Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Феномен геномного импринтинга 13
1.2. Однородительская дисомия и геномный импринтинг 15
1.3. Импринтированные гены человека и мыши 24
1.4. Механизмы регуляции геномного импринтинга. ., 27
1.5. Особенности молекулярной организации импринтированных генов хромосомы 15 и регуляция импринтинга 30
1.6. Клиническая характеристика и генетическая гетерогенность синдромов Прадера-Вилли иЭнгельмана 37
Заключение 47
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Объем и структура материала 48
2.2. Методы выделения ДНК 50
2.3. Оценка статуса метилирования гомологов хромосомы 15 52
2.3.1 Определение метилированного и неметилированного гомологов хромосомы 15 с использованием бисульфитной обработки ДНК 52
2.3.2, Определение характера метилирования ДНК I экзона гена SNRPNc использованием метил-чувствительных рестриктаз 54
2.4. Определение однородительской дисомии хромосомы 15 55
2.5. Культивирование фибробластов тканей спонтанных абортусов и приготовление препаратов метафазных хромсом 60
2.6. Флюоресцентная гибридизация in situ 62
2.7. Методы статистического анализа 63
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Полиморфизм ДНК-маркеров хромосомы 15 у славянского населения Западно-Сибирского региона России 65
3.2 Оценка статуса метилирования импринтированных генов у больных с синдромами Прадера-Вилли и Энгельмана 72
3.3. Анализ делеционного варианта синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана 74
3.4. Однородительская дисомия хромосомы 15 при синдромах Прадера-Вилли и Энгельмана 81
3.5. Генетическая гетерогенность и алгоритм диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана 94
3.6. Особенности клинического полиморфизма разных молекулярных форм синдрома Прадера-Вилли 99
3.5. Оценка однородительской дисомии хромосомы 15 как возможного фактора пренатального отбора у человека 109
Заключение 114
Выводы 120
Список литературы 123
- Особенности молекулярной организации импринтированных генов хромосомы 15 и регуляция импринтинга
- Определение однородительской дисомии хромосомы
- Анализ делеционного варианта синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана
- Генетическая гетерогенность и алгоритм диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана
Введение к работе
Представление об универсальности менделевских законов передачи наследственной информации, которое господствовало в генетике достаточно долго, в последнее время претерпело существенное изменение. Этому способствовало открытие таких феноменов, как геномный импринтинг (ГИ), инактивация X хромосомы, экспансия тринуклеотидных повторов и ряда других явлений нетрадиционного наследования. Необходимость дальнейшего изучения этих явлений продиктована новым уровнем знаний о геноме человека и расширением наших представлений о многообразии механизмов функционирования генов.
Из всех явлений нетрадиционного наследования значительный интерес представляет феномен геномного импринтинга (англ, imprint - отпечаток), под которым понимают эпигенетический процесс, дифференциально маркирующий определенные локусы гомологичных хромосом и выключающий экспрессию одного из аллельных генов в зависимости от их родительского происхождения [John, Surani, 2000; Reik, Walter, 2001]. В результате наличия в гене на одной из двух гомологичных хромосом некого «отпечатка» этот ген теряет способность считывания генетической информации. Таким образом, в участках генома, подверженных импринтингу, обнаруживается моноаллельная экспрессия генов, причем если импринтирован материнский ген, то экспрессируется отцовский аллель и наоборот. ГИ устанавливается в результате надмолекулярных эпигенетических процессов, обеспечивающих дифференциальную экспрессию генов путем модификации ДНК, не затрагивающей их первичную нуклеотидную последовательность [Bestor, 2000; Назаренко, 2001; Jaenisch, Bird, 2003]. Показано, что основную роль в ГИ играет метилирование цитозиновых оснований ДНК с образованием 5
метилцитозина, обеспечивающее выключение экспрессии генов с модифицированными нуклеотидами [Li, 2002].
Проблема дифференциальной экспрессии генов является одной из наиболее актуальных и интригующих проблем современной функциональной геномики. Открытие генов, экспрессия которых определяется полом передавшего их родителя, породило новое направление научных исследований в рамках изучения механизмов специфического функционирования генов. Для генетики развития значительный интерес представляет изучение механизмов и роли ГИ в формировании как нормальных фенотипических признаков организма, так и клинических, возникающих в результате нарушения дифференциальной экспрессии импринтированных локусов [Hitchins, Moore, 2002]. Эти вопросы в настоящее время активно исследуются в ведущих мировых генетических лабораториях. Показано, что многие импринтированные гены в геноме млекопитающих имеют кластерную организацию, т.е. они собраны в отдельные кластеры, обладающие определенной эволюционной консервативностью. Особый интерес представляет один из крупных кластеров импринтированных локусов хромосомы 15 человека, расположенный в области 15qll-ql3. Часть генов, расположенных в этом кластере, имеют противоположный характер импринтинга - т.е. они экспрессируются с разных гомологов хромосомы 15. Другой интересной особенностью кластерной организации импринтированных локусов генома является подчинение их экспрессии некому контролирующему элементу, так называемому центру импринтинга [Ohta et ah, 1999].
