Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Клональное микроразмножение растений Эпигенетическая и генетическая изменчивость растений, размножаемых методом in vitro
1. Эпигенетическая изменчивость
2. Генетическая изменчивость
Закономерности органогенеза клубнелуковичных геофиюв.
Особенности развития гладиолуса садового (Gladiolus hybridus hort.
Разработка способов микроклоиалыюго размножения гладиолуса
Материал и методы исследования
Растительный материал
Изучение биологической активности паклобутразола
Масс-клональное размножение гладиолуса
Выгонка гладиолусов в теплице
Методы цитологических исследований
Методика оценки морфологических и количественных признаков
Методы статистического анализа
Результаты и обсуждение
Влияние паклобутразола на развитие проросших семян лука-батуна
Микроклоналыюе размножение растений гладиолуса 1. Определение скорости развития апикальных почек различных
сортов гладиолуса на агаризованной среде
3.2.2. Изучение влияния паклобуїразола на развитие культуры гладиолуса в жидкой питательно» среде
3.2.3. Влияние отношения объем среды/число экснлантов и паклобутразола па динамику развития культуры гадиолуса 54
3.2.4. Получение клубнелуковиц гладиолуса 63
3.2.5. Влияние ПАБК на образование клубнелуковиц гладиолуса 66
Обсуждение
4. Цитогенетическии анализ растений-регенерантов гладиолуса сортов Закат и Сомбреро 80
Обсуждение
5. Изучение морфологических и количественных признаков растсннй-рсгенсраіггов гладиолуса гибридного сортов Закат и Сомбреро в SCI, SC2 и SC3
Обсуждение
Заключение 95
Практические рекомендации 98
Выводы "
Список литературы 10-
- Эпигенетическая изменчивость
- Закономерности органогенеза клубнелуковичных геофиюв.
- Методы цитологических исследований
- Влияние отношения объем среды/число экснлантов и паклобутразола па динамику развития культуры гадиолуса
Введение к работе
Превращение цветоводства в важную отрасль растениеводства ставит ряд проблем, таких как повышение коэффициента размножения и оздоровление посадочного материала. Решение этих проблем возможно с помощью микроклонального размножения растений, т.е,. использования техники in vitro для быстрого неполового получения растений, идентичных исходному.
Гладиолус - одна из наиболее популярных традиционных срезочных культур открытого грунта. Высокая экологическая пластичность гладиолуса позволяет выращивать его почти повсеместно, за исключением самых северных районов.
Современные культурные гладиолусы, объединяемые в культурный вид Gladiolus х hybridus hort. Представляет широчайшую гамму окрасок от белых, розовых, желтых до красных, черно-красных, сиреневых, фиолетовых, зеленых, каштановых. Общее число существующих сортов трудно обозримо «достигает по некоторым данным 30 тысяч (Матвеева, 1980).
В 1970 г. впервые опубликовано сообщение о методе размножения рода Gladiolus через культуру in vitro (Zir et' al, 1970). Техника микроклонирования сокращает продолжительность развития в несколько раз по сравнению с жизненным циклом гладиолуса в естественных условиях, а коэффициент размножения повышает на порядки. К настоящему времени разработаны несколько технологий потенциально коммерческого назначения
(Румынии и др., 1990; Hussey, 1977, 1982; Raamsdonk, Vries, 1989; ziv et al., B83).
Однако микроклонирование гладиолуса остается еще сравнительно продолжительной, сложной и дорогоетоющей процедурой. По некоторым оценкам, 70-80% себестоимости конечной продукции составляет затраты на оплату ручных манипуляций (Ziv, 1989). Несмотря на то, что методы микроклонирования гладиолуса уже включают в систему технологий, агропромышленной ориентации (Lilien-Kipris, Kochba, 1987), повышение конкурентноспособности продукции, полученной методом in vitro, остается актуальной задачей.
