Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 .Плюрипотенгность клеток и репрограммирование 13
1.2. Репрограммирование в нормальном развитии млекопитающих 14
-
Репрограммирование в раннем развитии млекопитающих 14
-
Репрограммирование в гаметогенезе 16
1.3. Методы экспериментального репрограммирования генома 17
І.З.І.Репрограммирование генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер в
энуклеированные ооциты 17
-
Репрограммирование генома соматических клеток при образовании ИПС клеток 20
-
Репрограммирование генома при слиянии соматических и плюрипотентных клеток 25
-
Гибридные клетки типа клетка эмбриональной карциномы - соматическая клетка 25
-
Гибридные клетки типа эмбриональная герминальная клетка - соматическая клетка 27
-
Гибридные клетки типа эмбриональная стволовая клетка — соматическая клетка 28
-
Репрограммирование генома в гибридных клетках 31
-
Транскрипционные факторы — ключевые регуляторы плюрипотентного статуса клеток 35
-
LaminA/C 40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43
-
Клетки и клеточные линии 43
-
Выделение ДНК 43
-
Работа с РНК 44
-
Выделение РНК 44
-
Обработка РНК ДНКазой 46
-
Синтез кДНК 46
-
Полимеразная цепная реакция 46
-
Электрофорез ДНК в агарозном геле 49
-
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 49
-
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 50
-
Бисульфитное секвенирование ДНК 51
2.8.1 Бисульфитная модификация ДНК 51
2.8.2. ПЦР с вложенными праймерами 52
2.8.3. Субклонирование фрагментов ДНК 53
2.9. Микробиологические методы 54
-
Приготовление компетентных клеток E.coli 54
-
Трансформация компетентных клеток E.coli 55
2.10. Выделение фрагментов ДНК из гелей 55
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 56
-
Экспрессия генов - молекулярных маркеров плюрипотентности Oct-i и Nanog в гибридных клетках 56
-
Экспрессия молекулярного маркера дифференцированных клеток гена Lmna в гибридных клетках 57
-
Поиск аллель-специфичных сайтов рестрикции для дискриминации транскриптов разного родительского происхождения 58
-
Экспрессия родительских аллелей гена Oct4 и Nanog в гибридных клетках 60
-
Определение последовательности 5'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna М. caroli 61
-
Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках и спленоцитах 64
-
Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в эмбриональных стволовых гибридных клетках ^___^__ 65
-
Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, полученных из эмбриональных стволовых гибридных клеток 67
-
Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в ЭС клетках и спленоцитах 69
-
Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках 70
-
Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных стволовых гибридных клетках 72
-
Экспрессия тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях взрослых химер 74
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 77
ВЫВОДЫ 87
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВКМ — внутренняя клеточная масса;
ГАТ - гипоксантин, аминоптерин, тимидин;
ГФРТ (HPRT) - гипоксантинфосфорибозилтрансфераза;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДМР - дифференциально метилированный регион;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ИПС клетки - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки;
ИПТГ — изопропил-Ь-О-галактопиранозид;
КР - консервативный регион;
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;
НС клетки - нервные стволовые клетки;
о.е. - оптические единицы;
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскрипции;
п.н. - пар нуклеотидов;
ПДРФ - полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов;
ППК - первичные половые клетки;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
РНК - рибонуклеиновая кислота;
ЭГ клетки - эмбриональные терминальные клетки;
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат;
ЭК клетки - клетки эмбриональной карциномы;
ЭС клетки — эмбриональные стволовые клетки;
BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin);
DEPC - диэтилпирокарбонат;
DTT - дитиотреитол (dithiothreitol);
GFP - зелёный флуоресцентный белок (green fluorescent protein);
HEPES -4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;
LIF - фактор, подавляющий дифференцировку эмбриональных клеток (leukemia
inhibitory factor);
LINE - длинный диспергированный ядерный элемент (long interspersed nuclear
element);
SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulphate);
SSEA - стадиоспецефичные эмбриональные антигены (stage-specific embryonic
antigenes);
STAT3 - белок, транскрипционный фактор (signal transducer and activator of
transcription 3);
Введение к работе
