Введение к работе
Актуальность работы Терминальные районы представляют собой хромосомные домены, которым отводится главенствующая роль в сохранении стабильности хромосом и определяющая роль в эволюции генома Согласно современным представлениям, терминальные районы хромосом состоят из теломер и прилегающих к ним субтеломерных районов, отделяющих теломеру от основного тела хромосомы
Теломеры состоят из тандемных (ТТАГГГ)„ повтров и заканчиваются Г-обогащенным одноцепочечным концом, который «кэппирует» конец теломеры Важную роль в поддержании структуры теломер играют белковые факторы TRF1/TRF2, осуществляющие регуляцию длины теломер, а также ряд факторов, необходимых для функционирования теломер и участвующих в репарации и рекомбинации ДНК (Saldanha et al, 2003) Теломеры играют важную роль в правильном протекании мейоза, а также во многих ключевых клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, клеточное старение и онкотрансформацию (Blasco et al, 1999, Feuerbach et al, 2002) Во многом они определяют структуру интерфазного ядра (Nagele et al, 2001)
Репликация теломер осуществляется с помощью специального фермента, теломеразы, представляющего собой комплекс обратной транскриптазы и РНК матрицы Уменьшение активности теломеразы в соматических клетках человека приводит к нарушению структуры теломер и хромосомной нестабильности (Shay, Bacchetti, 1997, Gisselson et al, 2001) В настоящее время описан альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации теломерных и субтеломерных последовательностей (Bhattacharyya, LuMig, 2006, Bryan, Reddel, 1997), с помощью которого клетки преодолевают ростовой кризис в отсутствии теломеразы и становятся «бессмертными»
Субтеломерные районы хромосом также содержат повторенные последовательности, но это, как правило, смесь разного рода повторенных последовательностей и сегментных дупликаций Субтеломеры являются наиболее пластичными хромосомными районами, для которых характерна повышенная частота рекомбинационных и мутационных событий Эти свойства субтеломер обуславливают их роль в молекулярной эволюции генома и этиологии ряда врожденных заболеваний человека (Linardopoulou et al, 2005, Flint et al, 1995)
Несмотря на то, что теломеры и субтеломеры играют важную роль в структурно-функциональной организации хромосом, структура этих районов практически не изучена у других видов млекопитающих, нежели человек и мышь Тем не менее, даже эти немногочисленные данные указывают на то, что структура этих районов может быть очень разной даже у близкородственных видов В данном исследовании была изучена структура терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной {Sorex araneus) (Soricidae, Euhpotyphla) Кариотипы этих видов составлены из одинаковых на цитологическом уровне хромосомных плеч, однако отличаются числом акроцентрических и метацентрических хромосом Главенствующую роль в их
кариотипической эволюции сыграли Робертсоновские (Rb) перестройки, обусловленные стоянием акроцентриков и распадом метацентрических хромосом Принимая во внимание тот факт, что эти виды-близнецы дивергировали недавно, несколько сот тысяч лет тому назад (Taberlet et al, 1994), мы надеялись выявить следы недавних эволюционных преобразований, связанных с терминальными районами хромосом
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок бурозубки иберийской (Sorex grananus) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus), представленной в нашем исследовании тремя хромосомными расами, которые отличаются интенсивностью Робертсоновских слияний, а также определение локализации теломерных последовательностей в хромосомах этих видов
Непосредственные задачи исследования были сформулированы следующим образом
Адаптировать дифференциальную окраску DAPI для идентификации всех хромосом S grananus и S araneus при проведении FISH с используемыми в исследовании пробами,
Используя FISH, изучить распределение теломерных последовательностей в хромосомах S grananus и S araneus и оценить размер теломер в хромосомах этих видов с помощью разных методических подходов Q-FISH, модифицированной Q-FISH и TRF анализа,
Определить локализацию рибосомной ДНК и потенциально активных ядрышкообразующих районов на хромосомах S grananus и S araneus,
Изучить структуру теломер S grananus, используя двуцветный FISH на фибриллах с теломерной и микродиссекционной пробой, полученной из перицентромерных районов двух акроцентриков S grananus, а также с PNA теломерной пробой и пробой к 18S рДНК
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые было изучено распределение теломерной ДНК и определены размеры теломер в хромосомах 5 grananus и S araneus У S grananus выявлены теломеры двух типов очень длинные, содержащие в среднем 213 т п н , и очень короткие, содержащие в среднем 3,8 т п н теломерного повтора Размер теломер в разных хромосомных расах близкородственного вида S araneus колебался от 6,8до15,2тпн
Впервые в хромосомах S araneus Новосибирской расы были выявлены ITS, причем частота встречаемости их в перицентромерных районах была тем выше, чем позже в ходе кариотипической эволюции эти хромосомы сформировались
Впервые было показано, что число и локализация потенциально активных ядрышкообразующих районов может сильно различаться у видов-близнецов У 5 grananus ЯО районы были локализованы на концах коротких плеч 32-х акроцентриков, тогда как у S araneus ЯО районы были локализованы в дистальных районах плеч t, и, о и д независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах
4 Впервые у одного из видов бурозубок, grananus, были описаны теломеры, необычной для млекопитающих структуры, в которых теломерные последовательности перемежаются с рибоссмными
Полученные в ходе исследования результаты используются при чтении спецкурса «Цитогенетика» для студентов 4-го курса специальности «цитология и генетика» биологического отделения ФЕН Новосибирского государственного университета
Положения, выносимые на защиту.
Использование подхода, сочетающего ряд методов молекулярной цитогнетики FISH с набором проб разного происхождения на хромосомах и отдельных фибриллах, Q-FISH в классическом и модифицированном вариантах, ЗБ-микроскопии, выявление потенциально активных ЯО районов с помощью окраски серебром, а также определение размеров рестрикционных теломерных фрагментов позволило установить, что размер и структура теломер у S grananus отличаются от таковых у вида-бчизнеца S araneus и других изученных видов млекопитающих
У S grananus выявлено два типа теломер теломеры первого типа локализованы на коротких плечах 32-х акроцентриков и содержат в среднем 213 т п н теломерной ДНК. В проксимальной части большинства этих теломер теломерные повторы перемежаются с рибосомными Второй тип представлен короткими теломерами размером 3,8 т п н Они локализованы на остальных концах хромосом Таким образом, теломеры в одной клетке и даже на одной хромосоме 5 grananus могут различаться по размеру почти на два порядка
По-видимому, теломеры уникальной структуры на хромосомах S grananus сформировались в результате реорганизации терминальных районов хромосом, заключающейся в совместной амплификации теломерных и рибосомных повторов и перераспределении их по терминальным районам хромосом
Апробация работы и публикации Основные результаты работы были представлены на XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на «The Chromosome Conference XV» (Лондон, Великобритания, 2004), на «7th Meeting of the International Sorex araneus Cytogenetic Committee (ISACC)» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), на «17lh European Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene Mapping» (Лиссабон, Португалия, 2006), на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, Россия, 2007), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ в отечественной и зарубежной печати
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 21 рисунком и содержит 3 таблицы