Поскольку нарушение механизмов импринтинга связано с формированием ряда наследственных болезней человека (болезней геномного импринтинга), то их понимание возможно через изучение молекулярных основ развития этих заболеваний [Пузырев, Назаренко, 1997; Пузырев, Степанов, 1997; Paulsen, Ferguson-Smith, 2001; Немцова, 2002].
Эффекты импринтинга проявляются как при структурных нарушениях участков хромосом, содержащих импринтированные гены, так и при ошибочном наследовании обеих гомологичных хромосом от одного родителя — явлении однородительской дисомии (ОРД). Установлено, что нарушение моноаллельной экспрессии генов на отцовской хромосоме 15 приводит к синдрому Прадера-Вилли (СПВ), а на материнской - к синдрому Энгельмана (СЭ). В связи с этим, оба этих заболевания стали прекрасной моделью для изучения феномена ГИ у человека [Nicholls, Knepper, 2001].
Клиническая картина СПВ и СЭ отличается большим разнообразием, а генетические механизмы, лежащие в основе этиологии и патогенеза этих заболеваний, еще до конца не изучены. СПВ и СЭ возникают как в результате делеции области qll-ql3 отцовской или материнской хромосомы 15, так и в результате ОРД хромосомы 15 материнского или отцовского происхождения соответственно. Кроме того, они могут быть следствием мутаций в центре импринтинга и мутаций в локусах-мишениях импринтинга. Наличие разных механизмов развития наследственных заболеваний ставит вопрос о наличии популяционных и этнических особенностей в формировании отдельных вариантов генетически гетерогенных болезней вообще и болезней геномного импринтинга в частности. Однако в литературе по этому вопросу имеются весьма ограниченные данные. В качестве примера может служить недавно выполненная диссертационная работа по характеристике отдельных генетических вариантов СПВ и СЭ в Финляндии [Kokkonen, 2003]. Что касается России, то известна всего лишь одна работа, рассматривающая молекулярную нарушения у больных с СПВ и СЭ, но она выполнена на больных с СПВ и СЭ европейской части страны [Залетаев, Немцова, 2001; Немцова, 2002]. Дальнейшее накопление материала по болезням геномного импринтинга и более глубокое исследование больных с различными молекулярными вариантами этого класса патологии позволит не только глубже понять природу эпигенетической регуляции активности генов,
но и необходимо для разработки методов профилактики и лечения данных заболеваний.
Выяснение характера связи между генотипом и фенотипом представляет другой важный аспект изучения генетически гетерогенных болезней. Попытки выявления гено-фенотипических корреляций при разных молекулярных формах СПВ и СЭ уже предпринимались рядом авторов и было отмечено, что у больных с СПВ, обусловленном ОРД хромосомы 15, имеется более «легкое» клиническое проявление заболевания, по сравнению с его делеционным вариантом [Moncla et al., 1999; Gillessen-Kaesbach et al., 1999; Roof et al., 2000]. Однако четких клинических признаков, характерных для разных генетических вариантов этого заболевания, не было выявлено. Более того, в ходе молекулярного анализа у некоторых больных с фенотипическими признаками СПВ были выявлены генетические дефекты, характерные для СЭ [Dupont et al., 1999; Gillessen-Kaesbach et al., 1999]. Таким образом, вопрос о гено-фенотипических корреляциях при болезнях геномного импринтинга представляет существенный интерес и требует дальнейшего изучения.
Важным представляется также вопрос о вкладе ОРД хромосомы 15 в эмбриональную летальность. В литературе имеется ограниченное число исследований, посвященных анализу взаимосвязи ОРД по хромосомам человека с ранней эмбриональной гибелью [Shaffer et al., 1998; Smith et al., 1998; Nazarenko et al., 1999]. На сегодняшний день ОРД у эмбрионов, погибших в I триместре беременности, обнаружена только по хромосомам 21 и 9 [Henderson et al., 1994; 2001; Wilkinson et al., 1996; Fritz et al., 2001]. В то же время эти хромосомы не содержат импринтированных локусов [Blouin et al., 1993; Robinson et al., 1994; Bjorck et al., 1999; Tiranti et al., 1999; Rogan et al., 1999; Bruyere et al., 2000]. Поэтому вопрос о вкладе ОРД в эмбриональную летальность по хромосомам, несущим импринтированные
гены, и, в частности, хромосомы 15, пока остается открытым [Никитина, 1999].
