Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Систематика изучаемых родов дрожжей 7
1.1. Saccharomyces 9
1.2. Williopsis, Zygowilliopsis и Komagataea 19
ГЛАВА 2. Распространение и экология дрожжей-аскомицетов в дальневосточной азии 29
2.1. Дальний Восток России 31
2.2. Япония 38
ГЛАВА 3 Экспериментальная часть и обсуждение глава 3. материалы и методы исследования 46
3.1. Объекты исследования, методы выделения и идентификации дрожжей
3.2. Генетический анализ 52
3.3. ПЦР-анализ 53
3.4. Методы генной инженерии 55
ГЛАВА 4. Идентификация дрожжей рода saccharomyces дальнего востока 60
4.1. Фенотипическая характеристика штаммов 60
4.2. Молекулярная дифференциация штаммов 61
4.3. Генетическая идентификация штаммов 63
ГЛАВА 5. Молекулярная дифференциация дрожжей williopsis, zygowilliopsis и комаga таеа 67
5.1. Рестриктазный анализ амплифицированных 5.8S-ITS фрагментов типовых штаммов 67
5.2. Использование ПЦР с неспецифичными праймерами для дифференциации дрожжей комплекса Williopsis sensu stricto 75
5.3. Молекулярный анализ музейных штаммов и новых изолятов 75
5.4. Определение нуклеотидной последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 у штаммов, имеющих уникальные ПЦР-профили с праймером М13 80
ГЛАВА 6. Молекулярно-генетический полиморфизм дрожжей zygowilliopsis california 88
6.1. Рестриктазный анализ амплифицированных ITS-фрагментов 89
6.2. Анализ последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2 и домена D1/D2
26S рДНК у штаммов первой группы 94
6.3. Анализ последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 и домена D1/D2 26S рДНК штаммов IFO 1771, IFO 1880, IFO 1881, IF0 1882HIFO 1767 101
Заключение 105
Выводы 109
Список литературы 110
- Дальний Восток России
- Методы генной инженерии
- Генетическая идентификация штаммов
- Определение нуклеотидной последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 у штаммов, имеющих уникальные ПЦР-профили с праймером М13
Введение к работе
Дрожжевые организмы широко распространены в природе. Большая часть видов или групп видов имеют высокоспециализировапные места обитания. Знание природного местообитания и особенностей экологической ниши способствует более полному пониманию биологии вида, его роли в экосистемах и может быть также использовано в биодиагностических целях и для направленного поиска нужных организмов в природе. В природных экосистемах дрожжи тесно ассоциированы с живыми растениями или их мертвыми остатками, позвоночными и беспозвоночными животными. Везде, где есть высшие растения, мхи или лишайники, есть и сопутствующие им дрожжевые грибы, которые используют эти растения как местообитание и источник пищи.
Природа Дальнего Востока большей частью сохранилась в нетронутом человеческой деятельностью виде. Обладая своеобразной, богатой и эндемичной флорой и фауной, эта территория представляет большой интерес для изучения биоразнообразия дрожжей. В отличие от других регионов мира, территория Дальнего Востока является малоизученной. В России большая часть исследований по таксономическому составу дрожжевых организмов в наземных экосистемах проводилась в европейской части. Однако даже немногочисленные работы свидетельствуют об уникальности видового состава дрожжей Дальнего Востока (Кудрявцев, 1936; Наумов, 1988, 1990а, б; Голубев, 19926; Бабьева, Решетова, 1996 Naumovetal., 1993,1995b).
