Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Молекулярные маркеры и их использование для исследования генома растений 8
1.2. ПДРФ-маркеры 11
1.3. Полимеразная цепная реакция 13
1.4. ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции 16
1.5. Использование RAPD-метода в исследовании генома растений 20
1.6. SCAR-маркеры и проблемы, связанные с их получением 30
1.7. Системы обнаружения известных точковых мутаций 39
1.8. Генетическая карта посевного гороха (Pisum sativum L.) 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1. Характеристика растительного материала 47
2.2. Получение гибридов Пи расщепляющихся популяций F2 47
2.3. Выделение тотальной ДНК из листьев гороха 53
2.4. Метод ПЦР с использованием коротких случайных праймеров (RAPD-метод) 54
2.5. Клонирование RAPD-фрагментов 56
2.5.1. Получение ДНК-фрагментов для клонирования 56
2.5.2. Лигирование фрагментов ДНК с pGEM-T вектором 56
2.5.3. Приготовление компетентных клеток E.coli 57
2.5.4. Трансформация E.coli (штамм JM109) плазмидной ДНК 57
2.6. Метод выделения плазмидной ДНК 58
2.7. Анализ векторной ДНК на наличие требуемых вставок 59
2.8. Секвенирование клонированных фрагментов 59
2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей 59
2.10. Создание SCAR-маркеров 59
2.10.1. Подбор праймеров для амплификации специфических фрагментов ДНК 59
2.10.2.Реакция амплификации с использованием SCAR-праймеров 61
2.10.3.Подготовка ПЦР-фрагментов для рестрикции 62
2.10.4.Рестрикция ПЦР-фрагментов 62
2.11. Массовый сегрегационный анализ 62
2.12. Математическая обработка данных 63
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Картирование гена Ха-18 у гороха с помощью морфологических маркеров 65
3.2. Выявление RAPD-маркеров в ДНК гороха 66
3.3. Изучение наследования полиморфных RAPD-фрагментов 69
3.4. Количественная оценка RAPD-полиморфизма и построение дендрограмм. 71
3.5. Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха 75
3.6. Создание и изучение SCAR-маркеров 83
3.6.1. Получение SCAR-маркера из К10#950 RAPD-фрагмента 93
3.6.2. Получение SCAR-маркера из В474#800 RAPD-фрагмента 95
3.6.3. Получение SCAR-маркера из R03#1800 RAPD-фрагмента 97
3.6.4. Получение SCAR-маркера из Рг10#820 RAPD-фрагмента 99
3.6.5. Получение SCAR-маркера из К8#620 RAPD-фрагмента 101
3.6.6. Получение SCAR-маркера из Е16#860 RAPD-фрагмента 103
3.6.7. Получение SCAR-маркера из R06#470 RAPD-фрагмента 106
3.6.8. Получение SCAR-маркера из В474#550 RAPD-фрагмента 108
3.6.9. Получение SCAR-маркера из R11#540 RAPD-фрагмента 109
3.6.10.Получение SCAR-маркера из Рг10#660 RAPD-фрагмента 111
3.6.11.Получение SCAR-маркера из D6#550 RAPD-фрагмента 113
3.6.12.Получение SCAR-маркера из Рг10#340 RAPD-фрагмента 114
3.6.13.Получение SCAR-маркера из R06# 1100 RAPD-фрагмента 116
3.6.14.Получение SCAR-маркера из V03#800 RAPD-фрагмента 117
3.7 . Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения SCAR-маркеров 129
Заключение 135
Выводы 141
Список литературы 142
- Использование RAPD-метода в исследовании генома растений
- Метод ПЦР с использованием коротких случайных праймеров (RAPD-метод)
- Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха
- . Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения SCAR-маркеров
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия применение молекулярных маркеров в генетике растений получило широкое распространение. Разнообразные методы получения молекулярных маркеров позволили решить проблему недостатка морфологических маркеров, используемых для картирования классической генетикой.
Наличие огромного числа молекулярных маркеров дает возможность эффективно выявлять и картировать интересующие исследователей мутации по всему геному, в том числе и у гороха (Pisum sativum L.), геном которого отличается значительной сложностью.