Цель исследования: Определить спектр и фенотипическое проявление молекулярных нарушений кластера импринтированных генов хромосомы 15 у больных с синдромами Прадера-Вилли и Энгельмана.
Задачи исследования:
1. Изучить полиморфизм ДНК, обусловленный вариациями числа тандемных повторов хромосомы. 15,у жителей Западно-Сибирского региона России и оценить информативность выбранных генетических маркеров для определения родительского происхождения хромосомы 15.
2. Определить статус метилирования импринтированных генов области qll-ql3 хромосомы 15 у больных с синдромами Прадера-Вилли и Энгельмана,
3. Оценить протяженность делеции и частоту делеционного варианта области ql l-ql3 хромосомы 15 у исследуемых больных.
4. Изучить вклад однородительской дисомии хромосомы 15 в этиологию синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана, а также механизмы ее возникновения.
5. Исследовать фенотипические особенности разных молекулярных вариантов синдрома Прадера-Вилли.
6. Оценить вклад однородительской дисомии хромосомы 15, как одного из молекулярных вариантов синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана, в эмбриолетальность у человека.
Научная новизна: Впервые у славянского населения Западно-Сибирского региона России изучен полиморфизм ряда ДНК-маркеров, расположенных как непосредственно в пределах кластера
импринтированных генов хромосомы 15, так и вне границ этого района с оценкой их информативности для анализа родительского происхождения данной хромосомы. Установлены молекулярные формы патологии у больных с синдромами Прадера-Вилли и Энгельмана. Впервые у пробанда с синдромом Прадера-Вилли обнаружена сегментная материнская однородительская гетеродисомия области 15qll-ql3, что свидетельствует о возможности соматического кроссинговера как механизма,
детерминирующего развитие данного заболевания. Выявлены фенотипические отличия между больными с синдромом Прадера-Вилли, имеющими делеционный вариант заболевания и вариант болезни, обусловленный однородительской дисомией хромосомы 15 материнского происхождения. Показано, что ОРД хромосомы 15 не вносит заметного вклада в гибель кариотипически нормальных зародышей в эмбриональном периоде развития человека.
Практическая значимость: В настоящей работе проведена молекулярная диагностика заболеваний у 57 больных с клиническим диагнозом синдром Прадера-Вилли и у 11 больных с синдромом Энгельмана. Выявлены разные молекулярные варианты синдромов, определена их частота и фенотипическое проявление, оптимизированы подходы к диагностике этих болезней- Обнаружены достоверные отличия разных молекулярных вариантов синдрома Прадера-Вилли по ряду систем аномалий развития органов (аномалии нервной системы, позвоночника и конечностей), которые могут быть использованы для предварительной диагностики заболевания. Изученный в настоящей работе комплекс полиморфных ДНК-маркеров хромосомы 15 может быть использован в молекулярно-генетических исследованиях (для ДНК-диагностики наследственной патологии, анализа сцепления, идентификации личности, определения биологического отцовства и других форм родства).
Положения, выносимые на защиту:
1. Аллельный спектр полиморфных микросателлитных ДНК-маркеров хромосомы 15 у славянского населения Западно-Сибирского региона России отличается от европейских популяций.
2. У больных с синдромами Прадера-Вилли и Энгельмана преобладающим типом мутаций области 15ql l-ql3 являются делеции, а доля однородительской дисомии хромосомы 15 материнского и отцовского происхождения составляет 29,0% и 18,2% соответственно.
3. Сегментная однородительская дисомия хромосомы 15, выявленная при синдроме Прадера-Вилли, свидетельствует о возможности соматического кроссинговера как механизма, детерминирующего развитие данного заболевания.
4. Больные с синдромом Прадера-Вилли, имеющие делеционный вариант и ОРД хромосомы 15, отличаются по степени выраженности отдельных клинических признаков заболевания. Больные с ОРД имеют с меньшей частотой аномалии развития нервной системы, позвоночника и конечностей.
5. Однородительская дисомия по хромосоме 15 не вносит заметного вклада в раннюю эмбриональную летальность у человека.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: научных чтениях, посвященных 100-летию профессора В.П-Чехова (Томск, 1997); научно-практической конференции «Медицинская генетика: проблемы диагностики, профилактики и диспансеризации больных с наследственной патологией» (Томск, 1998); Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию академика РАМН К.Р.Седова (Красноярск, 1998); II Европейской цитогенетической конференции (Вена, 1999); научно-практической конференции, посвященной 30-летию медико-генетической службы Новосибирской области «Современные медицинские
технологии» (Новосибирск, 1999); II съезде Российского общества медицинских генетиков (Курск, 2000); научной конференции молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2000); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2001); V итоговой научной конференции НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2002); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2002); межлабораторном семинаре НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований с обсуждением по разделам, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 195 источников, из них 13 отечественных и 182 зарубежных.