Актуальность. Восстановление плюрипотентности в дифференцированных клетках и связанные с ним процессы репрограммирования генома являются одними из актуальных проблем современной биологии. Исследования, посвященные данной проблеме, помимо прикладных аспектов, таких как получение иммуносовместимых клеток для трансплантологического лечения различных заболеваний, тесно связаны с другими фундаментальными проблемами биологии (регуляция дифференциальной активности генов, регуляция процессов индивидуального развития и др.). В нормальном развитии эмбриональные клетки при дифференцировке теряют свой изначальный высокий потенциал - плюрипотентность, в результате чего специализированные клетки лишены способности к превращению в другие типы клеток. Долгое время считалось, что утрата плюрипотентности необратима, однако в опытах на амфибиях и млекопитающих было показано, что ядра дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, после пересадки в энуклеированные ооциты способны обеспечить полное развитие организма (Di Berardino, Orr, 1992; Wilmut et al, 1997; Wakayama et al, 1998). Эти данные показали, что ядра некоторых дифференцированных клеток могут быть репрограммированны цитоплазматическими факторами ооцита. На сегодняшний день, помимо метода переноса ядер, существует еще два метода репрограммирования клеток взрослого организма. Это метод слияния эмбриональных стволовых (ЭС) и дифференцированных клеток (Matveeva et al, 1998; Tada et al, 2003; Cowan et al, 2005; Ambrosi et al, 2007) и метод получения индуцированных плюрипотентньгх стволовых (ИПС) клеток, основанный на эктопической экспрессии небольшого числа транскрипционных факторов в культуре соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Maherali et al, 2007; Okita et al, 2007; Wernig et al, 2007). Обе технологии показали высокую эффективность репрограммирования геномов многих типов дифференцированных клеток от фибробластов до В- и Т-лимфоцитов (Hong et al, 2009). Каждый из методов экспериментального репрограммирования клеток имеет свои преимущества и ограничения. Исследование молекулярных механизмов репрограммирования в гибридных клетках предоставляет более широкие возможности, нежели метод переноса ядер в энуклеированные ооциты, поскольку имеется возможность собрать достаточное для анализа количество материала. В отличие от получения ИПС клеток, ЭС клетки при слиянии содержат все необходимые для правильного репрограммирования факторы, в том числе и неидентифицированные. Однако после объединения геномов родительских клеток в ядре гибридной клетки, становится сложно следить за изменениями генной активности и эпигенетических модификаций геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.
Попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток была впервые предпринята в 1996 году. С этой целью плюрипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами, клетками селезенки, взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми со свойствами ЭС клеток (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Позднее эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al, 2001; Tada et al, 2003), незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза (Terada et al, 2002) и нейрогенеза (Ying et al, 2002). При слиянии ЭС клеток человека с фибробластами человека, также отмечается высокий уровень плюрипотентности гибридных клеток, сходный с потенциалом родительских ЭС клеток (Cowan et al, 2005). Высокий потенциал эмбриональных стволовых гибридных клеток подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭС клеток. Тот факт, что в гибридах типа ЭС клетка - дифференцированная клетка проявляются лишь свойства плюрипотентного партнера, предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Однако прямых доказательств этого на сегодняшний день не так много. Свидетельства репрограммирования эпиаллелей соматического партнера (эпиаллелями называются аллели, дифференциальная активность которых обусловлена различием эпигенетических модификаций, приобретенных в процессе индивидуального развития) были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов М. musculns molossinus (Tada et al, 2001; Tada et al, 2003; Hatano et al, 2005). Указанием на масштабное репрограммирование генома соматического партнера могут служить данные, полученные с помощью полногеномного анализа транскрипции в гибридных клетках типа ЭС клетка -фибробласт (Cowan et al, 2005; Ambrosi et al, 2007). В этих работах было показано, что по профилю генной активности гибридные клетки сильно отличаются от фибробластов, но имеют сходство с ЭС клетками. Тем не менее, в этих исследованиях отсутствуют прямые доказательства репрограммирования соматического генома в гибридных клетках, поскольку авторы не имели возможности различать аллели разного родительского происхождения.
