (инсерция в хромосому 3) имели белые глаза, но мутация не оказывала влияния на экспрессию mini-white в той же конструкции, находящейся в хромосоме 2 (таблица 7). Таким образом, эффект gl-l зависит от положения конструкции в геноме.
Мутация не подавляет экспрессию white при теломерном и центромерном эффектах положения, вызванных инсерцией Р-элементной конструкции в гетеро хроматин (линии получены от L. Wall rath и J. Mason соответственно). У мух, несущих вставку трансгена в районе гетерохроматина, наблюдается мозаичная экспрессия репортерного гена white. У самцов, несущих мутацию gl-l, на стекловидной поверхности глаза обнаруживали «растекающиеся» пигментированные участки (рисунок 27). wvco, представляющую собой транспозицию эндогенного локуса white в гетерохроматин третьей хромосомы, имели такую же мозаичную окраску глаза, как и самцы у w67c23 gl-Ґ; +1 wvco .
В сочетании с эндогенным локусом white в Х-хромосоме или при совмещении в геноме с трансгеном P[SUPor-P] gl-l приводила к одному и тому же фенотипу: глаз был сильно пигментирован, но распределение пигмента оказывалось неоднородным (рисунки 25 и 28). Конструкция P[SUPor-P] содержит трансген white с тканеспецифичным энхансером, экспрессирующемся в глазах. В то же время мутация gl-l полностью подавляла экспрессию mini
Полученные данные позволяют предполагать, что локус gl-l может участвовать в организации структуры хроматина в отдельных сайтах генома.
Во-первых, обнаружена зависимость . эффекта мутации gl-l, от сайта встройки трансгена и соседства с клонированными гетерохроматиновыми повторами. Во-вторых - отсутствие ее влияния при встройке трансгена в район центромеры и теломеры, а также при наличии окружающих трансген инсуляторов и присутствия энхансера, дают основание предполагать, что влияние мутации gl-l на экспрессию mini-white реализуется в зависимости от специфической структуры хроматина в геномном окружении трансгена.
Соседство репортерного гена с шестью гетерохроматиновыми повторами Stellate или гомологичными им повторами Su(Ste), за одним исключением, обеспечивает проявление сильного эффекта мутации gl-l, когда глазной пигмент полностью исчезает. Гетерохроматиновые повторы (фрагмент включает около 8 т. п.о.) могут создавать особую структуру хроматина, приводящую к нестабильной, клонально наследуемой инактивации не только в глазу, но и в других тканях (Gvozdev et al. 2003). Это предположение подтверждается результатами исследования структуры хроматина в районе инсерции репортерного гена, инактивируемого повторами Stellate (Наумова и др. 2003). Было обнаружено, что инактивация mini-white повторами Stellate сопровождается снижением его метилирования с помощью экспрессирующейся в геноме D. melanogaster dam-метилтрансферазы. Ранее снижение доступности для метилтрансферазы бьшо показано для гена white при его инактивации в результате хромосомных перестроек в случае классического эффекта положения (Boivin and Dura 1998).
Возможно, что влияние мутации gl-l сказывается только в том случае, если специфическая структура хроматина, формирующаяся в данном сайте встройки конструкции, обеспечивает высокий уровень экспрессии только при наличии белка, кодируемого локусом gl-l.
Мутация gl-l не влияла на экспрессию white, встроенного в районы центромеры и теломеры. Можно предполагать, что центро мерный и теломерный гетсрохроматин «не отвечают» на отсутствие белка, кодируемого геном gl-l.