Особенности молекулярной организации импринтированных генов хромосомы 15 и регуляция импринтинга
Хромосома 15 в районе 15qll-ql3 содержит участок, протяженностью около 2 Mb, в составе которого имеется комплекс импринтированных генов и транскриптов, одни из которых экспрессируются с хромосомы отца, а другие - с хромосомы матери (рис, 3). Генетические изменения статуса импринтинга генов, расположенных в этом районе, являются этиологической основой синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана. Импринтированные гены, локализованные в данном кластере, находятся под координированным контролем так называемого центра импринтинга (ЦИ), располагающегося в 5 -конце гена SNURF-SNRPN. Часть из этих локусов, располагающихся ближе к центромере, содержит несколько генов, транскрибируемых только с отцовской хромосомы (MKRN3, MAGEL2, NDN, SNURF-SNRPN, НВП-13, НВП-85 и НВП-52) [Bocaccio et al., 1999; Glenn et aL, 1997; Grey et ah, 1999; Jong et. ah, 1999]. За исключением локусов HBII малой ядерной РІЖ (мяРНК), каждый из вышеуказанных генов ассоциирован с 5-дифференциально метилированным районом (ДМР), Ближе к теломере располагаются 2 других гена (UBE3A и АТР10С), которые в некоторых тканях предпочтительно экспрессируются с материнской хромосомы [Sutcliffe et al., 1997]. Однако в этих локусах ДМР еще не был идентифицирован. Материнская экспрессия гена UBE3A может регулироваться косвенно, через экспрессирующиися с отцовской хромосомы антисмысловой транскрипт.
Runte с соавторами [2001] показали, что подвергающийся процессингу антисмысловой транскрипт к гену UBE3A, начинается синтезироваться с центра импринтинга. SNURF-SNRPN-смысповая/UBE3А антисмысловая транскрипционная единица имеет размер более 460 kb и содержит, по крайней мере, 148 экзонов, включая ранее идентифицированные экзоны гена IPW. Она является источником, как трех ранее идентифицированных мяРНК - НВИ-13, НВИ-85 и НВП-52 [Cavaille et ah, 2000; Santos et al, 2000], так и четырех новых мяРНК - НВП-436, НВИ-437, HBII-438A и HBII-438B. Практически все эти мяРНК кодируются в пределах интронов указанного большого транскрипта. Авторы предполагают, что нарушение синтеза этих мяРНК может быть причиной развития неонатального фенотипа СПВ.
С 3 -конца кластер импринтированных генов фланкирован группой неимпринтированных локусов - GABRB3, GABRA5, GABRG3, а также Е6АВ, PAR4 и Р [Ohta et al. 1997; MacDonald et al., 1997]. Ген P отвечает за выработку пигмента и не подвержен импринтингу. Однако при наличии мутации в одном из аллелей и при последующей его гомозиготизации вследствие ОРД хромосомы 15 или при делеции участка 15qll-ql3 у больных с СПВ или СЭ он может фенотипически проявляться наличием у пробанда гипопигментации кожных покровов. Mitchell с соавторами [1996] в группе больных с СПВ из 43 человек с делецией участка 15qll-ql3 и 79 человек с ОРД хромосомы 15 материнского происхождения, показали наличие гипопигментации кожи в 77% случаев у больных с делеционным вариантом заболевания и только у 39% больных с ОРД,
SNRPN - ген, ответственный за синтез полипептида N малого ядерного рибонуклеопротеида (Small Nuclear Ribonucleoprotein associated Polipeptid N -SNRPN), имеет протяженность 25 кб, состоит из 10 экзонов и экспрессируется только с отцовского аллеля [Ozcelik et al., 1992; Sutcliffe et al., 1994; Zeschnigk et aL, 1997]. В 5 -конце гена SNRPN идентифицирована транскрибирующаяся последовательность нуклеотидов, названная SNURF (SNRPN Upstream Reading Frame), которая является бицистронной, поэтому она получила название SNURF-SNRPN. В результате трансляции единой мРНК этого гена получаются два белковых продукта - SNURF и SmN. Белок SNURF кодируется 1-3 экзонами и состоит из 71 аминокислоты, а белок SmN кодируется 4-10 экзонами и является основным сплайсосомным белком [Gray et al., 1999]. SmN принимает участие в сплайсингёе мяРНК в головном мозге, где замещает SmB /B белки. Полипептиды SmBVB - продукты альтернативного сплайсинга гена SNRPB, расположенного на хромосоме 20 (20р13) и экспрессирующегося во всех тканях, за исключением мозга в постнатальном периоде, где они замещаются SmN. У СПВ больных, при отсутствии экспрессии белка SmN происходит повышение экспрессии белков SmB /B [Nicholls, Knepper, 2001]. Ген SNRPN экспрессируется с отцовской хромосомы, а у больных с СПВ белковые продукты не выявляются. Локус SNURF полностью соответствует наименьшему району перекрывания делеций при СПВ, размер которого составляет 4,3 т.