В связи с этим представляет большой интерес изучение явления сомаклональной изменчивости у растений Gladiolus х hybridus hort. , возникающее при культивировании изолированных клеток, тканей и органов in vitro и регенераціш растений. Следует отметить, что для растений Gladiolus сомаклональная изменчивость не изучалась. Широкий спектр фенотшшческих и генетических изменений обнаружен у растений-регенерантов многих видов, в частности,, у представителей. семейств Liliaceae, Iridiaceae и Amaryllidaceae (Malnassy, Ellison, 1970; Yang, 1977; Fitter, Krikorian, 1985; 1986; Hussey, 1983; Krikorian, Kann, 1979b; 1980; Krikorian et al., 1981; 1982; 1986a; 1986b; Sheridan, 1974; 1975;Bennici, 1979; Yamabe, Yamata, 1973; Orihara, 1981; 1982; Riley et al., 1967; Novak, 1980; 1974; 1981; Novak et al., 1982; Verma, mittal, 1979; Yamare, 1975; Sekerka, 1977; Roy, 1980; Stewart, 1978). Таким образом, генетическая природа и
б
механизмы возникновения сомаклональнон изменчивости
широко изучались для многих растений. Однако для управления
сомаклоналыюй вариабельностью для калодого вида важно понять ее
причины и размах. Сомаклональную вариабельность желательно свести к
минимуму, когда целью служит получение однородного материала. В то же
время при требовании дополнительной генетической изменчивости степень
вариабельности необходимо усилить.
Цель настоящей работы - 1. Изучение стабильности и изменчивости
полученных in vitro растений-регенерантов Gladiolus х hybridus hort. 2.
Создание высокоэффективной системы получения генетически стабильных
растений гладиолуса путем микроклоналыюго размножения. В соответствии
с этим, были поставлены следующие задачи:
- Оптимизация условий культивирования для микроклоналыюго размножения гладиолуса гибридного;
- Изучение влияния паклобутразола (ретарданта на пролиферацию побегов и почек в культурнім vitro гладиолуса.
- Изучение- морфологических и количественных признаков растений-регенерантов гладиолуса.
- Цитогенетический анализ растений гладиолуса, полученных цутм микроклоналыюго размножения;
Эпигенетическая изменчивость
Регенеранты, образованные in vitro, после высадки в грунт могут преодолеть влияние условий культивирования на их последующий рост. Небольшое число первичных листьев может иметь неправильную форму или слишком увядать.
При повреждении апикальной части нарушения могут быть более долговременными. Так, при микроклоналыюм размножении земляники в течение 2-х лет после высадки в грунт наблюдали увеличение числа розеток и нарушение во взаимном расположении листьев, в результате чего растения выглядели низкорослыми и ветвистыми (Anderson et al., 1982).
После удаления стеблевого апекса обнаруживали множество точек роста, расположенных линейно или случайно по окружности. Явление усиливалось при повышении концентрации БАЛ, но подавлялось гиббереллином. Авторы пришли к заключению, что этих нарушений можно избежать, используя соответствующие концентрации гормонов и сохраняя при этом достаточно высокие скорости размножения.
Спонтанные мутации неизбежно происходят во всех культурных растениях. Однако, в культуральной пробирке мутантные побеги могут остаться неузнанными, и могут быть выявлены, лишь после того как побег посажен в грунт и выращен. Чем раньше в процессе нарастания культуральной массы произойдет мутация, тем выше будет содержание мутантных побегов.
Влияние мутации при микроклональном размножении не сводится к простому вопросу о количестве таких размноженных растений; гораздо важнее вопрос о том, какой метод использован. Опыт как экспериментальной, так и практической работы показывает, что генетически наиболее стабильны организованные меристемы; наиболее часто мутации возникают при размножении преждевременно сформировавшихся пазушных побегов. Пазушные меристематические ткани возникают на боковых поверхностях стеблевого апекса и включают в себя несколько дискретных слоев ткани: один или более слоев туники и корпус. Мутация представляет собой событие, произошедшее в одной клетке. 1С летка, содержащая спотаиную или индуцированную мутацию, может делиться, образуя лишь ограниченный участок ткани внутри одного слоя, что приводит к образованию химеры, которая обычно оказывается нестабильной и быстро погибает (Ben-Jaacov, Langhans, 1972; Vajrabhaya, 1977; Sutter, Langhans, 1981; Evans et al., 1986).
Добавочная меристематическая ткань в отличие от пазушной предрасположена к мутагенезу, поскольку обычно возникает из одиночной клетки или небольшой группы клеток. Таким образом, можно получить полностью мутантные побеги, а не химеры (Broertjes, Marten, 1978).
Мутации в тотипотентных клетках могут быть увеличены в результате возможного мутагенного действия веществ, присуствующих в питательной среде, таких как МУК, 2,4-Д или БАП, однако убедительных данных о прямом мутагенном действии этих веществ, не получено. Наиболее вероятным источником генетической вариабельности могут быть изменения, происходящие при дифференцировке и особенно при полиплоидии, которая возникает у 90% видов растений (D Amato, 1977). Изменчивость среди растений, регенерированных in vitro из соматических клеток, бывает весьма заметна (Skirvin, 1978). Внутренние механизмы ее возникновения пока слабо выяснены, очевидно, что генетические изменения в тканях растений происходят часто, но проявляются лишь после регенерации, проводимой in vitro. Возникающая естественным образом добавочная регенерация и регенерация, широко используемая при обычном черенковании, происходят из ткани, которая обычно не является полисоматической, например, из эпидермиса или определенных участков флоэмной паренхимы.