Эколого-таксономическое изучение дрожжевой микрофлоры Дальнего Востока позволило выявить особенности географического распространения и таксономический состав базгшиомпцетовых дрожжей. Многие виды были ранее обнаружены в Японии и неизвестны из других регионов мира (Голубев, 19926; Бабьева, Решетова, 1996). Особо следует отметить работы по обнаружению и выделению природных популяций дрожжей, обитающих в сокотечениях широколиственных деревьев. Исследования, проводимые на протяжении ряда лет, позволили изолировать и изучить большое количество штаммов дрожжей Saccharomyces из различных географически удаленных друг от друга регионов, включая и Дальневосточную Азию (Naumov et al., 1993, 1996, 1997, 1998; Наумов,
1999). Интенсивное изучение дрожжей Saccharomyces позволило наряду с дикими видами S. cerevisiae и S. paradoxus обнаружить и описать новые виды этого рода в данном регионе (Naumov et ah, 2000b; Наумов и др., 2003).
Дрожжи, образующие сатурновидные споры, имеются в составе разных родов: Williopsis, Saccharomycopsis, Pichia и Saturnispora (Kurtzman, Fell, 1998). Видовой состав этих родов часто пересматривается в результате появления новых критериев, позволяющих оценивать филогенетическое родство. Род Williopsis Zender включает пять видов: Ж californica, Ж mucosa, Ж pratensis, Ж salicorniae и Ж saturnus с пятью разновидностями (van saturnus, van mrakiu van sargentensis, van suaveolens, van subsufficiens). В то же время сравнение последовательностей генов 18S и 26S рРНК выявило значительную дивергенцию дрожжей Ж californica, Ж mucosa, Ж pratensis, Ж salicorniae и Ж saturnus (Liu, Kurtzman, 1991; Yamada et al., 1994, 1995; James et al., 1998). На основании значительных отличий последовательностей рДНК и морфолого-физиологических особенностей был создан новый род Komagataea с видом К. pratensis и восстановлен род Zygowilliopsis Kudriavzev с видом Z californica. Необходимость восстановления последнего рода была ранее обоснована гибридологическим анализом (Наумов, 1980). Согласно гибридологическому анализу, видовой статус имеют дрожжи Ж saturnus, Ж beijerinckiit Ж тгакіі, Ж sargentensis, Ж suaveolens и Ж subsujjficiens (Наумов и др., 1981; Вустин и др., 1982; Вустин, Наумов, 1984; Наумов, 1987).
В современной систематике дрожжей широко используются различные молекулярно-биологнческис методы, позволяющие одновременно изучать большое количество штаммов. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В зависимости от целей исследования можно использовать различные праймеры, позволяющие проводить идентификацию как различных видов, так и отдельных штаммов. В таксономии дрожжей часто применяется сравнительный анализ последовательностей рибосомальных генов, который в отличие от ДНК-ДНК реассоциации, позволяет оценивать родство дрожжей как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях (Kurtzman, Robnett, 1997,1998; Fell et ah, 2000).
Следует отметить, что анализ последовательностей рибосомальных генов раньше применялся на ограниченном количестве штаммов Williopsis и Zygowilliopsis, в основном на типовых культурах.
Цель настоящей работы - молекулярно-генетическое исследование дрожжей родов Saccharomyces, Williopsis и Zygowilliopsis, выделенных на Дальнем Востоке.
Обзор литературы посвящен современным молекулярно-биологическим подходам и методам, используемым в настоящее время в таксономии дрожжевых грибов, систематическому положению изучаемых родов дрожжей, а также экологии и географии дрожжей-аскомицетов Дальневосточной Азии.
Дальний Восток России
В нашей стране исследования эколого-таксономического состава дрожжевых организмов в наземных экосистемах проводились, в основном, в европейской части. На территории Дальнего Востока России, уникального природного объекта с неповторимым сочетанием зональных и экзотических ландшафтов, эндемичными и реликтовыми видами растений и животных эта группа микроскопических грибов мало изучена. Несмотря на то, что первые исследования, связанные с поиском рас, пригодных для местного виноделия, относятся еще к 30-м годам прошлого века (Кудрявцев и др., 1936; Кудрявцев, 1954), имеющиеся сведения о дрожжевых комплексах являются отрывочными. Авторы исследовали ягоды диких растений и спонтанно сброженные соки. В результате были обнаружены дрожжи родов Issatchenkia, Pichia и Saccharomyces в соке, а на ягодах Hanseniaspora iwarum и Metschnikowia pulcherrima.