п.н., и, по-видимому, он играет важную роль в этиологии заболевания. Установлено, что отсутствие белкового продукта данного локуса не является единственной причиной заболевания. Поэтому СПВ можно охарактеризовать как заболевание сцепленных импринтированных генных синдромов, обусловленных нарушением функции генов с отцовской экспрессией. Ген NDN (necdin) располагается между генами PW71 и ZNF127. Его промоторная область в своем составе имеет CpG-динуклеотиды, которые на материнском гомологе метилированы и не экспрессируются. Ген Ndn экспрессируется у мышей преимущественно в нейронах головного мозга, имеет высокий уровнь экспрессии в гипоталамусе и других участках мозга в позднем эмбриональном и раннем постнатальном развитии [Gerard et al., 1999; Muscatelli et al., 2000]. Ген MAGEL2 расположен на 41 кЬ дистальнее гена NDN и кодирует белок из 529 аминокислот. У человека и мыши он экспрессируется только с отцовского гомолога. Lee с соавторами [2000] показали наличие гомологии между генами MAGEL2 и NDN (51%), которые преимущественно экспрессируются в нейронах мозга. Boccaccio с соавторами [ 1999] установили, что ортологичный ген (Magell) расположен на 150 кЬ проксимальнее гена Ndn. Ген ZNF127 (MKRN3) имеет исключительно отцовскую экспрессию и локализуется проксимальнее гена NDN. Оба этих гена имеют в промоторной области CpG-островки, метилирование которых выключает их считывание с материнского гомолога. В данном локусе находятся два гена - ZNF127 и антисмысловой к нему - ZNF127AS, которые транскрибируются в противоположных направлениях. Однако белковые продукты обнаружены только для гена ZNF127 [Jong et al., 1999].
Определение однородительской дисомии хромосомы
Для анализа ОРД использовали ДНК-маркеры, локализованные как непосредственно в критической области 15qll-ql3 (D15S817, D15S11, D15S172, GABRB3 и D15S113), так и вне границ этого района (D15S659, D15S642 и D15S643). Использование полиморфных маркеров, покрывающих всю длину исследуемой хромосомы, необходимо для выявления случаев сегментной ОРД, т.е. ОРД по определенному участку хромосомы. Как правило, для подтверждения наличия ОРД у пробанда, необходимо иметь подтверждение наследования от одного родителя целой хромосомы или ее фрагмента, по крайней мере, по двум разным информативным ДНК-маркерам. Выбор полиморфных локусов основывался на наличии у них высокой гетерозиготносте и способности хорошо разделяться с помощью электрофореза на агарозном или полиакриламидном геле.
Для подтверждения отцовства использовали STR-маркеры на локусы других хромосом: D14S306, D14S616, D14S599, D7S796 и D7S1805. Выявление микроделеции в области 15qll-ql3 проводили с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с ДНК-зондами D15S10, D15S11 и SNRPN. ОРД хромосомы 15 определяли с использованием высокополиморфных ДНК-маркеров на данную хромосому. При необходимости установления отцовства использовали ДНК-маркеры, расположенные на других хромосомах. Информация о пробах, включая нуклеотидную последовательность праймеров, была получена из Геномной Базы Данных (GDB) на сайте http://gdbwww.gdb.org. Критериями отбора ДНК-маркеров были: 1) тетрануклеотидная повторяющаяся последовательность; 2) гетерозиготность не менее 0,70; 3) размер продукта амплификации не более 300 п.н. В ходе выполнения работы было апробированно 14 ДНК-маркеров (см. табл. 7).
ПЦР проводили на программируемом термоциклере"Міпісус1ег" ("MJ Reseach", США). Реакционная смесь объемом 30 мкл, содержала 100 нг ДНК, 30 пмоль каждого праймера, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов с концентрацией 0,1 мМ каждого и 1 ед. активности Тад-ДНК-полимеразы. Реакция проводилась в буфере, рекомендованном производителем фермента (160 мМ (NH4)2S04; 650 мМ Tris-HCI, рН 8,8; 0,1 % Tween-20). На реакционную смесь наслаивали 30 мкл минерального масла. Концентрация хлористого магния подбиралась индивидуально для каждой пары праймеров. Температурный режим для праймеров был следующим: 1 цикл: денатурация: 94-95С - 5 мин; отжиг праймеров Тотж - 50-65С 2 мин; синтез ДНК - 72С - 3 мин. Последующие 32 цикла: денатурация: 94-95С — 30 сек; отжиг праймеров Тотж - 50-65С - 30 сек; синтез ДНК - 72С - 1 мин. Температура отжига для конкретных праймеров указана в табл. 8.
