Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из важнейших направлений современной клеточной биологии является изучение регуляции активности-генов в контексте структуры хроматина. К этому направлению относится исследование молчащих хромосомных доменов. Кроме прицентромерных районов хромосом, которые состоят, в основном, из повторенной ДНК и почти не содержат генов (прицентромерный гетерохроматин, ПГХ), к молчащим районам относят также районы интеркалярного гетерохроматина (ИГХ). В политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster эти сравнительно небольшие районы разбросаны по плечам хромосом (обзор: Zhimulev I.F. et al, 2003а) и часто содержат кластеры уникальных тканеспецифичных генов со сходными профилями транскрипции (Belyakin S.N. et al, 2005; 2010).
Общими свойствами молчащих районов являются репрессия транскрипции, плотная упаковка хроматина и поздняя репликация ДНК в S-фазе клеточного цикла. В политенных хромосомах эти районы также демонстрируют недорепликацию ДНК, которая приводит к разломам и эктопическим контактам между разными районами гетерохроматина (Zhimulev I.F. et al., 2003a). Маркером районов прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желез дрозофилы является белок SUUR, продукт гена SuUR (Suppressor of Underreplicatiori). Фенотип мутации SuUR -подавление недорепликации в гетерохроматиновых районах политенных хромосом - обусловлен тем, что все районы интеркалярного гетерохроматина и некоторые прицентромерные районы заканчивают репликацию существенно раньше, чем в норме. Механизмы влияния гена SuUR на репликацию ДНК пока неизвестны (Belyaeva E.S. et al, 1998; обзоры: Zhimulev I.F. et al, 2003a; Колесникова Т.Д. и др., 2006).
Несмотря на интенсивное изучение белкового состава и механизмов репликации районов ИГХ дрозофилы, в настоящее время организация этих районов и даже их функции остаются в большинстве случаев неизвестными. Одна из проблем, стоящих перед исследователями, это отсутствие данных о локализации цитологически определяемых районов ИГХ на физической карте генома дрозофилы. В результате до сих пор можно говорить лишь об очень приблизительном соответствии плотных дисков политенных хромосом, которые демонстрируют разломы, и районов поздней репликации и недорепликации, обнаруженных молекулярными методами в различных геномных исследованиях. Изучение дисков политенных хромосом методами молекулярной биологии во многих случаях сильно затруднено. К тому же невозможно точно определить, какие гены находятся в дисках ИГХ политенных хромосом. Сравнение свойств этих районов в диплоидных тканях и в тканях с политенными хромосомами также оказывается невозможным.
Сейчас очень быстро развивается техника исследования распределения белков, времени репликации и профилей экспрессии генов на уровне целых геномов. Однако из-за неудобства работы с ДНК неделящихся полиплоидных клеток, внутренняя организация районов ИГХ в политенных хромосомах остается почти неизученной. Непонятно, являются ли эти районы цельными
структурами или состоят из отдельных частей, независимо демонстрирующих свойства гетерохроматина.
Цели и задачи работы. Цель работы - провести детальный цитогенетический анализ индивидуального района иитеркалярного гетерохроматина политенных хромосом слюнных желез дрозофилы. В данной работе был исследован район 75С1-2. Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:
-
Получить ряд хромосомных перестроек, затрагивающих район 75С1-2.
-
Получить систему зондов для молекулярно-биологических работ с разными участками района 75С1-2.
-
Определить с максимальной точностью расположение дисков района 75С1-2 на физической карте генома дрозофилы.
-
Изучить локализацию белка SUUR и его влияние в разных частях района 75С1-2.
-
Получить профиль политенизации района 75С1-2 методом Саузерн-блот гибридизации.
-
Изучить влияние хромосомных перестроек на степень политенизации отдельных частей района 75С1-2.
Научная новизна работы. Впервые с высокой точностью определены границы дисков и исследовано распределение различных характеристик хроматина по длине индивидуального района иитеркалярного гетерохроматина политенных хромосом дрозофилы.
Впервые показана независимость связывания белка SUUR с разными фрагментами района иитеркалярного гетерохроматина.
Впервые показано влияние окружающих последовательностей на степень политенизации района иитеркалярного гетерохроматина.
Положения, выносимые на защиту.
-
Район иитеркалярного гетерохроматина 75С1-2 политенных хромосом D. melanogaster с точностью до 10 т. п. о. соответствует участку физической карты хромосомного плеча 3L с координатами 18173300-18618800 (release 5.22).
-
Район иитеркалярного гетерохроматина 75С1-2 обладает асимметричным профилем политенизации, который расширяется при введении в геном двух дополнительных копий гена SuUR.
-
Степень политенизации отдельных частей района иитеркалярного гетерохроматина 75С1-2 зависит от окружающих последовательностей.
Практическая значимость работы. Точное картирование и подробная характеристика внутренней структуры района 75С1-2 позволяет планировать и проводить исследования тонких процессов, связанных с интеркалярным гетерохроматином. Кроме того, полученные в данной работе линии дрозофилы с перестройками в районе 75С1-2, а также клонированные зонды из этого района могут быть использованы в работе по цитогенетике дрозофилы.
Апробация работы. Результаты работы представлены на международных конференциях в докладах и стендовых сообщениях: на 7-ой, 8-ой и 9-ой международных конференциях по гетерохроматину дрозофилы (Губбио, Италия, 2005, 2007, 2009); на международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006); на международной конференции, посвященной 90-летию
академика Д. К. Беляева (Новосибирск, 2007); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); на юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007); на международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009).
По теме диссертации опубликованы четыре статьи.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Часть работ по анализу цитологических препаратов и выявление белка SUUR в разных фрагментах района 75С1-2 выполнялось совместно с Е. Б. Кокоза. Частоты разломов района 75С1-2 определялись совместно с Е. Б. Кокоза и Е. С. Беляевой. Выявление двуцепочечных разрывов ДНК иммуноокрашиванием выполнялось совместно с Е. Н. Андреевой. Картирование на политенных хромосомах проводилось совместно с И. Ф. Жимулевым и Е. С. Беляевой.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы (286 ссылок). Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 22 рисунка.