Очень хорошим местом выделения дрожжей являются цветки и особенно их нектарники, содержащие сахара, необходимые для размножения дрожжей. Так как плоды развиваются из цветочных завязей, то цветки можно рассматривать как один из первоначальных источников заражения плодов дрожжами (Бабьева, Горин, 1973). Действительно, из цветков энтомофильных растений всегда выделяются дрожжи, среди которых можно обнаружить как типичные эпифитные виды (фитобиоиты) базидиомицетового аффинитета, постоянно присутствующие и на других частях растений, так и представителей сахаробионтных дрожжей. Было показано, что на цветках присутствуют аскомицетовые дрожжи Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia reukaufii, виды Hanseniaspora, а также базидиомицетовые дрожжи Rhodotorula (Etchells ct al., 1953). Бродящие аскомицетовые дрожжи, обнаруживаемые в цветочном нектаре, весьма разнообразны и представлены родами Candida, Pichia, Hanseniaspora Debaryomyces и др. К наиболее часто выделяемым с цветков видам относятся М. pulcherrima и М. reukaufii (Phaff, Starmer, 1987; Babjeva, Chernov, 1995; Babjeva, Reshetova, 1998). Эти виды характерны для сладких сочных плодов. Например, М. pulcherrima часто обнаруживается на яблоках (Davenport, 1976).
Анализ нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК изолятов дрожжей, ассоциированных с цветками, позволил обнаружить десять новых видов родов Wickerhamiella, Candida, Kodamaea, Pichia в Бразилии, Австралии и на Гавайских островах. (Lachancc et al., 1998а, 1998b, 2001; Rosa, Lachance, 1998 ; Rosa ct al., 1999; Phaff et al., 1999). Также был описан новый род Starmerella Rosa & Lachance с единственным видом S. bombicola, который, по-видимому, является телеоморфой Candida bombicola.
На Дальнем Востоке из цветков (Vicia crassa L.) выделен уникальный штамм дрожжей нового вида Metschnikowia lunata Golubev (Golubev, 1977). Распространение и развитие дрожжей в природе тесно связано с жизнедеятельностью насекомых, играющих в этом значительную роль. Связь дрожжевых организмов с насекомыми является результатом пищевой значимости микроорганизмов в жизненном цикле многих видов насекомых (Phaff et al., 1966; Byzov et al., 1993a, b). Также с насекомыми связано еще одно специфическое местообитание дрожжей - муравейники. В гнездах муравьев из рода Formica формируются характерные дрожжевые популяции, среди которых доминируют представители рода Debaryomyces (Голубев, Бабьева, 1972; Golubev, Bab eva, 1972;Бабьеваидр„ 1975).
Исследование видового состава дрожжей медоносной пчелы (Apis mellifera L.), проведенное на материале, собранном в Новосибирской области и Приморском крае, показало, что дрожжевая флора пчелиной семьи состоит из специфических видов, приспособленных к обитанию в данной среде и составляющих характерный биоценоз. Это преимущественно дрожжи родов Candida, Torulopsis, Hansenula, Debaryomyces. Наиболее разнообразен род Candida, некоторые виды которого встречаются исключительно в кишечнике пчел. Исследование микрофлоры цветков насекомоопыляемых растений (сирени амурской, красного клевера, желтой акации, рябинолистника, гречихи и др.) показало, что большинство выделенных дрожжей относятся к видам М. pulcherrima и М. reukaufii - типичным представителям нектарных дрожжей (Егорова, Бабьева, 1967).
В рассматриваемых ареалах имеется еще один источник выделения дрожжей, отличающихся по видовому составу от дрожжей других субстратов. Довольно специфическим местообитанием дрожжей является буровая мука жуков -стволовых вредителей в лесах Приамурья. Данная группа дрожжей представлена видами родов Pichia, Hansenula, Ambrosiozyma, которые не встречаются в других местах и играют определенную роль в питании ксилофагов (Бибикова и др., 1987; 1990; Густел ева, Исаева, 1982).