Продукты ПЦР разделяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном по стандартной технологии из реактивов фирмы «Сибэнзим» (Россия) в камерах для электрофореза фирмы Labconco (США). Для анализа фрагментов ДНК использовали 8% ПААГ. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия в конечной концентрации 0,1 мкг/мл, визуализацию фрагментов ДНК проводили в ультрафиолете. Результаты регистрировали с применением системы компьютерной видеосъемки на приборе «UV-VIS Imager II» (США). 2.5. Культивирование фибробластов тканей спонтанных абортусов и приготовление препаратов метафазных хромосом
Фрагменты плодных мешков эмбрионов переносили в чашку Петри с физиологическим раствором и антибиотиками (ампициллин и канамицина сульфат, в стандартных концентрациях) и тщательно отмывали от сгустков крови. Визуально идентифицировали внезародышевые оболочки и ворсины хориона и отделяли их от фрагментов эндометрия матки. Отобранные образцы переносили в следующую чашку Петри с физиологическим раствором. С помощью пинцета и ножниц отрезали небольшие фрагменты ткани и переносили их в чашку Петри со средой для культивирования, где тщательно измельчали. В состав среды для культивирования клеток входили: среда Ham F-12 - 60%, среда DMEM - 30%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, раствор витаминов стандартной концентрации - 0,5%, раствор незаменимых аминокислот стандартной концентрации - 0,5%, L-глутамин с раствором антибиотиков - 0,03%, антибиотики: гентамицин, ампициллин, канамицина сульфат - в стандартных концентрациях. Полученную суспензию пипеткой переносили в два флакона Карреля (по 5 мл). Флаконы помещали в термостат и инкубировали при температуре 37С.
Контроль за ростом культур проводили с помощью инвертированного микроскопа марки "OPTON" (Германия). По мере роста культур проводили смену среды во флаконах. После образования клеточного монослоя вокруг прикрепившихся к поверхности дна флакона эксплантатов, проводили субкультивирование. С этой целью из флакона удаляли среду и культуру обрабатывали 2 мл раствора трипсин (0,25%)-версен (0,20%), в соотношении 1:1, при 37С. Процедуру повторяли дважды, затем из флакона удаляли раствор и добавляли 5 мл свежей среды. С помощью тщательного встряхивания и пипетирования монослой клеток переводили в суспензию. Пипеткой переносили 2,5 мл суспензии в новый флакон. В каждом из флаконов объём среды доводили до 5 мл и помещали в термостат.
Анализ делеционного варианта синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана
На втором этапе исследования у больных с СПВ и СЭ с нарушенным статусом метилирования критической области хромосомы 15 был проведен FISH-анализ метафазных хромосом для выявления делеционного варианта заболеваний с тремя ДНК-пробами - D15S10, D15S11 и SNRPN (рис. 15а).
ПЦР-анализа с ДНК-маркерами, расположенными непосредственно в кластере импринтированных генов хромосомы 15 (рис. 156). В настоящем исследовании нами были использованы такие ДНК-маркеры, локализованные в данной области, как D15S11, D15S817, GABRB3, D15S172 и D15S113. На электрофореграмме присутствие только отцовского или материнского аллеля у пробанда может свидетельствовать о наличии делеции 15qll-ql3, как причины СЭ в первом случае или СПВ - во втором. Использование этих ДНК-маркеров оказалось очень удобным для выявления делеции, так как они являются высокополиморфными в исследуемой нами популяции. В то же время, использовать ДНК-маркеры для выявления делеционного варианта синдромов следует с осторожностью, так как присутствие на электрофореграмме только одного отцовского (СЭ) или материнского (СПВ) аллеля у пробанда может свидетельствовать не только о наличии делеции, но и являться результатом изодисомии хромосомы 15.
На рисунке 156 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР локуса D15S172 у пробанда с СПВ и его родителей. Наличие у ребенка только одного материнского и отсутствие отцовского аллеля свидетельствует о наличии у него либо делеции 15qll-ql3 отцовского происхождения, либо изодисомии хромосомы 15 материнского происхождения. Присутствие материнской изодисомии хромосомы 15 у пробанда достаточно редкое событие, так как основной механизм образования ОРД15мат заключается в «коррекции» трисомии до дисомии в раннем эмбриогенезе, которая приводит к гетеродисомии хромосомы 15. Вместе с тем, отцовская изодисомия хромосомы 15 является частым событием при СЭ, которая является следствием дупликации единственной хромосомы 15 в моносомной зиготе. Для дифференцировки изодисомии от делеции, необходимо проведение анализа сегрегации гомологов хромосомы 15 с использованием полиморфных ДНК-маркеров, расположенных как внутри кластера импринтированных генов, так и за его пределами. Исходя из видимых преимуществ применения FISH-метода для диагностики СПВ и СЭ, по сравнению с ПЦР-анализом, мы остановили свое внимание на первом из них.
