Введение к работе
Актуальность работы
В настоящее время микробиологами получены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании и широком распространении в природе ультрамелких форм бактерий с объемом клеток менее 0,1 мкм3, т.е. близким к теоретически рассчитанному минимальному размеру клеток (Workshop, 1999, Schut et al., 1997; Cavicchioli and Ostrowski, 2003, 2003; Panikov, 2004; Duda et al., 2011; Дуда с соавт., 2012). Имеются свидетельства того, что ультрамикробактерии (УМБ) являются составной частью микробных сообществ многих природных экосистем: они обнаружены в почвах, илах, льдах Гренландии, многолетнемерзлых грунтах, кишечнике человека и насекомых, ризосфере растений (Vancanneyt et al., 2001, Janssen et al., 1997, Iizuka et al, 1998, Miteva, Brenchley, 2005, Geissinger et al, 2009). Ультрамелкие бактериальные формы являются представителями домена Bacteria, где их ближайшими родственниками являются виды с более крупными, типичными для бактерий клетками, что указывает на полифилетическое происхождение УМБ. Однако, несомненно, что таксономическое, физиолого-биохимическое разнообразие и экологическая роль в природе, а также происхождение УМБ - ещё слабо исследованная область микробиологии. Очевидно, что для изучения этого нового для исследователей аспекта мира микроорганизмов необходимы специальные подходы и инструментарий.
Мелким размерам клеток (объемом менее 0,1 мкм3) соответствуют малые размеры геномов - от 3,2 до 0,56 Mb. Высокая численность ультрамелких бактерий в морских экосистемах свидетельствует о существенном вкладе УМБ в формирование биомассы океана (Vancanneyt et al., 2001; Rappe et al., 2002). Изучение чистых культур УМБ показало, что они способны использовать в качестве субстратов различные органические соединения (Schut et al., 1993, 1995, 1997a, Giovannoni et al., 2005b), в том числе - полихлорированные бифенилы (May et al., 2008). Некоторые морские олиготрофные УМБ обладают протеородопсином и способны использовать в энергетическом метаболизме энергию солнечного света (Giovannoni et al., 2005a). Культивируемые формы УМБ характеризуются большим разнообразием морфологии, ультраструктурной организации, физиологии и биохимии. По строению клеточной оболочки УМБ разделяются на три группы: грамположительные, грамотрицательные и лишённые клеточной стенки.
Среди ультрамикропрокариот (УМП) известны паразитические представители УМБ, такие как Micavibrio admirandus, Bdellovibrio bacteriovorus, Mycoplasma genitalium (Abram et al., 1974, Ламбина с соавт., 1982, Fraser et al., 1995, Jurkevitch, Davidov, 2006) и ультрамикроархея - Nanoarchaeum equitans (Huber et al., 2002). Хищные УМБ (паразиты микроорганизмов) относятся к организмам различных филогенетических линий и являются одним из основных экологических факторов, формирующих структуру сообществ, управляющих микробным разнообразием (Jurkevitch, 2007). Среди их жертв есть как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии и даже эукариотические микроорганизмы. Однако цитологические аспекты паразитизма подробно изучались лишь у представителей семейства Bdellovibrionaceae (Abram et al., 1974).
В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН выделены уникальные хищные бактерии - Micavibrio admirandus (Ламбина с соавт., 1982) и Micavibrio aeroginosavorus (Ламбина с соавт., 1983), а недавно - четыре штамма грамотрицательных УМБ - NF1, NF3, NF4 и NF5. У штаммов NF1 и NF3 обнаружена способность к факультативному паразитизму на живых клетках цианобактерий Chlorogloeopsis fritschii ATCC 27193, Anabaena variabilis АТСС 29413, Nostoc muscorum sp. 3 и Spirulina sp. (Дуда с соавт., 2007). Показано, что при совместном культивировании УМБ и цианобактерий происходит адгезия УМБ к хозяйским клеткам, их проникновение внутрь клеток и лизис последних (Дуда с соавт., 2007). Однако цитологические механизмы взаимодействия паразитических УМБ с гетеротрофными бактериями остаются слабо изученными.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы состоит в характеристике особенностей строения клеток новых ультрамикробактерий - штаммов NF1, NF3, NF4, NF5 и сравнительном анализе цитологических аспектов хищничества этих штаммов.
В соответствии с целью решались следующие задачи:
-
Изучить особенности морфологии и ультраструктурной организации клеток исследуемых штаммов УМБ.
-
Охарактеризовать филогенетическое положение исследуемых штаммов NF4
и NF5.
3. С помощью методов электронной, флуоресцентной микроскопии и цитохимии изучить цитологические аспекты взаимодействия бактерий-хищников и бактерий-жертв.
Научная новизна работы
Впервые с помощью флуоресцентной, фазово-контрастной, электронной микроскопии и электронно-цитохимических методов изучена ультраструктурная организация, циклы развития и этология новых хищных УМБ - штаммов Kaistia sp., NF1, NF3 и Chryseobacterium sp., NF4 и NF5.
Установлено, что: 1) изученные штаммы NF4 и NF5 представлены неподвижными клетками с грамотрицательной организацией оболочек; 2) клетки штаммов NF1, NF3, NF4 и NF5 репродуцируются как путём поперечного деления, так и почкования; 3) уникальной цитологической особенностью штаммов NF1 и NF3 является наличие на их клеточной поверхности конусовидных периплазматических протрузий, выполняющих функцию прикрепления к оболочкам хозяйских клеток; 4) клетки всех изученных штаммов УМБ обладают поверхностной сетью, состоящей из длинных полисахаридных нитей, которые снабжены гранулами (узелками), расположенными по всей длине нитей с интервалом ~20 нм; 5) обнаружена способность исследуемых штаммов к эпибионтному факультативному хищничеству на некоторых грамотрицательных и грамположительных бактериях.
Показано, что взаимодействие хищных клеток с жертвами происходит при помощи неизвестных ранее механизмов с участием таких клеточных структур, как полисахаридные сети, обладающие особыми гранулами (узелками), и протрузии - конусовидные адгезивные выступы клеток у штаммов NF1 и NF3. Использование этих адгезивных структур, а также сил броуновского движения в процессе взаимодействия с клетками-жертвами является особенностью этологии изученных ультрамикробактерий.
Научно-практическая значимость работы
Полученные в настоящей работе результаты имеют большое не только теоретическое, но и прикладное значение. Изученные штаммы УМБ могут служить модельными организмами в проводящихся исследованиях, посвящённых решению как теоретических проблем минимализации микробной клетки, эволюции УМБ, так и в биотехнологических разработках, основой которых может быть обнаруженная паразитическая активность охарактеризованных нами УМБ. Полученные нами результаты используются при чтении курсов лекций по цитологии микроорганизмов для магистрантов Пущинского государственного естественно-научного института и студентам Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.
Апробация материалов работы
Результаты и основные положения работы представлены на международной конференции FEMS (4th FEMS Congress of European Microbiologists, Geneva, Switzerland, 2011), на международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2010, 2012, 2013), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), всероссийском, с международным участием, биологическом конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия 2008» и школе - конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008, 2010), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2010), а также на семинарах и постерных сессиях ИБФМ РАН (Пущино, 2008-2011).
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 9 - в форме тезисов, 4 - экспериментальные статьи и 1 обзор.
Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Есиковой Т.З., к.б.н. Акимову В.Н., к. б.н. Шороховой А.П., Гафарову А.Б. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Дуде В.И. и к.б.н. Сузиной Н.Е.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 ссылок, из них 29 на русском и 146 на английском языках, содержит 5 таблиц и 43 рисунка.