Введение к работе
Актуальность темы. Фенолы и их производные относятся к группе опасных органических соединений загрязняющих окружающую среду Одним из основных источников фенолов и их производных являются отходы промышленной переработки древесины.. Другим источником производных фенолов - алкилфенолов, являются продукты деградации неионных поверхностно-активных веществ -алкилфенолполиэтоксилатов (АФПЭ), применяемых в бьггу, текстильной, пищевой и лако-красочной промышленностях для обработки поверхностей металлов и в качестве диспергирующих агентов и эмульгаторов В процессе ирригации сточных вод АФПЭ и продукты их деградации попадают в почву и водоемы и вследствие своей химической устойчивости накапливаются в речных и морских отложениях. В связи с этим, разработка высокоэффективных методов анализа/определения фенолов в окружающей среде представляет собой актуальную биотехнологическую задачу Одним из ее решений является создание биосенсоров на основе электрохимических методов, т.е. разработка высокочувствительных ферментных электродов. Одним из ферментов, на основе которого создаются ферментные электроды для определения фенолов и их производных, является тирозиназа - медьсодержащая оксидоредуктаза, катализирующая окисление фенолов и их производных кислородом воздуха Биосенсоры на основе тирозиназы уже применяются для мониторинга сточных вод в промышленности, однако данные сенсоры требуют продолжительной и сложной пробоподготовки, основным этапом которой является концентрирование определяемых веществ в органических растворителях, таких как ацетонитрил, этанол и их смеси, с последующим растворением в традиционной для ферментов водной системе. Данные биосенсоры также имеют ряд недостатков, связанных с ограниченной диффузией субстратов в пленках/системах иммобилизованных ферментов и протеканием неферментативной полимеризации продуктов реакции в водных средах, что затрудняет анализ и приводит к снижению чувствительности сенсора.
Возможность работы сенсора в органических средах позволяет повысить эффективность определения фенолов. В частности, переход от водных сред неводным средам может дать следующие преимущества в анализе, а именно:
; «i:o...;.j гекл !
: с-Петербург гЬЛ
упростить процедуру пробоподготовки за счет уменьшения количества/времени ее этапов;
- уменьшить, так называемые, «диффузионные ограничения», благодаря
большей растворимости кислорода/фенолов во многих органических средах по
сравнению с водой;
- избежать отравления сенсора продуктами неферментативной рН - зависимой
реакции полимеризации.
Таким образом, одним из путей развития биосеносоров на основе тирозиназы для определения фенолов является разработка методов стабилизации каталитической активности и увеличение операционной стабильности тирозиназы как в полярных, так и неполярных органических системах, что позволит получить иммобилизованный Препарат фермента для практического использования в биоэлектрокатализе.
Целью исследования явилось изучение каталитической активности тирозиназы в водных и водно-органических средах, как в полярных, так и в неполярных растворителях, с последующей стабилизацией каталитической активности фермента. В качестве органических сред были выбраны органические растворители, широко применяющиеся при пробоподготовке фенол-содержащих образцов, октан, в качестве неполярного органического растворителя, ацетонитрил и водно-этанольные смеси - в качестве полярных органических растворителей. Дальнейшей целью работы являлась адаптация стабилизированного препарата тирозиназы для целей биоэлектрокатализа. Для этого была разработана методика иммобилизации тирозиназы на поверхности золотого электрода с сохранением каталитической активности фермента и с возможностью его использования в органических средах. Была разработана система «чернил» на основе органического растворителя содержащего стабилизированный фермент, для распьшения на поверхность твердого носителя с использованием спрэй-технологии, как наиболее экспрессивной и воспроизводимой методики получения электродов методом трафаретной печати.
Научная новизна В работе впервые получены и исследованы нековалентные комплексы тирозиназы с катионным полиэлектролитом полибреном, характеризующиеся повышенной каталитической активностью и стабильностью в водных и водно-органических средах. Для комплексов тирозиназы с полибреном
было обнаружено расширения рН-профиля ферментативной реакции за счет левого плеча, позволяющее использовать фермент в области кислых рН. При рН 4.5 каталитическая активность тирозиназы в комплексе с полибреном (в молярном соотношении 1:100) в 3 раза превышала активность свободного фермента Для полученных комплексов тирозиназы с полибреном впервые был показан стабилизационный эффект комплексообразования в водных и в водно-этанольных системах и эффект активации фермента в области умеренных концентраций полярного органического растворителя (до 40%), когда каталитическая активность тирозиназы в комплексе увеличивалась до 10 раз. Это позволило впервые разработать ферментный электрод на основе тирозиназы в комплексе с полиэлектролитом функционирующий в водной и водно-этанольной среде и обладающий высокой биоэлектрокаталитической активностью и высокой операционной стабильностью. Для стабилизации каталитической активности тирозиназы в октане использовался метод включения фермента в систему обращенных мицелл. Каталитическая активность тирозиназы, соллюбилизованной в системе обращенных мицелл в октане при степени гидратации обращенных мицелл 25 была соизмерима с активностью в водной среде. Это позволило впервые разработать ферментный электрод на основе тирозиназы в системе иммобилизованных обращенных мицелл функционирующий как в водной среде, так и в ацетонитриле Впервые продемонстрирована принципиальная возможность использования тирозиназы, включенной в систему обращенных мицелл, для создания электродов методом трафаретной печати при прямом распьшении органических «чернил», содержащих каталитически активный фермент, на поверхность электрода
Значимость полученных результатов Стабилизация/активация тирозиназы в водных и водно-органических средах, достигнутая при формировании нековалентных комплексов или при включении тирозиназы в систему обращенных мицелл в октане, позволяет использовать этот фермент в качестве биокатализатора успешно работающего в нетрадиционных средах, как в условиях гомогенного, так и гетерогенного катализа (в случае иммобилизованного фермента).
Теоретическая значимость работы связана с развитием представлений о принципах и механизмах стабилизации каталитически активных форм фермента, реализующихся при образовании нековалентных комплексов тирозиназы с
полиэлектролитом и при включении фермента в системы обращенных мицелл с различными характеристиками.
Практическая значимость работы обусловлена необходимостью создания
высокочувствительных электродов для определения фенолов и их производных в
окружающей среде. Ферментный электрод на основе тирозиназы, включенной в
систему обращенных мицелл, позволяет определять фенольные соединения
непосредственно в органической среде, тем самым избегая части этапов
пробоподготовки. Распыление тирозиназы в системе обращенных мицелл на
поверхность носителя позволяет повысить экспрессность и воспроизводимость
получения электродов методом трафаретной печати и тем самым
воспроизводимость анализа.
Апробация работы: Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: Международная конференция студентов и аспирантов "Менделеев-97" (Москва, Россия, 1997), Международная конференция студентов и аспирантов "Ломоносов-98" (Москва, Россия, 1998); NATO-Advanced Study Institute (NATO-ASI) "Enzymes in Heteroatom Chemistry. A Green Solution for Chemical Problems" (Berg en Dal (Nijmegen), The Netherlands, 1999); XVI International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Bratislava, Slovakia, 2001); XTV International Symposium "Surfactant in Solutions" (Barcelona, Spain, 2002); XVII Meeting on ERMIS "Electrode Reaction Mechanism and Interfacial Structure" (Kuningstein (Dresden), Germany, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения (7 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 144 ссылок. Работа изложена на 114 страницах, содержит 37 рисунков и 2 таблицы.