Используемые в настоящем исследовании ДНК-пробы D15S10, D15S11 и SNRPN соответствуют участкам, расположенным вдоль кластера импринтированных генов хромосомы 15. Известно, что в 15qll-ql3 области у больных с СПВ и СЭ имеются несколько точек разрывов (break points -ВР), фланкированных дупликонами, по которым чаще всего проходят повреждения хромосомы 15 с формированием интерстициальных делеций [Eichler, 1998; Christian et al., 1999]. Наиболее частые точки разрывов - ВР1 и ВР2 находятся в проксимальном (qll), а ВРЗ — в дистальном (ql3) районах хромосомы 15, в результате чего образуются 2 класса мажорных делеций. Более крупная формируется между ВР1 и ВРЗ, а меньшая по протяженности - между ВР2 и ВРЗ. К сожалению, все три ДНК-пробы, которые были нам доступны, соответствуют участку, расположенному между ВР2 и ВРЗ, поэтому мы не смогли проанализировать у больных область хромосомы 15, расположенную между ВР1 и ВР2. Однако все три использованные нами ДНК-пробы позволяют одновременно обнаружить оба класса мажорных делеций хромосомы 15.
Настоящее исследование показало, что делеционный вариант заболевания имели 31 больной с СПВ (68,8%) и 6 больных с СЭ (54,5%). Анализ протяженности делеций установил, что у обследованных пробандов с СПВ и СЭ делеция критической области хромосомы 15 выявлялась по всем трем ДНК-пробам, т.е. наши больные не имели каких-либо атипичных делеций. Мы не обнаружили также ни одного случая мозаицизма по делеций 15qll-ql3. Наличие мозаичных делеционных вариантов СПВ и СЭ до сих пор является спорным вопросом. Рядом авторов были описаны подобные случаи [Mowery-Rushton et al., 1996; Szpecht-Potocka et al., 1996; Golden et al., 1999]. Однако Nicholls [2000] отрицает возможность их существования, в связи с тем, что делеций области 15ql l-ql3 могут возникать только во время гаметогенеза вследствие неправильной рекомбинации между разными дупликонами хромосомы 15 благодаря образованию петли размером до 4 Mb и такое событие может приводить к наличию делеций во всех клетках. Результаты настоящего исследования соответствуют этой точке зрения. Делеции в соматических тканях, по-видимому, могут возникать и во время митотического кроссинговера, но тогда кроме делеции области 15qll-ql3 должна формироваться дупликация. Доказательством этого суждения стала работа Tekin с соавторами [2000], которые у больного с СЭ помимо мозаичного клона по делеции 15qll-ql3 с вовлечением проб D15S10 и SNRPN обнаружили дупликацию области с вовлечением пробы D15ZL Патологический клон в данном исследовании встретился в 40% клеток лейкоцитов. Аналогичные результаты авторы получили и при исследовании буккального эпителия. Исходя из выше изложенных данных, такое явление является достаточно редким, но, по всей видимости, возможным событием.
Описание пациента с делеционным вариантом синдрома Прадера-Вилли. Пробанд М., девочка 11 лет (рис. 16А). Родители практически здоровы. Среди родственников пробанда наследственных заболеваний нет. Ребенок родился от третьей беременности, вторых родов. Возраст матери при рождении ребенка составил 38 лет, а отца — 42 года. Первый ребенок в семье имел сахарный диабет.
Во время настоящей беременности у женщины отмечались: ОРЗ, угроза прерывания беременности с пяти месяцев. Роды в срок (40-41 неделя), ягодичное предлежание, дородовое излитие околоплодных вод. Оценка по шкале Apgar 5-7 баллов. Масса при рождении составила 2900 г, рост 49 см. Ребенок находился в отделении патологии новорожденных с диагнозом: недостаточность кровообращения II степени, гипотрофия III степени.