Более того, разработка и изучение ДНК-маркеров является принципиально новым этапом исследования генома растений, поскольку они выявляют полиморфизм на уровне самой структуры ДНК и позволяют выйти на конкретные последовательности генома.
Одним из методов получения молекулярных маркеров является RAPD-метод (random amplified polymorphic DNA) - метод полимеразной цепной реакции с короткими случайными праймерами [Williams et al., 1990]. Данный метод позволяет быстро выявлять большое количество маркеров, распределенных по всему геному, является достаточно простым и дешевым, чем и объясняется его довольно широкое использование.
Однако RAPD-анализ выявляет анонимные участки генома, природа которых до конца не известна.
Для того, чтобы выйти на конкретные геномные последовательности, на основе RAPD-фрагментов были разработаны SCAR-маркеры (sequence characterized amplified region) [Kesseli et al., 1993]. Превращение RAPD-маркеров в SCAR сопровождается клонированием и секвенированием RAPD-продуктов. На основании данных сиквенса синтезируются два более длинных (обычно 20-25-нуклеотидных) SCAR-праймера, соответствующие концам RAPD-фрагмента и, как правило, включающие в себя исходные RAPD-праймеры. SCAR-праймеры с высокой специфичностью и воспроизводимостью обычно амплифицируют одну полосу, а не целый спектр фрагментов, как в случае RAPD-метода, и позволяют идентифицировать определенные участки ДНК.
В связи с этим представляло интерес получить RAPD-маркеры, характеризующие определенные линии и сорта гороха, либо сцепленные с различными мутациями генома гороха, и использовать их для создания SCAR-маркеров. Подобный методический подход даст возможность не только генотипировать различные линии и сорта гороха, но и выйти на определенные последовательности генома, соседствующие с наиболее интересными и физиологически значимыми генами, что является важным шагом на пути клонирования этих генов и понимания структуры генома гороха.
Цель и задачи исследования. Целью данной работа являлся поиск новых молекулярных маркеров (RAPD и SCAR) и их использование для изучения генома гороха. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
Выявить полиморфные RAPD и SCAR-маркеры в ДНК различных линий, сортов и мутантов гороха из генетической коллекции кафедры генетики МГУ и изучить их наследование.
Осуществить картирование молекулярных маркеров.
Клонировать и секвенировать полиморфные RAPD-фрагменты и провести анализ их нуклеотидной последовательности.
Из полиморфных RAPD-маркеров получить SCAR-маркеры. Изучить их природу, а также использовать полученные SCAR-маркеры для генотипирования различных линий, сортов и мутантов гороха.
Использование RAPD-метода в исследовании генома растений
В настоящее время RAPD-технология широко используется в изучении геномов растений.
Как уже говорилось выше, в RAPD-методе используется короткий (9-10-нуклеотидный) одиночный праймер, связывающийся с различными локусами и амплифицирующий участки ДНК, заключенные между ними (рис.1.1.).
Теоретически число амплифицированных фрагментов зависит от длины праимера, параметров реакции и размера генома растения и основывается на вероятности того, что последовательность, комплементарная праймеру (или по крайней мере первым 5-6 нуклеотидам на его З -конце), встретится в геноме на противоположных нитях ДНК, в противоположной ориентации в пределах расстояния, доступного для ПЦР (до 5000 пн) [Waugh and Powell, 1992; Joshi and Nguyen, 1993]. Для большинства растений праймеры длиной 9-10 нуклеотидов дают в среднем от 3 до 20 продуктов амплификации [Joshi and Nguyen, 1993; Weeden et al., 1993(b); Rus-Kortekaas et al., 1994; Кокаева и др., 1998].
Участки ДНК, амплифицируемые RAPD-методом распределены по всему геному и могут представлять собой как уникальные, так и повторяющиеся последовательности [Williams et al., 1990; Asakura et al., 1997; Кочиева и др., 1999; Bai et al., 1999; Ко et al., 2002].