Наиболее богатым источником выделения дрожжей, в том числе и представляющих биотехнологическую ценность, является филлосфера растений. Исследования дрожжевой микрофлоры в самом южном в Приморском крае лесном заповеднике «Кедровая падь», расположенном на западном берегу Амурского залива в Хасанском районе показали, что преобладающими в филлосфере заповедника являются базидиомицетовые дрожжи родов Cryptococcus и Rhodotorula, реже виды Candida, Kluyveromyces, Metshnikowia (Голубев, 19926). Многие из этих видов были ранее обнаружены в Японии и неизвестны из других регионов мира. Обнаруженные виды Rh. mucilaginosa, Cr. aerius, Cr. albidus, Cr. laurentii, Tr. pullulans известны как активные продуценты внеклеточных полисахаридов, липидов, ряда ферментов. Также выявлены изоляты дрожжей О. humicolus и Rh. mucilaginosa, обладающие киллерной активностью. Продуцируемые ими микоцины могут представлять интерес в качестве антигрибковых агентов. Надо отметить, что описанный видовой состав эпифитной дрожжевой микрофлоры Дальнего Востока имеет сходство с дрожжевой флорой Японии (Phaffctal., 1972; Naumovetal., 1993, 1995b). Всестороннее исследование эколого-таксономического состава дрожжевых грибов Дальневосточного региона было проведено сотрудниками Московского университета в 80-е - 90-е годы XX века. Многолетний анализ образцов почв и других природных субстратов в отдельных регионах, начиная с севера и на юг: п-ов Чукотка, Камчатка, о. Сахалин, Приморский и Хабаровский края, позволил выявить особенности географического распространения дрожжей (Babjeva, Chernov, 1995). На севере, в тундровой зоне (Чукотка, горная Камчатка) дрожжи представлены исключительно видами базидиомицетового аффинитета, среди которых значительную долю составляют облигатные психрофилы. Надо отметить, что в болотных почвах Хабаровского края комплекс дрожжевых грибов характеризуется большим разнообразием и наличием специфичных для болот видов. В частности, в одном из образцов обнаружена популяция дрожжей с сатурновидными спорами - Williopsis beijerinckii, редкие случаи выделения которых были известны только из почв южного полушария (Бабьева, Решетова, 1996). На основании гибридологического изучения ряда штаммов таксономического вида Williopsis saturmis (Klocker) Zender был выявлен штамм КБП 2708, выделенный из заболоченной почвы поймы реки, но в Приморском крае (Вустин, Бабьева, 1981). Данный штамм был сходен с типовой культурой W. saturnus по фенотипу, но генетически отличался от нее и, по-видимому, представляет собой новый таксон в роде Williopsis (Вустин и др., 1982). К сожалению, данный штамм был утерян и его дальнейшее изучение с использованием молекулярно-геиетических методов не представляется возможным. Аскоспоровые дрожжи Hanseniaspora uvarum, обнаруженные ранее В.И. Кудрявцевым (1936) на ягодах диких растений Дальнего Востока, были выделены с ягод актинидий и лимонника, a Pichia onychis - из раневого повреждения вяза мелколиственного на территории г. Хабаровска. Всего на территории Дальнего Востока было обнаружено 45 видов дрожжей, шесть из которых выявлены на территории России впервые (Бабьева, Решетова, 1996).
Исследования по естественному разнообразию дрожжевых сообществ в зависимости от места обитания, типа субстрата и других экологических факторов, получили широкое распространение, особенно в нашей стране. Использование эколого-географических и систематических подходов в изучении биоразнообразия дрожжевых организмов имеет большое значение для понимания процессов формирования, развития дрожжевых сообществ и закономерностей распространения их в природе. В этой связи следует отметить исследования по обнаружению и выделению природных популяций дрожжей, обитающих в сокотечениях широколиственных деревьев.
