Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Рогоза, Татьяна Михайловна

Введение к работе

Актуальность темы. Хорошо известно, что некоторые белки могут существовать in vivo в форме амилоидов - агрегатов фибриллярной формы. Образование амилоидов обусловлено полимеризацией молекул белка, сопровождающейся их конформационной перестройкой с формированием специфической «кросс-Р-структуры». Амилоиды являются причиной амилоидозов - обширной группы заболеваний человека и животных. Особой разновидностью амилоидов являются прионы (от «proteinaceous infection»), отличающиеся от других амилоидов своей трансмиссибельностью. Прионы были открыты при изучении инфекционных губчатых энцефалопатии человека и животных. Оказалось, что эти заболевания обусловлены переходом в прионную форму клеточного белка PrP (Prusiner et al, 1984). Прион, возникающий на основе белка РгР, является примером инфекционного возбудителя, имеющего белковую природу.

Существенный прогресс в исследовании явления прионизации белков был достигнут, когда выяснилось, что некоторые белки дрожжей Saccharomyces cerevisiae также могут существовать в форме прионов. Однако есть существенное различие между прионами млекопитающих и прионами дрожжей. Прионы млекопитающих -это инфекционные агенты, а прионы дрожжей представляют собой цитоплазматические наследственные детерминанты. Обнаружение дрожжевых прионов позволило выявить новый механизм передачи информации в ряду клеточных поколений, в основе которого лежит наследование конформационно измененной белковой молекулы. Первыми были открыты три дрожжевых приона: [РБҐ], прионная форма белка Sup35 (Сох, 1965), [URE3], прионная форма белка Ure2 (Lacroute, 1971) и [PIN*], прионная форма белка Rnql (Derkatch et al, 1997). Эти прионы в настоящий момент наиболее хорошо изучены. Список дрожжевых прионов постоянно увеличивается; за последние два года к нему добавлено еще четыре детерминанта: [SWf] (Du et al, 2008), [MCA] (Nemecek et al, 2008), [ОСҐ] (Patel et al, 2009) и [MOT3⁺] (Alberti et al, 2009), которые являются прионными формами белков Swil, Meal, Сус8 и МоїЗ, соответственно.

К настоящему моменту выяснены основные закономерности возникновения и поддержания прионов в клетке дрожжей, сформулированы критерии прионного наследования (Wickner, 1996). Считается, что основополагающим параметром в детерминации прионных свойств белков дрожжей является присутствие в них участков, обогащенных остатками аспарагина и/или глутамина. Анализ протеома дрожжей показал, что такие белки составляют примерно 1,7% от всех белков дрожжевой клетки (Michelitsch and Weissman, 2000). Это позволяет предполагать, что помимо уже известных прионов у дрожжей существуют и другие наследственные детерминанты, имеющие сходную природу. Нельзя исключить также, что подобными свойствами могут обладать и белки с другими особенностями первичной структуры, поскольку прионный белок млекопитающих, РгР, не содержит аспарагин/глутамин-богатых последовательностей (Prusiner, 1998). Все это делает актуальным поиск новых прионов у дрожжей.

В нашей лаборатории ранее обнаружен детерминант, свойства которого сходны со свойствами прионов (Volkov et al., 2002). Фенотипически этот детерминант, обозначенный [ISP], проявляется как антисупрессор, нейтрализующий проявление некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в гене SUP35. Подобно другим дрожжевым прионам [ISP] наследуется цитоплазматически, элиминируется при росте дрожжей на среде с гидрохлоридом гуанидина (GuHCl) и с высокой частотой

возникает вновь после элиминации. Фенотип [ISP ] доминантен по отношению к фенотипу [isp~]. Вместе с тем, существенное отличие [ISP] от уже найденных прионов дрожжей состоит в независимости его поддержания от шаперона Hspl04.

Для выяснения природы [ISP] необходимо идентифицировать гены, от которых зависит присутствие [ISP] в клетке. Среди этих генов должен быть и его структурный ген, то есть ген, кодирующий белок, прионной форме которого соответствует [ISP].

В связи с этим целью исследования явилась идентификация структурного гена [ISP] и изучение способности к прионизации белка, кодируемого этим геном.

В ходе работы решались следующие задачи: (1) поиск генов, инактивация которых приводит к элиминации [ISP]; (2) характеристика влияния найденных генов на возникновение, проявление и поддержание [ISP]; (3) выявление среди найденных генов кандидата на роль структурного гена детерминанта [ISP]; (4) доказательство связи между этим геном и детерминантом [ISP]; (5) изучение прионных свойств белка - продукта этого гена.

Научная новизна исследования. Получены генетические, биохимические и цитологические доказательства того, что обнаруженный ранее нехромосомный детерминант дрожжей [ISP] представляет собой прионную форму белка Sfpl. Таким образом, это 8-й по счету наследственный детерминант дрожжей, имеющий белковую природу. Прион [ISP] отличается по многим существенным свойствам от других прионов дрожжей, описанных к настоящему моменту. К числу таких свойств следует отнести ядерную локализацию, независимость поддержания от шаперона Hspl04, более высокую частоту спонтанного и индуцированного сверхэкспрессией гена SFP1 возникновения. Кроме того, прионизация белка Sfpl не равнозначна последствиям делеции гена SFP1, что позволяет предполагать, что прионное превращение приводит не к потере функции белка Sfpl, а к ее модификации. Полученные данные имеют приоритетный характер и расширяют представления о феномене прионного превращения белков у дрожжей и его функциональной и адаптивной роли.

Практическая ценность. Прионизация белка РгР человека и животных лежит в основе заболеваний, относящихся к инфекционным амилоидозам. Эти заболевания неизлечимы; более того, существует возможность передачи инфекции от животных человеку. Кроме того, существует группа неинфекционных амилоидозов, среди которых такие заболевания как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Исследование прионов дрожжей позволяет разрабатывать простые модели для изучения механизмов амилоидогенеза, поиска агентов, способных предотвращать амилоидизацию белков или элиминировать амилоидную (прионную) форму белка из клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 22-й Международной конференции по генетике дрожжей и молекулярной биологии (Братислава, Словакия 2005), на 23-й Международной конференции по генетике дрожжей и молекулярной биологии (Мельбурн, Австралия, 2007), на конференции по белковому синтезу и трансляционному контролю (Гейдельберг, Германия 2007), на 3-й Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на 12-м Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008), на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008), на конференции, посвященной 90-летию кафедры генетики и селекции СПбГУ (СПб, Россия 2009), на 27-м Международном специализированном дрожжевом симпозиуме (Париж,

Франция 2009), на конференции ЕМВО по транскрипции у дрожжей (Барселона, Испания, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем работы. Работа изложена на 146 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (193 наименования). Работа содержит 10 таблиц и 40 рисунков.

Похожие диссертации на Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeРябинкова Наталья Анатольевна

Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно-важном гене SUP45 дрожжей Saccharomyces CerevisiaeМоскаленко Светлана Евгеньевна

Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeКиктев Денис Александрович

Молекулярно-генетический анализ функций гена HSM3 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeЧерненков, Андрей Юрьевич

Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeШабельская Светлана Васильевна

Анализ функции гена RAD29/RDH54, контролирующего эксцизионную репарацию оснований у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeЛатыпов Виталий Феликсович

Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeРадченко Элина Александровна

Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeАксенова Анна Юрьевна

Генетический контроль координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeСамбук Елена Викторовна

Изучение регуляции синтеза фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Самбук Елена Викторовна