Использование RAPD-метода позволяет с высокой частотой обнаружить полиморфизм в геномах растений. Полиморфизм между особями может возникать в результате изменения последовательности, связывающей прайм ер. Это могут быть точковые мутации, делеции сайта праимирования или другие перестройки, препятствующие отжигу праимера и выявляющиеся при электрофорезе как присутствие или отсутствие отдельной RAPD-полосы. Изменение последовательности, заключенной между праймерами, также может приводить к возникновению полиморфизма. Например, в результате инсерции сайты праимирования могут оказаться слишком далеко друг от друга для успешной амплификации участка ДНК, заключенного между ними, что также приведет к отсутствию полосы в RAPD-спектре. Или амплифицируемая последовательность может содержать инсерции или делеции, которые не препятствуют амплификации, но ведут к изменению размера RAPD-продукта [Willams et al., 1990; Waugh and Powell, 1992; Huang et al., 2000].
Продукты амплификации, получаемые RAPD-методом наследуются согласно законам Менделя и могут быть картированы на хромосомах [Newbury and Ford-Lloyd, 1993]. Обычно RAPD-маркеры наследуются доминантно (наличие, либо отсутствие RAPD-полосы). Кодоминантное наследование (в случае изменения размера RAPD-продукта в результате инсерции или делеции) встречается относительно редко [Willams et al., 1990; Tingey et al., 1992; Малышев, Картель, 1997].RAPD-метод может быть с успехом применен для создания генетических карт с высокой плотностью маркеров. RAPD-маркеры были использованы в картировании таких растений, как ячмень [Giese et al., 1994; Сиволап и др., 1997], сахарная свекла [Nilsson et al., 1997], томат [Saliba-Colombani et al., 2000], перец [Ben Chaim et al., 2001], бобы [Bai et al., 1997], горох [Laukou et al., 1998; Rameau et al., 1998; Irzykowska et al., 2001], нут [Simon and Muehlbauer, 1997], горчица [Sharma et al., 2002], пшеница [Asakura et al., 1997; Хлесткина и др., 1999], арабидопсис [Reiter et al., 1992], салат-латук [Kesseli et al., 1993], тополь [Bradshaw et al., 1994], цитрусовые [Deng et al., 1997] и ряд других.
RAPD-метод имеет ряд достоинств, объясняющих довольно широкое его использование с целью создания молекулярных маркеров. Данная методика технически проста и быстра в выполнении, требует небольших начальных количеств ДНК, не нуждается в предварительном знании последовательности амплифицируемого локуса и выявляет довольно высокий уровень полиморфизма [Гостимский и др., 1999]. RAPD-метод не включает в себя использование радиоактивных веществ, является достаточно дешевым и предоставляет возможность для автоматизации процесса [Waugh and Powell, 1992; Tingey et al., 1992; Weeden et al., 1993b].
Важным достоинством RAPD-метода является то, что он позволяет одновременно тестировать большое количество локусов и проводить глобальное сравнение геномов растений для поиска различий. Это преимущество RAPD-анализа используется для поиска маркеров, сцепленных с интересующими генами. К настоящему времени разработаны две методики, которые дают возможность за короткое время провести скрининг большого числа случайно распределенных, некартированных молекулярных маркеров и отобрать из них те, которые локализованы вблизи целевого локуса [Kesseli et al., 1993; Tanksley et al., 1995].
Метод ПЦР с использованием коротких случайных праймеров (RAPD-метод)
Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом ЗОмкл, содержащей 5мкл разведенной ДНК (ДНК разводили деионизированной водой в соотношении 1 часть ДНК : 9 частей воды), 2.5ед. Taq-полимеразы (НП АО ЗТ "Силекс М"), 0.2мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) и О.бмкМ RAPD-праймера. В реакции использовали 1х ПЦР-буфер (НПФ "ДНК-Технология"), содержащий ЗЛмМ MgCb С целью повышения специфичности реакцию амплификации проводили с "горячим стартом". Для этого смесь делили на две части с помощью парафина. Сначала в пробирку помещали часть смеси, содержащую 14мкл ПЦР-буфера с праймером и смесью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Далее добавляли 25мкл жидкого парафина. После затвердевания парафина в пробирку вносили вторую часть смеси, содержащую 10.5мкл ПЦР-буфера с Taq-полимеразой и 5мкл раствора ДНК. Для предотвращения испарения амплификационной смеси использовали 25мкл минерального масла (Sigma).
