Введение к работе
Актуальность. У высших млекопитающих известны, по-крайней мере, три формы инактивации Х-хромосомы: мейотическая, импринтированная и случайная. Мейотическая инактивация половых хромосом (MSCI: meiotic sex chromosome inactivation) происходит в сперматогенезе у самцов млекопитающих на стадии пахитены мейоза, когда синаптонемные комплексы связывают попарно все гомологичные хромосомы. Поскольку половые Х- и Y-хромосомы гетерологичны, то на данной стадии они формируют, так называемое, половое или XY-тельце и становятся транскрипционно неактивными (Lifschytz, Lindsley, 1972; Solari, Bianchi, 1975; Namekawa et al., 2007). Стоит отметить, что транскрипционно неактивное состояние половых хромосом сохраняется, в некоторой степени, и на постмейотических стадиях сперматогенеза (Namekawa et al., 2006).
Импринтированная и случайная формы инактивации имеют место у самок высших млекопитающих. Импринтированная инактивация, т.е. инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца (Хр), имеет место во всех тканях у сумчатых млекопитающих (Sharman, 1971) и на предымплантационных стадиях развития плацентарных. У плацентарных млекопитающих такая форма инактивации сохраняется в клетках внезародышевых органов (плацента, желточный мешок) (Takagi, Sasaki, 1975; Huynh, Lee, 2003; Okamoto, Heard, 2006). В клетках эпибласта Х-хромосома подвергается реактивации и далее выбор будущей неактивной Х-хромосомы происходит случайным образом (Heard, Disteche, 2006).
В основе импринтированной и случайной форм инактивации Х-
хромосомы лежит экспрессия гена Xist (X inactive specific transcript). Ген Xist
локализуется на Х-хромосоме в специфическом локусе – центре инактивации Х-
хромосомы, и транскрибирует длинную некодирующую ядерную РНК.
Транскрипт гена Xist распространяется вдоль будущей неактивной Х-хромосомы
и обуславливает привлечение различных факторов и ферментов,
модифицирующих хроматин. В процессе MSCI также было показано, что с Х-хромосомы осуществляется экспрессия гена Xist, тем не менее, для инициации сайленсинга и поддержания неактивного состояния половых хромосом транскрипт гена Xist не является необходимым (McCarrey et al., 2002; Turner et al., 2002). Ключевым этапом при Xist-зависимой или Xist-независимой инактивации, обуславливающим репрессию транскрипции X-сцепленных генов, является аккумуляция или утрата определенной комбинации модификаций гистонов. Ковалентные модификации коровых гистонов и их вариантов изменяют суммарный заряд, конформацию и другие свойства хроматина, способствуют привлечению в нужное место и время негистоновых факторов и ферментов, отвечающих за репрессию транскрипции и характер репликации (Heard, Disteche, 2006; Shevchenko et al., 2006). Таким образом, вовлеченность различных модификаций хроматина при реализации различных форм инактивации Х-хромосомы представляет собой фундаментальную задачу для исследований данных процессов.
В настоящее время известно, что при случайной инактивации в
соматических тканях человека, коровы и полевки, а также при
импринтированной инактивации в клетках экстраэмбриональной эндодермы
полевки модификации хроматина неактивной Х-хромосомы формируют два типа
гетерохроматина (Duthie et al., 1999; Chadwick, Willard, 2004; de Napoles et al.,
2004; Fang et al., 2004; Kohlmaier et al., 2004; Smith et al., 2004; Coppola et al.,
2008; Shevchenko et al., 2009). Первый тип гетерохроматина характеризуется
ассоциацией с Xist РНК, триметилированным по лизину в 27 положении
гистоном Н3 (Н3К27), моноубиквитинированным по лизину в положении 119
гистоном Н2А (uH2A). Данные модификации локализуются в районах,
соответствующих G-негативным бэндам. Второй тип гетерохроматина
характеризуется ассоциацией с гетерохроматиновым белком НP1,
триметилированным по лизину в 9 положении гистоном Н3 (Н3К9) и
триметилированным в 20 положении гистоном Н4 (Н4К20). Данные
модификации локализуются в G-позитивных бэндах. Кроме того, этот тип
гетерохроматина характерен не только для неактивной Х-хромосомы, но и для
районов конститутивного гетерохроматина. На сегодняшний день остается
неясным, свойствена ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосоме
других видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два
типа гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-
хромосомы на более ранних стадиях импринтированной инактивации. Кроме
того, показано, что в соматических клетках самок мыши структура неактивной
Х-хромосомы представлена модификациями только первого типа
(триметилированным Н3К27 и uH2A), тогда как триметилированные формы H3K9, H4K20 и HP1 были детектированы только в районах конститутивного хроматина (Rens et al., 2010). Это говорит о том, что существование двух типов гетерохроматина неактивной Х-хромосомы не является универсальным для всех плацентарных и изучение у других представителей, в том числе – отряда грызунов, является актуальной задачей.
