Введение к работе
Актуальность темы
Вопрос об избирательной гибели эмбрионов разного пола в связи с функционированием половых хромосом у человека уже давно обсуждается в литературе. Многими авторами было показано, что величина показателя «соотношение полов» у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, погибших до 20 недель беременности, уменьшается, с заметным преобладанием зародышей женского пола [Сагг, 1971; Hassold et al., 1980; Lin et al., 1985; Eiben et al., 1990; Назаренко, 1993]. Некоторые авторы считают это следствием контаминации долговременных культур эмбриональных фибробластов материнскими клетками [Griffin et al., 1997; Smith et al., 1998; Bell et al., 1999]. Однако, ряд работ, выполненных с использованием прямых цитогенетических методов анализа тканей спонтанных абортусов, свидетельствуют о неслучайности такого отклонения в соотношении полов [Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990].
Х-хромосома имеет особенно большое значение на самых ранних этапах эмбриогенеза. Дифференцировка тканей у самок млекопитающих связана с переходом от биаллельной экспрессии большинства Х-сцепленных генов к моноаллельной в результате генетической инактивации одной из X-хромосом, обеспечивающей компенсацию дозы Х-сцепленных генов между полами [Monk, Harper, 1978; 1979]. Инактивация Х-хромосомы у видов с гетерогаметным полом происходит в раннем эмбриогенезе и, установившись однажды, неактивное состояние Х-хромосомы наследуется во всех последующих клеточных генерациях [Lyon, 1961]. Инактивация X-хромосомы связана с такими эпигенетическими механизмами контроля экспрессии генов как метилирование ДНК и геномный импринтинг. У сумчатых во всех тканях [Kaslow, Migeon, 1987], а у грызунов в экстраэмбриональных тканях [Takagi et al., 1982; Wake et al., 1976] обнаружена импринтированная инактивация отцовской Х-хромосомы, что связывают с необходимостью предпочтительной экспрессии материнских X-сцепленных генов для формирования плаценты и живорождения [Lyon, 1989]. Однако для человека не получено однозначных данных об избирательной экспрессии генов Х-хромосомы одного из родителей в тканях трофобласта. Имеются данные как о случайной инактивации X-хромосом во всех тканях у человека [Migeon et al., 1986; Migeon, 1994; Looijenga et al., 1999], так и об избирательной инактивации отцовской Х-
хромосомы в трофобласте [Migeon, Do, 1978; Ropers et al., 1978; Harrison 1989; Goto et al., 1997]. Учитывая функциональную значимость импринтированной инактивации Х-хромосомы в эмбриогенезе многих видов млекопитающих, не исключено, что однородительское наследование отцовской или материнской Х-хромосомы и/или предпочтительная инактивация Х-хромосомы одного из родителей могут вносить определенный вклад в раннюю эмбриональную летальность у человека.
Завершающим и важным в онтогенезе этапом процесса инактивации X-хромосомы является поддержание ее неактивного статуса в течение жизни индивида в последующих клеточных делениях, что, по мнению большинства исследователей, обеспечивается метилированием цитозина в специфичных сайтах ДНК. Поддержание статуса метилирования ДНК требуется для нормального эмбрионального развития мышей [Li et al., 1992]. Показано также, что аберрантное метилирование ДНК ассоциировано с большинством опухолей и аномалиями развития у человека [Yoder et al., 1996]. Основными сайтами метилирования ДНК являются CpG-последовательности. Метилирование ДНК в этих сайтах коррелирует с неактивным состоянием Х-сцепленных генов и стабилизирует неактивное состояние Х-хромосомы [Grant, Chapman, 1988; Gartler, Riggs, 1983]. Так как активное состояние обеих Х-хромосом не совместимо с нормальной дифференцировкой тканей [Monk, Harper, 1979], то гипометилирование ДНК второй Х-хромосомы может приводить к нарушению нормального развития организма. Таким образом, не исключено, что избирательная гибель эмбрионов женского пола на ранних этапах онтогенеза может быть ассоциирована с возможными нарушениями такого важного для нормального развития женских и отсутствующего у мужских зародышей процесса, как инактивация X-хромосомы.
Одним из Х-сцепленных генов с CpG-островком в области промотора является ген рецептора андрогенов человека (Androgen Receptor - AR), локализованный на длинном плече Х-хромосомы в районе Xqll-12 [Migeon et al., 1981; Brown et al., 1989]. Метилирование Hpall и Hhal сайтов, расположенных вблизи CAG-тракта гена, жестко коррелирует с неактивным состоянием Х-хромосомы, а высокий полиморфизм этого участка позволяет достаточно эффективно различать Х-хромосомы разного родительского происхождения [Allen et al., 1992]. В связи с этим, ген рецептора андрогенов представляет удобную модельную систему для оценки не только уровня метилирования ДНК, но и характера Х-инактивации (избирательная,
асимметричная, равновероятная) при использовании метилчувствительной ПЦР.
На основании вышеизложенного можно заключить, что исследование характера наследования, инактивации и статуса метилирования ДНК X-хромосом, т.е. процессов, связанных с эпигенетическим контролем экспрессии генов, у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, по-видимому, может прояс7шть причины эмбриолетальности у человека.