Праймеры, использованные для проведения RAPD-метода, приведены в таблице 2.4. Праймеры были синтезированы Быстровым Н.С. (Институт биоорганической химии РАН) и в ЗАО "Синтол". Амплификацию проводили в приборе МС2 (НПФ "ДНК-Технология") в режиме Precise по следующей программе: первая ступень - 94С, Імин.ЗОсек. вторая ступень - 94С, 20сек.; t0T3K, 5сек; 71 С, Юсек. - 5 циклов третья ступень - 94С, 1сек.; to, 5сек.; 71С, Юсек. - 35 циклов t = 34, 36, 37, 38,40 и 42С Для того, чтобы исключить возможность загрязнения, при постановке каждой серии амплификации ставили контрольные реакции без добавления геномной ДНК. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2.5% агарозном геле (Biotechnology Grade, USA), окрашенном бромистым этидием (конечная концентрация бромистого этидия 0.001%). Электрофорез проводили в режиме 5В/см в 1х ТВЕ буфере (0.089М Трис, 0.089М борная кислота, 0.002М ЭДТА, рН=8) [Маниатис и др., 1984]. После электрофореза гели анализировали в УФ свете и фотографировали на пленки Микрат-300 и Микрат-500.
В качестве маркеров молекулярного веса использовали 123bp DNA ladder ("Life Technologies"), ЮОЬр DNA ladder ("Сибэнзим"), 1.5Kb+100bp DNA ladder ("Сибэнзим"). Каждому взятому в работу RAPD-маркеру было дано название, состоящее из двух частей. Первая часть соответствует праймеру, при амплификации с которым был обнаружен данный фрагмент; вторая часть названия - приблизительный размер в пн. 2.5. Клонирование RAPD-фрагментов. После проведения электрофореза интересующий RAPD-фрагмент вырезали и экстрагировали из агарозного геля, используя QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN). Экстракцию проводили по протоколу фирмы QIAGEN. Элюированный RAPD-фрагмент реамплифицировали по приведенной выше программе (см. раздел 2.4), разгоняли на геле, а затем снова вырезали и элюировали. Предварительно реамплифицированные и экстрагированные из геля фрагменты ДНК были лигированы с pGEM вектором набора для клонирования pGEM vector system II (Promega, USA). Лигирование производилось согласно протоколу фирмы Promega. Полученную лигазную смесь впоследствии использовали для трансформации компетентных клеток E.coli.
Свежую колонию E.coli JM109 диспергировали в 2мл буфера А (ЮмМ MgS04, 0.2% глюкоза в LB) и наращивали в течение ночи при 37С. Суспензию переносили в колбу, содержащую 50мл буфера А и инкубировали 1 час при 37С при 150 кач./мин. Выращенную культуру охлаждали до 0С и инкубировали при этой температуре Юмин. Далее клетки осаждали центрифугированием Юмин. при 5000 об./мин. при 0С. Осадок ресуспендировали в 0.5мл буфера А + 2.5мл буфера Б (36% глицерин, 12% ПЭЦ8000, Sigma), 12мМ MgS04 в LB, рН 7.5).
Хранение клеток осуществляли при -20С. Приготовление 1л среды LB (Лурия-Бертани): Юг бакто-пептона, 5г бакто-дрожжевого экстракта и Юг NaCl растворить в 100мл дистиллированной воды. Довести рН до 7.5 с помощью 1М NaOH. Добавить воду до литра [Маниатис и др., 1984]. Использовали также коммерческие компетентные клетки E.coli JM109 (Promega). Их хранили при -70С. В быстро размороженные компетентные клетки E.coli штамма JM109, помещенные в лед, вносили 5мкл лигазной смеси и инкубировали на льду в течение часа. Далее клетки прогревали при 42С 2мин. и помещали в лед на 5мин. Затем к суспензии добавляли 0.5мл охлажденной среды LB и вновь инкубировали при 37С 1час. Содержимое пробирки высевали на чашку Петри со средой LB, ампициллином с конечной концентрацией 100мкг/мл, X-GAL (20мкг/мл), ИПТГ(20мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 37С. Клетки, несущие плазмиду со вставкой фрагмента чужеродной ДНК, выявляли путем бело-синей селекции. Рекомбинантные колонии были белого цвета, нерекомбинантные — синего.