Другим важным и активно обсуждаемым вопросом является явление импринтинга Хр, т.е. почему на ранних стадиях развития у представителей самок ряда млекопитающих инактивации подвергается именно Х-хромосома, унаследованная от отца. Одним из возможных объяснений является, так называемая, гипотеза о «преинактивированном» состоянии Хр: полагают, что в результате MSCI Х-хромосома сохраняет некоторые маркеры неактивного хроматина в зиготе при оплодотворении и поэтому предетерминирована в отношении инактивации. Соответственно, исследование специфики модификаций на мейотических, постмейотических этапах сайленсинга половых хромосом, а также на ранних этапах импринтированной инактивации позволит оценить вклад процесса MSCI в явление импринтинга Хр.
Решению вопроса о том, какие системы сайленсинга участвуют в формировании гетерохроматина неактивной Х-хромосомы при различных формах инактивации (в процессах мейотического и постмейотического сайленсинга половых хромосом, при импринтированной и случайной формах) будет способствовать изучение модификаций хроматина у различных представителей класса млекопитающих.
Цель работы – исследовать модификации хроматина неактивной Х-хромосомы при мейотической, импринтированной и случайной формах инактивации у грызунов
Задачи:
-
Исследовать спектр модификаций неактивного хроматина Х-хромосомы в составе полового тельца в процессе мейотической инактивации половых хромосом и на постмейотических стадиях сперматогенеза у полевки M. levis;
-
Изучить спектр и паттерн распределения модификаций неактивного хроматина Х-хромосомы в трофобластных стволовых клетках самок полевки M. levis и мыши M. musculus;
-
Исследовать спектр и паттерн распределения модификаций неактивного хроматина Х-хромосомы в соматических клетках самки крысы R. norvegicus
Научная новизна работы. Впервые установлена динамика формирования гетерохроматина неактивной Х-хромосомы в процессе импринтированной инактивации у двух видов грызунов: обыкновенной полевки M. levis и домовой мыши M. musculus. Было обнаружено, что в процессе мейотического сайленсинга половых хромосом и на ранних стадиях импринтированной инактивации в формировании гетерохроматина неактивной Х-хромосомы принимает участие спектр модификаций хроматина, отличный от последующих стадий импринтированной и случайной форм инактивации Х-хромосомы. Полученные данные позволили выдвинуть более масштабное предположение о процессе формирования гетерохроматиновых районов генома в раннем эмбриогенезе у грызунов. На примере соматических клеток крысы исследована структура хроматина неактивной Х-хромосомы при случайной инактивации, что позволило выявить не только общие закономерности, но и видоспецифические особенности процесса случайной инактивации у различных представителей млекопитающих.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты данной работы вносят вклад в понимание эпигенетических основ регуляции экспрессии генов и будут интересны для исследователей, занимающихся изучением раннего эмбрионального развития грызунов. Полученные данные могут быть использованы в курсах лекций по генетике для студентов биологических факультетов.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
-
Ранние этапы импринтированной инактивации Х-хромосомы у полевки и мыши характеризуются уникальным спектром и паттерном распределения модификаций неактивного хроматина, отличных от последующих этапов импринтированной и случайной форм инактивации Х-хромосомы;
-
При случайной инактивации не неактивной Х-хромосоме у крысы выявляется два типа гетерохроматина, отличающихся по набору
модификаций гистонов и ассоциированные с различными
последовательностями Х-хромосомы.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008 г., 2009 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009 (Москва, 2009 г.), третьей международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Оксфорд, 2011 г.), на международной конференции «Хромосома 2009», «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2009 г., 2012 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. По материалам диссертации опубликованы три работы. Две статьи – в рецензируемых отечественном и зарубежном журналах из списка ВАК, глава в коллективной монографии.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Анализ результатов иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом клеточных линий проводился совместно с к.б.н. А.И. Шевченко, к.б.н. Е.В. Дементьевой и к.б.н. С.В. Павловой
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 89 страницах, содержит 16 рисунков и 2 таблицы.