Генетическая гетерогенность и алгоритм диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана
Результаты исследования частоты разных молекулярных форм СПВ и СЭ в Западно-Сибирском регионе России, в сопоставлении с другими популяциями, приведены в таблице 13. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что частота генетических вариантов СПВ и СЭ в данном регионе России по большинству показателей близка к европеоидным популяциям [Mitchell et aL, 1996; Laan et al., 1998; Jang et al., 1999]. В то же время в Западно-Сибирском регионе России у больных с СЭ отмечена более высокая частота ОРД15отц, по сравнению с аналогичным показателем в популяциях Европы и США (18,2% против 5%) и более низкая -делеционного варианта СЭ (54,5% против 65-75%). Полученные результаты по этим показателям отличаются и от европейской части России, которая, по данным Немцовой [2002], была представлена в 100% случаев делеционным вариантом СЭ (если не учитывать больных с предполагаемыми мутациями в гене UBE3A). Кроме того, европейская часть России, в отличие от Сибири, характеризуется более высокой частотой делеционного варианта СПВ (79,7% против 68,8%) и близка к таковой в популяции Финляндии (76%) [Kokkonen, 2003], в то время как Западно-Сибирский регион по этому показателю близок к усредненным данным по популяциям Европы и США, в том числе и к популяции Польши (66,6%) [Szpecht-Potocka et al., 1996].
В ходе выявления различных молекулярных форм СПВ или СЭ нами были оптимизированы подходы к их молекулярно-генетической диагностике (рис, 24). На первом этапе исследования у пациентов с клиническими признаками СПВ и СЭ проводят стандартный цитогенетический анализ, необходимый для исключения возможных крупных структурных нарушений хромосом у данных больных. Следующий этап включает определение характера метилирования участка 15qll-ql3 с использованием метил-специфической ПЦР, который позволяет поставить правильный диагноз в 100% случаев при СПВ и в 75-80% случаях при СЭ. Поскольку разные молекулярные формы обоих заболеваний у пробанда предполагают разный семейный прогноз, например, при мутациях центра импринтинга повторный риск возникновения этих болезней в семье достигает 50% [Nichols, Knepper, 2001 ], то возникает необходимость дальнейшей дифференцировки молекулярных вариантов исследуемых синдромов. Кроме того, как будет показано ниже, более «мягкая» клиническая картина у больных СПВ с ОРД хромосомы 15, по сравнению с его делеционным вариантом, позволяет осуществлять некий прогноз течения разных молекулярных форм заболевания.
Делецию 15qll-ql3 региона можно детектировать с помощью FISH-метода или ПЦР-анализа. Кроме того, Американская ассоциация медицинских генетиков [American Society of Human Genetics, 1996] а также Harvey с соавторами [2001] предложили использовать для детекции делеций 15qll-ql3 и ОРД хромосомы 15 ПЦР анализ с динуклеотидными ДНК-маркерами, Такие ДНК-маркеры более сложны в применении и плохо разделяются в акриламидном гель-электрофорезе. Мы предлагаем использовать, по-возможности, три- и тетрануклеотидные маркеры как на импринтированную ql l-q!3 область, так и на другие участки хромосомы 15. Предложенные в настоящем исследовании ДНК-маркеры, кроме D15S11, D15 S113 и GABRB3, являются тетрануклеотидными, имеют высокий аллельный полиморфизм и гетерозиготносте. В то же время применение только ПЦР-анализа не позволит дифференцировать делецию 15qll-ql3 от изодисомии хромосомы 15, а также детектировать мозаицизм по делеции кластера импринтированных генов. Поэтому FISH-метод в данном случае является более предпочтительным. Кроме того, мы предлагаем для диагностики как целых, так и сегментных форм ОРД использовать ПЦР-анализ с комплексом ДНК-маркеров, расположенных как непосредственно в импринтированном районе хромосомы 15, так и за его пределами.
В редких случаях у больных с клинической картиной СПВ или СЭ с характером метилирования, соответствующим данным синдромам, но не имеющих делеций 15ql l-ql3 или ОРД хромосомы 15, обнаруживают мутации в центре импринтинга. В 20-25% случаях пробанды с СЭ имеют статус нормальный статус метилирования генов критической области, У таких пациентов в некоторых случаях обнаруживают мутации в гене UBE3A. Такой вид патологии можно выявить с использованием анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК отдельных фрагментов данного гена с последующим их секвенированием.
На сегодняшний день предложены и другие алгоритмы диагностики СПВ и СЭ [American Society of Human Genetics, 1996; Harvey et aL, 2001]. Одним из отличиев настоящей схемы является проведение на первом этапе стандартного онтогенетического анализа. Его применение на первом этапе, по нашему мнению, обусловлено необходимостью исключения других заболеваний, связанных с хромосомными нарушениями. Так, по данным литературы, у больных с СПВ-подобным фенотипом выявляют другие генетические аномалии, характерные, например, для синдрома Мартина-Белл [DeVries et aL, 1993]. Кроме того, в представленном Американской ассоциацией генетики человека [American Society of Human Genetics, 1996], a также Залетаевым с соавторами [Залетаев, Немцова, 2001 ], алгоритме молекулярной диагностики СПВ и СЭ допускается выявление делеции области 15qll-ql3 с использованием ПЦР-анализа. Как мы выше отметитли, выявление делеционного варианта этих синдромов предпочтительнее проводить с использованием FISH-метода.