Поиск RAPD-маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха
С целью локализации двух новых хлорофильных мутаций гороха, ха-18 и chl-15, был проведен поиск RAPD-маркеров, сцепленных с данными генами и с генами Wb, ТІ, Le, А, В, Gp, S и R, положение которых на карте сцепления гороха уже известно (табл.2.2). Для этого методом массового сегрегационного анализа исследованы три различных популяции F2(L-111 х Хл-15), (L-84 х Хл-18) и (Хл-18 х L-1238), сегрегирующие по аллелям тех генов, с которыми проводился поиск сцепленных RAPD-маркеров. Растения F2 популяций разделяли на группы, различающиеся по исследуемому фенотипическому признаку. Из каждой группы растений готовили смесь ДНК. Смеси ДНК, полученные из растений, обладающих альтернативными признаками, а также ДНК родительских растений, исследовали RAPD-методом на наличие полиморфизма.
Праймеры, использованные для выявления полиморфизма при проведении массового сегрегационного анализа, а также температуры отжига (to), примененные с каждым из праймеров, приведены в таблице 3.5. Последовательности праймеров даны в таблице 2.4. Так, был проведен RAPD-анализ с использованием праймера РгЮ трех смесей ДНК растений F2 (Хл-18 х L-1238). Одна из смесей состояла из ДНК растений, гомозиготных по доминантному аллелю гена Ха-18, другая была представлена растениями, гомозиготными по мутантному рецессивному аллелю данного гена, а третья состояла из гетерозигот по гену Ха-18. Были также исследованы ДНК родительских растений Хл-18 и L-1238.
Следует отметить, что ДНК гетерозигот использовалась в качестве дополнительного контроля, поскольку в ее RAPD-спектре ожидалось наличие фрагментов, сцепленных как с доминантным, так и с рецессивным аллелем исследуемого гена. При RAPD-анализе было установлено, что Рг10#340 фрагмент, присутствовал только в RAPD-спектрах образцов, несущих доминантный аллель гена Ха-18 (смесь ДНК гомозигот по доминантному аллелю гена Ха-18, гетерозигот по данному гену, а также ДНК линии L-1238). У линии Хл-18 и в смеси ДНК гомозигот по мутантному аллелю гена Ха-18 фрагмент отсутствовал (рис.3.5.). Проведенные исследования указывали на сцепление данного маркера с доминантным аллелем гена Ха-18. Сцепление было подтверждено на основе анализа RAPD-методом индивидуальных растений популяции F2 популяции Аналогичным образом были найдены два других RAPD-маркера VO3#800 и Rll#540, сцепленные с доминантным аллелем гена Ха-18 (рис.3.7.а,б), а также RAPD-маркеры Е16#840, R06#470 и К8#620, сцепленные с доминантным аллелем гена А (рис.3.8.а,б,в), RAPD-маркеры R06#1100, К10#950 и D6#620, сцепленные с доминантным аллелем гена СМ-15 (рис.3.8.г,д,е) и RAPD-маркер R03#1800, сцепленный с рецессивными аллелями генов R и 77 (рис.3.9.). Здесь следует отметить, что, поскольку гены R и 77 являются близко сцепленными и находятся на расстоянии друг от друга 4.67сМ [Weeden et al., 1998], bulk-смеси, используемые для поиска RAPD-маркеров, сцепленных с геном R, могли также использоваться для поиска RAPD-маркеров, сцепленных с геном 77.