Цель работы заключалась в исследовании связи эпигенспгческой инактивации Х-хромосом и молекулярного полиморфизма некоторых X-сцепленных локусов с селективной гибелью эмбрионов с кариотипом 46,ХХ у человека.
Задачи исследования:
Провести цитогенетическое обследование спонтанных абортусов первого триместра беременности и создать банк ДНК семей, имеющих спонтанно абортированные эмбрионы с кариотипом 46,ХХ.
Исследовать полиморфизм и оценить информативность локуса тринуклеотидных CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов у населения западно-сибирского региона России.
Изучить родительское происхождение Х-хромосом у спонтанно абортированных эмбрионов, с анализом однородительской дисомии по X-хромосоме.
4. Оценить характер Х-инактивации и, в частности, частоту
асимметричной инактивации Х-хромосомы у спонтанных и медицинских
абортусов с кариотипом 46,ХХ.
5. Исследовать статус метилирования CAG-тракта гена рецептора
андрогенов у индуцированных и спонтанных абортусов с кариотипом
46,ХХ.
6. Изучить связь генетической вариабельности тринуклеотидных CAG-
повторов в первом экзоне гена рецептора андрогенов с эмбриолеталыюстью
у человека.
Научная новизна
В работе впервые показано, что максимальный вклад в различия трех групп спонтанных абортусов (спонтанные абортусы с развитым эмбрионом, неразвивающиеся беременности и анэмбрионии) вносят трисомии аутосом,
триплоидия и кариотип 46,XY. Установлено, что у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом уменьшение показателя «соотношение полов» по мере нарастания тяжести нарушения развития эмбриона связано с постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46.XY относительно ожидаемой и не зависит от частоты эмбрионов с кариотипом 46.ХХ. Высказано предположение что, экспрессия генов материнской X-хромосомы у XY-зародышей обеспечивает более стабильное их развитие в раннем эмбриогенезе по сравнению с ХХ-эмбрионами, нормальное развитие которых сопряжено с механизмом компенсации дозы Х-сцепленных генов, что повышает вероятность его нарушения у зародышей женского пола. Показано, что у спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ по мере нарастания тяжести нарушения эмбрионального развития увеличивается доля зародышей с асимметричной инактивацией Х-хромосом. Не установлено существенного вклада однородительской дисомии по X-хромосоме в пренатальную гибель зародышей человека. Показано что, уровень метилирования ДНК Х-хромосом в тканях трофобласта не отличается у спонтанно погибших и индуцированных абортусов с кариотипом 46,ХХ. Впервые для популяции Западной Сибири охарактеризован полиморфизм локуса тринуклеотидных повторов первого экзона гена рецептора андрогенов и показана ассоциация генотипов, содержащих небольшое число CAG-повторов, с эмбриональной летальностью.
Практическая значимость работы
Полученные в ходе настоящего исследования данные по молекулярному полиморфизму CAG-повторов гена рецептора андрогенов можно использовать при медико-генетическом консультировании. Поскольку однородительское наследование Х-хромосом не вносит существенного вклада в раннюю эмбриональную гибель у человека, то нет необходимости его анализа при исследовании причин спонтанного прерывания беременности. Найденная ассоциация частоты генотипов локуса тринуклеотидных повторов гена рецептора андрогенов с минимальным числом CAG-повторов с эмбриональной летальностью у человека требует дальнейшего выяснения характера данной взаимосвязи с целью выявления семей с высоким риском невынашивания беременности.
Положения, выносимые на защиту:
1. Уменьшение показателя «соотношение полов» у эмбрионов с
нормальным кариотипом в ряду: спонтанные абортусы без выраженной
задержки внутриутробного развития - неразвивающиеся беременности -
анэмбрионии, связано с постепенным снижением доли зародышей с
кариотипом 46.XY.
Однородительская дисомия по Х-хромосоме не вносит существенного вклада в раннюю эмбриональную летальность у человека.
Уровень метилирования ДНК Х-хромосом одинаков у спонташшх и индуцированных абортусов с кариотипом 46,ХХ.
Распределение аллелей локуса CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов у населения западно-сибирского региона России, в отличие от других исследованных популяций, характеризуется более узким спектром аллелей и смещением модального класса в сторону большего числа тршгуклеотидных повторов.
У спонтанных абортусов первого триместра беременности с кариотипом 46,ХХ преобладают генотипы с небольшим числом CAG-повторов гена рецептора андрогенов по сравнению со здоровыми женщинами.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены на IV итоговой конференции НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 1997), научных чтениях, посвященных 100-летию профессора В.П.Чехова (Томск, 1997), второй европейской конференции цитогенетиков (Вена, 1999), международном симпозиуме по инактивации Х-хромосомы у млекопитающих (Новосибирск, 1999).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов собственных исследований с обсуждением по разделам, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 125 страницах текста, содержит 9 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 185 источников, из них 20 отечественных и 165 зарубежных.