Закономерности органогенеза клубнелуковичных геофиюв.
Клубнелуковичиые геофиты представляют собой своеобразную жизненную форму многолетних растений. Луковичные и клубнелуковичиые геофиты сосредоточены в семействах Liliaceae, Iridaceae, Amaryllidaceae.
Клубнелуковичиые растеїшя состоят из надземного побега, развивающегося из почки в течешіе одного вегетативного периода и полностью отмирающего к концу его, и специального подземного образования - клубнелуковицы. Клубнелуковица состоит из видоизмененных элементов возобновления (листьев, стебля). Они постепенно замещаются новыми такими же органами последующих побегов, истощаются, отмирают и отторгаются (Ржанова, Тихонова, 1976).
Подземная часть растения несет на себе корневую систему и почки возобновления, обеспечивающие продолжение жизни многолетнего растения в последующие вегетационные периоды. У гладиолуса часть почек возобновления мстаморфирована в специальные органы вегетативного размножения, в клубнепочки - "детки".
Подземная часть растения обладает запасом питательных веществ, необходимым для обеспечения жизнедеятельности почек возобновления в период локоя и начальный период роста и развития побега из них. У клубнелуковичиых растений запасные вещества откладываются в клубнелуковице, образованной укороченными, утолщенными междоузлиями стебля между носовыми листьями. Число междоузлий у гладиолуса составляет 4-5 (Непорожный, 1950; Андреева, 1971).
Отмершие элементы (истощенные старые клубнелуковицы) утрачивают всякое значение для дальнейшей жизнедеятельности растения, а замещающие их новые такие же органы формируют самостоятельную корневую систему. Поскольку возобновление у многих растений осуществляется не одним, а несколькими побегами, то каждый из них, приобретая собственную корневую систему, превращается в отдельную особь. Таким образом, возобновление часто сопровождается естественным вегетативным размножением. В результате выросшее из семени растение в течение нескольких лет превращается в клон (см. Рис. 1) (Сысина, 1953; Седова, 1968; Андреева, 1971; Васильева и др., 1978; Кукушкин, 1984). К клубнелуковичным геофитам, как растениям многолетним, применимо понятие большого и малого жизненных циклов. Ьольиюй цикл -жизнь растения от пророс і ка до полного отмирания всех наземных и подземных частсіі растения без замены их новыми. D органогенезе лих растении малый цикл - жизнь отдельного побега возобновления. Именно он является слагающей единицей большого цикла (Андреева, 198 1).
Из всего малого цикла, длительность жизни подземной части побега является признаком, наиболее различающимся у разных видов. У гладиолуса после окончания вегетации подземная часть побега - клубнелуковица существует еще год, постепенно истощаясь но мерс развития на пей нового побега. Малый цикл у гладиолуса составляет 2,5 года (Игнатьева, 1973; Андреева, 1977; Андреева, 1964).
Поскольку наземный побег сменяется ежегодно, то естественно, что, чем длительнее Малый цикл, тем большее число последовательных побегов (или их элементов), находящихся в разных фазах цикла, составляет растение ("накапливается" на растении). Так, у гладиолуса растение представлено двумя генерациями - осенью (клубнелуковица - подземная часть предыдущего побега, почка на ней - внутрипочечная фаза следующего побега) и тремя летом (отмирающая клубнелуковица - подземная часть побега прошлого года, новая клубнелуковица с надземным побегом - побег текущего года, почка возобновления на новой клубнелуковице -внутрипочечная фаза следующего года) (Игнатьева, 1973; Андреева, 1980).
Методы цитологических исследований
Предварительные исследования показали, что величина проростка, вводимого в жидкую среду влияет на динамику развития почек, особенно на время инициации боковой почки. Поэтому возникает проблема получения синхронизированной по росту популяции проростков. С этой целью были изучены темпы развития почек на агаризованнои среде. На 7-й день культивирования на агаризованнои среде, содержащей 10,0jiM л\\ БАП и 0,54 цМ НУК частота проростання почек сортов "Сомбреро", "Закат", "Колокола", "Гранд" и "Анфиса" составляла 75,0±1,4; 46,0±1,7;32,0±0,8; 16,0±0,8; 16,0±0.5, соответственно.