Молекулярно-генетические методы широко используются для изучения географического распространения и происхождения культурных и диких дрожжей Saccharomyces. Дрожжи, относящиеся к биологическому виду Saccharomyces cerevisiae, включают, в основном, культурные формы, но также известны и их дикие популяции (Naumov, 1996). Родственный ему дикий вид S. paradoxus распространен во многих частях света и преимущественно обитает в сокотечениях широколиственных деревьев, а также встречается в почве (Capriotti, 1955; Yoneyama, 1957; Jensen, 1967; Наумов, 1979а, 1986; Naumov et al., 1992a; Sniegovvski et al., 2002).
Методы генной инженерии
Клонирование. С целью очистки необходимых ПЦР-продуктов их подвергали электрофорезу в агарозном геле, приготовленном на ІхТАЕ буфере (50хТАЕ: трис, ледяная уксусная кислота, 0.5 М ЭДТА, рН 8.0). На трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете вырезали нужные участки геля, содержащие фрагменты ДНК необходимой молекулярной массы с их дальнейшим элюированием из геля при помощи набора "GeneClean Kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США) и затем встраивали по тупым концам в вектор pTZ57R/T, линеаризованный по сайту ЕсоЗИ (изошизомер EcoKV). Компетентные клетки Е. coli штамма TGI (Martin et al., 1987) трансформировали с использованием набора "InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit" согласно протоколу фирмы-изготовителя (MBI Fermentas, Литва). Трансформанты со вставкой отбирали на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампицилина, субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-D-галактопиранозид) и индуктор ИПТГ (изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид).
При отборе трансформированных клеток руководствовались следующими соображениями. Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду pTZ57R/T, выращивать в присутствие ИПТГ, который является индуктором lac-оперона, то продукт гена lad не сможет связываться с промоторно-операторной областью гена lacZ и, как следствие, будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена lacZ . Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК, н в результате образуется активная р-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ так, что она не влияет на продукцию функциональной р-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат X-gal, то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продуктов синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную плазмиду pTZ57R/T.
Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для р-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствие ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную плазмиду, образуют на той же самой среде белые колонии, поскольку обычно при встраивании в полилинкер чужеродной ДНК происходит прерывание кодирующей последовательности гена lacZ\ LacZ не синтезируется и соответственно активная гибридная р-галактозидаза не образуется. В отсутствие активной р-галактозидазы клеточные колонии не превращают содержащий в питательной среде субстрат в вещество синего цвета и остаются белыми. Далее проводят скрининг белых (положительных) колоний и последующую идентификацию тех из них, которые содержат искомую последовательность ДНК (Глик, Пастернак, 2002).
Выделение плазмидной ДНК из E.coli (Щелочнойметод).
В основе метода лежит то, что в щелочных условиях (при рН - 12) происходит денатурация только линейных молекул ДНК, плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют. При нейтрализации клеточного экстракта в присутствие солей высокой концентрации денатурированная хромосомная ДНК выпадает в осадок, поскольку реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве участков с образованием нерастворимых комплексов. Клеточная РНК и белки тоже осаждаются вследствие того, что при осаждении используется детергент ДСН (SDS, додецилсульфатнатрия).