В исследованиях последних лет были определены транскрипционные факторы, ответственные за поддержание плюрипотентности ЭС клеток и клеток ранних эмбрионов млекопитающих. В настоящее время считается, что ключевыми звеньями сложной генной сети, регулирующей плюрипотентный статус, являются гены Oct4, Nanog и Sox2 (Chambers, Smith, 2004). Показано, что эти гены играют важную роль и в процессах репрограммирования соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al, 2007), так эктопической экспрессии фактора Oct4 достаточно для превращения нервной клетки в плюрипотентную (Kim et ah, 2009), а неполная реактивация гена Oct4 соматического ядра приводит к гибели клонированных эмбрионов мыши на ранних стадиях развития (Yamazaki et al, 2006). Поэтому большое внимание уделяется изучению процессов, сопровождающих реактивацию «генов плюрипотентности», таких как Oct4 и Nanog, при репрограммировании геномов дифференцированных клеток. Важная роль в регуляции активности этих генов отводится эпигенетическим модификациям генома, таким как метилирование ДНК и модификации гистонов.
Необходимым условием репрограммирования генома является не только активация «генов плюрипотентности», но также и подавление активности тканеспецифичных генов, активных в дифференцированных клетках. К такой категории генов, экспрессия которых характерна для всех типов дифференцированных клеток, относится ген белка ядерной ламины - lamin А/С (Lmna) (Constantinescu et al., 2006). На сегодняшний день не опубликовано работ, в которых исследовалась бы экспрессия этого гена в процессе репрограммирования дифференцированных клеток.
В связи с необходимостью различать аллели родительских геномов при исследовании процессов репрограммирования, особый интерес представляют межвидовые гибридные клетки. В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН были получены межвидовые гибриды от слияния плюрипотентных ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши М. caroli. Полученныеклоны гибридных клеток, кариотип которых детально описан (Matveeva et al, 2005; Пристяжнюк и др., 2005), имеют фенотип и ростовые характеристики, сходные с ЭС клетками. Межвидовая вариабельность гомологичных последовательностей ДНК позволяет надежно различать аллели плюрипотентного и соматического партнеров в гибридных клетках. Благодаря этому появилась возможность изучения молекулярных механизмов репрограммирования генома соматической клетки и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом гибридных клеток и присутствием хромосом соматического партнера.
Цели и задачи исследования
Цель работы заключалась в оценке репрограммирования генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, а также гена Lmna, экспрессия которого характерна всех типов дифференцированных клеток, в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli. А также в оценке репрограммирования тканеспецифичных генов при дифференцировке гибридных клеток в составе химерного животного.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Определить первичную структуру фрагментов генов Oct4 и Nanog М. caroli и провести поиск видоспецифичных сайтов узнавания рестриктаз, позволяющих различать видовую принадлежность транскриптов этих генов в гибридных клетках.
Исследовать экспрессию эпиаллелей генов Oct4, Nanog спленоцита в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.
Определить первичную структуру б'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna М. caroli.
Провести сравнительный анализ метилирования 5'-регуляторных областей эпиаллелей генов Oct4, Nanog и Lmna в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.
Провести сравнительный анализ метилирования 5-регуляторной области эпиаллелей гена Oct4 при дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в условиях in vivo (формирование тератом).
Оценить экспрессию тканеспецифичных генов с аллелей соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей линии C57BL.
Научная новизна.
1. В работе впервые проведено детальное исследование уровня метилирования 5'-регуляторных областей родительских аллелей генов Oct4и Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках. Показано, что реактивация эпиаллелей соматического партнера генов Oct4 и Nanogсопровождается деметилированием их 5'-регуляторных областей.
Впервые исследовано метилирование 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, развившихся из эмбриональных стволовых гибридных клеток. Показано, что диффернцировка гибридных клеток сопровождается гиперметилированием 5'-регуляторной области гена Oct4, уровни метилирования родительских аллелей не различаются.
Получены новые данные о метилировании 5'-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках и фибробластах мыши. Показано, что метилирование района от -300 п.н. до -94 п.н. гена Lmna (относительно первого кодона) поддерживается на одном уровне вне зависимости от того, находится ли ген в активном или репрессированном состоянии.
В работе впервые проведена оценка экспрессии тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей. Показано, что репрограммированные гены соматического партнера экспрессируются тканеспецифичным образом в органах химерного животного.
Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют наши знания о процессах репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 2007 г.), на международной конференции 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells (Фошань, Китай, 2008 г.), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).
По теме диссертации опубликованы 3 работы. Две - в рецензируемых зарубежных журналах и одна — в рецензируемом отечественном журнале.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. В работе использованы: гибридные клетки серии НМС, полученные Н.М. Матвеевой, тератомы, полученные А.А. Васильковой, и химерная мышь № 6-17, полученная Е.А. Кизиловой.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 18-ю рисунками и содержит 4 таблицы.