При продолжении культивирования на агаризованной среде, содержащей 10,0 дМ БЛП, индуцировалось образование боковых почек у основания побегов. Частота пролиферации боковой почки установлена для сортов "Закат", "Сомбреро", "Колокола" и составляла 50,0±1,3; 37,0±1,8; 36,0±0,9, соответственно. При культивировании апикальных почек сорта "Закат" на агаризованной среде, содержащей 0,54 U.M НУК, у основания побегов боковые почки не образовывались. Наблюдения проводились в течение 3-х месяцев культивирования. Предполагается, что инициация образования боковой почки стимулируется 6-БАП.
Все последующие эксперименты поставлены с сортами "Закат" и «Сомбреро», как оптимальным по частоте развития эксплантов (апикальных почек) на агаризованной среде.
Нами было изучено влияние паклобутразола, в концентрациях 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 17,5; 25,0 мг/л, на число индуцированных побегов, боковых почек, среднюю длину листа и величину боковых почек (см. Табл.2, Граф.2). Оценку вышеуказанных параметров проводили на 6-й неделе культивирования, при субкультивировании объектов из жидкой среды на агаризованную. Условия культивирования экслантов (апикальных почек) в жидкой среде были аналогичны условиям в работе Ziv (1989), с расчетом на один эксплант 3 мл питательной среды.
Стерильные экспланты (проросшие апикальные почки), субкультивированные из агаризованной среды в жидкую, пролиферировали и увеличивались в размере (см. Рис. 7). В присутствии БАП и НУК на каждом экспланте развивались по 2-3 побега, каждый побег имел 3-4 удлиненные стекловидные листья. На 4-й день культивирования наблюдалась индукция образования боковой ночки. На 7-й день культуры отмечено нроростание боковой почки. В контрольном варианте, в отсутствии паклобутразола, листья были тт , „НЕДЕЛЕ мясистые и продолжали удлиняться. На 6-й . . культивирования средняя длина листа достигала » 15 см (см. Табл.2, Граф.2). В таблице 2 показано, что иаклобутразол вызывает экстенсивную пролиферацию апикальных почек и ингибирует рост листа (см. Рис. 8). При концентрациях паклобутразола 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 мг/л средняя длина листа составляла 10,0±1,2; 8,0±1,0; 8,0±2,4; 6,0±1,1, соответственно. При концентрации паклобутразола 7,5 мг/л длина листа достигала 2,7±1,0 см и устанавливалась на этом уровне, т.е. дальнейшее увеличение концентрации паклобутразола не влияла на длину листа.
Как уже отмечено, иаклобутразол стимулирует также экстенсивную пролиферацию эксплантов, т.е. увеличивает число образовавшихся побегов и боковых почек (см. Табл.2, Граф.2) (см. Рис. 9).
При концентрациях паклобутразола 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; мг/л число побегов на один эксплант составляло 35,0±1,1; 37,5±1,6; 37,6±0,9; 40,5±1,3, соответственно. Таким образом, максимальное число побегов (40,5±1,3) достигалось при концентрации паклобутразола 5,0 мг/л (см. Рис. 10). При дальнейшем увеличении концентрации паклобутразола до 7,5 мг/л число побегов составляло 26,0±1,5, т.е. незначительно ниже по сравнению с контролем (31,0±0,5). При концентрации паклобутразола 10,0 мг/л и выше число побегов на один эксплант уменьшалось 2-2,7 раза по сравнению с контролем.
Все концентрации паклобутразола стимулировали пролиферацию боковых почек, таким образом, во всех вариантах число боковых почек на один эксплант было выше, чем в контроле (1,5±0,1). Максимальное число боковых почек ( ::,0J.1,H; 18,0±1/1) было получено при концентрациях иаклобутразола 10. , 12,5 мг/л (см. Табл.2, Граф.2) (см. Рис. 11, 12). Увеличение конце"грации иаююбуїразола от 0,5 мг/л до 10,0 мг/л размеры заложпвшихся боковых почек не менялись (2-3 мм). Боковые почки с максимальными размерами были получены при концентрации иаклобутразола 12,:» мг/л.
Таким образом, максимальное число почек при минимальной длине листа нродуцированось при концентрациях иаклобутразола 10,0 и 12,5 мг/л. Во втором случае наблюдали крупные размеры заложпвшихся почек. Этот вариант целесообразно .использовать при размножении гладиолуса.