Методика
Культуру Е. coli (полученную в результате эксперимента по трансформации и ранее расштрихованную на чашке) вносят в пробирку с 2 мл LB-среды, содержащей антибиотик (ампицнлин). Культивируют бактериальную культуру при интенсивном встряхивании (200 об/мин) при 37С в течении ночи. После инкубации переносят 1.5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку и собирают клетки центрифугированием при 12000 g в течение 2-3 мин. Супернатант удаляют и при интенсивном встряхивании ресуспендируют осадок бактериальных клеток в 120 мкл холодного буфер 1, далее добавляют 240 мкл буфер 2 и осторожно смешивают переворачиванием пробирки. Добавляют 180 мкл буфера 3 и перемешивают содержимое осторожным встряхиванием в течение 10 с. Инкубируют во льду 30-60 мин. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 g в течение 15 мин. Вносят 500 мкл р-ра хлороформа-изо-амилового спирта (24:1). Центрифугируют при 12000 g еще 10 мин. Осторожно отбирают верхнюю водную фракцию в новую стерильную микроцентрифужную пробирку. Вносят равный объем 9М LiCl и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин до появления мути. Центрифугируют при 12000 g 10 мин. Отбирают супернатант в новую центрифужную пробирку. Вносят 0.6-1.0 объем изопропанола (комнатной температуры). Осторожно перемешивают содержимое пробирки и инкубируют при комнатной температуре 60 мин. Центрифугируют при 12000 g 10 мин. Сливают надосадочную жидкость. Вносят 500 мкл 70% охлажденного этанола и центрифугируют при 12000 g в течение 5 мин. Осторожно отбирают супернатант и высушивают осадок нуклеиновых кислот на воздухе в течение 30-40 мин. Растворяют нуклеиновые кислоты в 50 мкл ТЕ-буфера с РНКзой рН 8.0 и хранят при - 20 С (Стикланд, 1999). Буфер 1: 40% глюкоза - 230 мкл 1МТрис-250 мкл 0.5МЭДТА-200мкл Довести до 10 мл дистиллированной водой. Буфер 2: 0.2N NaOH 1% SDS
На 1 мл р-ра брать: IN NaOH-200 мкл 10% SDS-100 мкл Дистиллированная вода - 700 мкл. Буфер 3: ЗМ ацетат калия. 5М Кае - 60 мл ЛУК-11,5 мл Н20-28,5мл (Все растворы перед использованием стерилизовали). Секвенирование. Нуклеотидные последовательности
Генетическая идентификация штаммов
Для генетического изучения прежде всего необходимо было иметь высокофертильные моноспоровые культуры дрожжей. Анализ 6-10 тетрад показал, что изолированные нами дальневосточные штаммы гомоталличны и имеют высокую жизнеспособность аскоспор (89-100%). Молекулярная дифференциация дрожжей позволила избежать лишних скрещиваний. У каждого штамма мы проанализировали гибрид с тест-культурой подозреваемого вида и только одно контрольное скрещивание с тестером & paradoxus или S. cerevisiae. Способность скрещиваться анализируемых дрожжей с тест-штаммами биологических видов S. cerevisiae, S. paradoxus, S. bayanus подтвердила их принадлежность к роду Saccharomyces (табл. 5). Высокая жизнеспособность мейотических продуктов (аскоспор) гибридов и регулярное мейотическое расщепление контрольных маркеров ade или ига свидетельствовали о гомологии генетического материала и принадлежности родителей к одному биологическому виду, тогда как стерильность гибридов указывала на межвидовые различия геномов. На этом основании, мы окончательно отнесли штаммы 3.00, 22.00, 159.01 и 163.01 к виду S. cerevisiae, штамм 61.02 к виду S. paradoxus, а штаммы 136.01 и 148.01 к виду S. bayanus (табл. 2).
Генетическое изучение северо-корейских штаммов CCY 21-4-89 и CCY 21-4-93 затруднялось низкой выживаемостью их аскоспор и гетерогенным меиотическим расщеплением по скорости роста колоний (включая дыхательно-недостаточные микроколонии). Микроскопирование моноспоровых культур показало наличие в них специфических агрегатов гаплоидных клеток. По образованию зигот в смесях с клетками половых тестеров (S288C и Х2180-1А) у моноспоровых клонов были определены типы спаривания. У штаммов CCY 21-4-89 и CCY 21-4-93 наблюдали соответственно мейотические расщепления 2a:2a:3D и 5а:За:Ш, где а и а -гаплоидные дрожжи одноименного типа спаривания, D - диплоидные спорулирующие дрожжи. Следующим этапом был отбор фертильных моноспоровых гаплоидных клонов. Для этой цели были получены и проанализированы их гибриды с генетическими линиями S. cerevisiae S288C и Х2180-1А (табл. 6). Хотя большинство гибридов были высокофертильны, но почти все они, как и исходные родительские штаммы, обладали гетерогенным расщеплением по скорости роста колоний. Исходя из последнего признака, мы отобрали для дальнейшего изучения две лучшие моноспоровые культуры 21-4-89:7А и 21-4-93:6В. Их гибриды со штаммом S288C имели во всех десяти проанализированных тетрадах регулярное расщепление 2:2 по контрольному маркеру gall. Гибрид штамма 21-4-89:7А также имел моногенное расщепление по маркеру таї. Однако другой штамм, 21-4-93:6В, очевидно обладал большим количеством полимерных генов MAL. В тетрадах его гибрида наблюдалось расщепление 4Ма1+:0МаГ (8), ЗМаҐ:1МаГ (2). В скобках приводится количество тетрад. Данные гибридизационного анализа позволяют однозначно считать, что оба северо-корейских штамма относятся к виду S. cerevisiae.
Необходимо отметить, что аскомицетные дрожжи Дальнего Востока России (Бабьева, Решетова, 1996), в отличие от Японии (Kodama, 1974; Banno, 1975; Banno, Mikata, 1981), изучены явно недостаточно. Это относится, в том числе, к дрожжам рода Saccharomyces. К сожалению, эколого-географическое изучение японских дрожжей Saccharomyces проведено до того, как были обнаружены виды-двойники S. cerevisiae. Позднее было реидентифицировано шесть диких японских штаммов Saccharomyces; четыре штамма отнесли к виду S. cerevisiae, два штамма к S. paradoxus и, как уже отмечалось, по два штамма были описаны как новые виды S. kudriavzevii и S. mikatae (Naumov et al., 2000b). Ранее уже было идентифицировано 17 диких штаммов Saccharomyces, из них 5 были вида S. cerevisiae и 12 штаммов S. paradoxus (Naumov et al., 1993; Наумов, 1988). Кроме того, из ближайших к Дальнему Востоку репюнов идентифицировано три диких штамма S. cerevisiae в Сибири и один в Средней Азии (Наумов, Наумова, 1991).
Привлечение в нашей работе дальневосточных штаммов разнообразного происхождения позволило, наряду с дикими дрожжами S. cerevisiae и S. paradoxus, обнаружить новый вид для этого региона - S. bayanus.
Определение нуклеотидной последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 у штаммов, имеющих уникальные ПЦР-профили с праймером М13
S. James et al. (1998) показали, что виды-двойники W. saturnus, W. mrakii, W. sargentensis, W. suaveoiens и IV. subsujjiciens имеют идентичные последовательности 18S pPHK, но отличаются последовательностями ITS1 и ITS2. Следует отметить, что авторы вместо типовой культуры W. saturnus использовали штамм CBS 5761 и не включили в свое исследование дрожжи IV. beijerinckii.
Мы провели секвенирование участков ITS1 и ITS2 рДНК у типовой культуры W. saturnus CBS 254 и двух штаммов W. beijerinckii, а именно у типовой культуры CBS 2564 и штамма CBS 2876. Секвенированию были также подвергнуты три штамма, имеющие уникальные ПЦР-профили с праймером М13: CBS 6291, CBS 1669 и IFO 1776. Полученные нуклеотидные последовательности сравнили с имеющимися ITS1 и ITS2 последовательностями дрожжей Williopsis sensu stricto (рис. 16А, В и рис. 17). Типовая культура W. saturnus CBS 254 имеет идентичные ITS1 и ITS2 последовательности с двумя ранее изученными штаммами этого вида CBS 5761 и NCYC 23. Штаммы W. beijerinckii неотличимы по последовательностям ITS1 и ITS2 от типовой культуры W. suaveoiens.