Влияние отношения объем среды/число экснлантов и паклобутразола па динамику развития культуры гадиолуса
Нами было изучено влияние отношения объем среды/число эксплантов (апикальных почек) на динамику развития культуры гладиолуса при чегырех вариантах конценіраций иаклобутразола: 1,0; 2,5; 7,0; 10,0 мг/л. Динамику развития культуры гладиолуса определяли оценивая также нарамсірьі такие, как время заложения боковой почки, удлинения листа апикального побега, увеличения массы почки и время проростання боковой почки (см. Табл.3, Граф. 3).
При значении отношения объем среды/число эксплантов = 3 (15 мл среды на 5 апикальных почек) в контрольном варианте и при концентрации иаклобутразола 1,0 мг/л вышеуказанные показатели были отмечены на 4-й день культуры. При увеличении концентрации паклобутразола до 2,5; 7,0 мг/л все показатели зафиксировались на 11-й день культуры. При концентрации иаююбуїразола 10,0 мг/л на 11-й день культуры наблюдали заложение боковой почки, тогда как удлинение листа апикального побега, увеличение массы почки, проростание боковой почки не отмечались.
При значении отношения объем среды/число эксилантов = 9 (54 мл среды на 6 апикальных почек), а также - 7 (81 мл среды на 3 апикальных почек) в котрольпом вариаше и при концентрации паклобутразола 1.0 мг/л все нами указанные показатели, характеризующие динамику развитая культуры гладиолуса, были отмечены на 11-й день культуры. При концентрациях паклобутразола 2,5 и 7,0 мг/л данные показатели зафиксировались на 18-й день культуры, а при концентрации 10.0 мг/л не наблюдались (см. Табл.3, Граф.3).
При значении отношения объем среды/число эксилантов = 81 (162 мл среды на 2 апикальные почки) в контрольном варианте и при концентрации паклобутразола 10,0 мг/л время заложения и проростання боковой почки наблюдались на 11-й день культуры, а время удлинения листа на 18-й день культуры. При концентрациях наклобутразола 2,5; 7,0; 10,0 мг/л данные показатели не были отмечены.
Таким образом, увеличением значения отношения объем среды/число эксилантов и концентрации паклобутразола заметно уменьшались темны развития культуры гладиолуса. Оптимальное условие развития культуры возможно при значении данного отношения = 3,0 (15 мл среды на 5 апикальных почек). Так как только для данного варианта при концентрации паклобутразола 10,0 мг/л наблюдалось заложение боковой почки на (11-й день культуры).
Как уже было показано, получение максимального числа почек при минимальной длине листа возможно при концентрации паклобутразола 10,0 и 12,5 мг/л. Следовательно, сочетание значения отношения объем среды/число эксилантов = 3,0 (15 мл среды на 5 апикальных почек) и концентрации паклобутразола 10,0 мг/л является оптимальным для развития культуры гладиолуса.
Нами было определено также число боковых почек на один эксплант в зависимости от концентрации наклобутразола (1,0; 2,5; 5,0; 7,5 мг/л) и значения отношения объем среды/число эксплангов на 4-й,
11-й, 18-й день кулыивироввания, в зависимости от времени инициации боковой ночки. Полученные результагы ещё раз подтвердили то, что оптимальным значением отношения объем среды/число эксплангов является - 3 (15 мл среды на 5 апикальных почек). Так как в данных условиях число заложившихся боковых почек на один эксплант (концентрация паїслобугразола 7,5 мг/л) на 4-й день культуры составляло 2,1 ±0,02, тогда как приблизительно такое же число почек (2,0±0.07) при значении отношения объем среды/число эксилантов = 81 (162 мл среды на 2 апикальные почки) было получено юлько на 11-й день культивирования (концентрация иаклобутразола 7,5 мг/л).
Несмотря на то, что при значении отношения объем среды/число эксплангов = 3,0 (15 мл среды на 5 апикальных почек) максимальное число заложившихся боковых почек на один эксплант наблюдалось на 4-й и 11-й день культуры при концентрации 2,5 мг/л (см. Табл.4, Граф.4), на 6-й неделе культивирования максимальное число почек (18,0±1,8) было получено при концентрации иаклобутразола 10,0 мг/л (см. Табл. 2, Граф.2).
Таким образом, данная концентрация иаклобутразола хотя и тормозит время инициации боковой почки, но является оптимальной для получения максимального числа почек гладиолуса.