На рисунке 18 представлен суммарный анализ количества нуклеотидных замен в районах ITS1 и ITS2 рДНК у штаммов Williopsis sensu stricto. В целом, анализ ITS-последовательностей свидетельствует о близком родстве изученных штаммов. Штаммы одного вида имеют идентичные последовательности ITS1 и ITS2. Большие отличия обнаружены по участку ITS2, по сравнению с ITS1. Виды W. saturnus, W. suaveolens, W. beijerinckii и штаммы IFO 1776, CBS 1669 имеют идентичные последовательности ITS1. Типовая культура W. subsufficiens CBS 5763 и штамм CBS 6291 также неотличимы друг от друга по этому участку. Только W. mrakii и W. sargentensis имеют видоспецифичные последовательности ITS1, отличающиеся от других штаммов двумя и более нуклеотидными заменами (рис. 18А).
По участку ITS2 пять из шести видов-двойников Williopsis sensu stricto имеют видоспецифичные последовательности. Только два вида W. suaveolens и W. beijerinckii имеют идентичные 1Т82-последовательности. Штаммы IFO 1776 и CBS 1669, имеющие идентичные последовательности ITS1, отличаются по четырем нуклеотидам в районе ITS2 (рис. 18В). Штамм CBS 6291 отличается от W. subsufficiens и других изученных штаммов тремя и более нуклеотидными заменами.
Таким образом, с помощью ПЦР-анализа переопределено три штамма из японской коллекции IFO как W. saturnus (IFO 0809) и W. beijerinckii (IFO 0895 и IFO 0896). Первый штамм был ранее отнесен к W. suaveolens, а два других - к W. mrakii (табл. 3). Три штамма с сатурновиднымп спорами, изолированные нами на Дальнем Востоке отнесены к W. suaveolens. Штаммы CBS 1669, CBS 6291 и IFO 1776, обладающие уникальными ПЦР-профилями и отличающиеся от других штаммов по последовательностям ITS1 и ITS2, вероятно представляют собой новые таксоны. Для уточнения таксономического статуса последних штаммов необходимо проведение гибридологического анализа.
Мы сравнили результаты, полученные в настоящем исследовании, и литературные данные по секвенированию участков ITS1 и ITS2, района D1/D2 26S рДНК и ДНК-ДНК реассоциации видов-двойников Williopsis sensu stricto (рис. 18 и 19). Сопоставление различных молекулярных подходов выявило их противоречивость. Несмотря на значительную дивергенцию геномов по данным ДНК-ДНК реассоциации, виды Williopsis sensu stricto имеют сходные последовательности участков D1/D2 26S рДНК и ITS1, ITS2. W. subsufficiens и W. mrakii, имеющие 44%-ную ДНК-ДНК реассоциацию, отличаются 4-5 нуклеотидными заменами в исследованных районах рДНК. Такой же уровень ДНК-ДНК реассоциации (43%) отмечен в комбинации видов W. saturnus и W. sargentensis. Однако эти виды имеют идентичные последовательности D1/D2. Принято считать, что штаммы разных видов отличаются более чем тремя нуклеотидами в участке D1/D2 26S рДНК (Kurtzman, Robnett, 1998). W. mrakii, имеющий соответственно 52% и 68%-ную ДНК-ДНК реассоциацию с W. saturnus и W. sargentensis, отличается от первого вида только одной, а от второго пятью нуклеотидными заменами в районе ITS2. В обоих случаях отмечена только одна нуклеотидная замена в районе D1/D2 26S рДНК. Следует отметить, что W. beijerinckii, включенный в последнем определителе дрожжей (Kurtzman, Fell, 1998) в синонимы W. saturnus, также отличается от него одной пуклеотидной заменой в районе D1/D2. По результатам генетического анализа межвидовые гибриды дрожжей Williopsis sensu stricto во всех комбинациях стерильны, что свидетельствует об их одинаковом видовом статусе (Наумов, 1987). На примере дрожжей Williopsis sensu stricto видна необходимость одновременного использования нескольких молекулярных подходов в сочетании с генетическим анализом для идентификации и классификации дрожжей.