Был проведен анализ статистической достоверности расщепления в F2 по каждому маркеру, а также оценка сцепления между двумя маркерами по методу хи-квадрат (табл.3.6.). Расщепление по каждому маркеру в F2 достоверно не отличалось от 3 : 1. б) Продукты амплификации ДНК с праймером R11 при to 42С. При помощи компьютерной программы MAPMAKER 3.0. были рассчитаны генетические расстояния между RAPD-маркерами и генами, с которыми они сцеплены (табл.3.6.), а также определено взаимное расположение RAPD-маркеров на хромосомах (рис.3.10. а,б,в). Генетические расстояния на рисунке 3.10. несколько отличаются от данных, приведенных в таблице 3.6., поскольку в таблице приводятся результаты попарного сравнения маркеров, а на рисунке - мультилокусного анализа. Первоначально оценка сцепления производилась при минимальном значении LOD 3.00. Однако RAPD-маркер Rll#540 обнаружил сцепление с геном Chl-18 лишь при понижении LOD порога до 1,67. Все остальные RAPD-маркеры, при проведении мультилокусного анализа сцепления с минимальным значением LOD-балла 3.00., оказались сцепленными с генами гороха или с другими RAPD-маркерами. Значения LOD для каждой пары сцепленных маркеров даны в таблице 3.6. Таким образом, найдено 10 RAPD-маркеров, сцепленных с пятью различными генами гороха {Chl-15, А, Ха-18, R и ТІ). Все маркеры, кроме R03#1800 находятся в фазе притяжения с доминантными аллелями соответствующих генов. RAPD-маркер R03#1800 находится в фазе отталкивания с доминантными аллелями генов R и 77, причем на карте сцепления он располагается со стороны гена 77.
. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов, использованных для получения SCAR-маркеров
Анализ нуклеотидных последовательностей позволил установить точный размер RAPD-фрагментов, использованных для создания SCAR-маркеров (табл.3.12.).
Последовательности фрагментов R06#470, К8#620, Е16#840, D6#550, Рг10#340 и R06#1100 загружены в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и доступны по номерам записи AY303675, AY303676, AY303677, AY303678, AY303679 и AY303680 соответственно.
Поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей в базах данных GenBank, EMBL, DDBJ и PDB позволил установить, что часть последовательности фрагмента В474#550 с 5 по 343 нуклеотид на 91% гомологична некодирующей 3 - фланкирующей части (с 2449 по 2112 нуклеотид) гена халконсинтазы гороха PsCHS4 [Ito et al., 1997]. Последовательность этого гена находится в базе данных DDBJ под номером D88260. Ее размер - 2941 нуклеотид. Другая часть последовательности этого же фрагмента с 344 по 544 нуклеотид на 84% гомологична части последовательности (с 828 по 628 нуклеотид) повторяющегося элемента гороха [Martin-Laurent et al., 2001] (рис.3.39.). Общая длина последовательности - 1028 нуклеотидов.
При сравнительном анализе белковых последовательностей, ожидаемые продукты трансляции повторяющегося элемента оказались гомологичными предполагаемым о/-полипротеинам ретротранспозонов риса {Oriza sativa) (ВАА96774, ВАВ08213, ВАВ86420, ALL77160, АКК52540, ААК55777, AAN06868, ВАВ21213, ААК16189 и др.), арабидопсиса {Arabidopsis thaliana) (AAD20432, AAD22283), предполагаемым --предшественникам и gag-белкам риса {Oriza sativa) (ААК92670, AAL91598, ААК72282, ААК71558 и др.), предполагаемой pol-протеазе ретроэлементов кукурузы {Zea mays) (AAL75478), а также различным предполагаемым ретроэлементам и сходным с ретротранспозонами последовательностям. Исходя из этих данных, повторяющийся элемент скорее всего является ретротранспозоном, однако полученные данные пока не дают возможности предположить, произошло ли встраивание ретротранспозона в некодирующую область действующего гена халконсинтазы гороха, или нами была клонирована часть псевдогена.
Также было показано, что часть последовательности Е16#840 фрагмента с 6 по 587 нуклеотид гомологична различным частям последовательностей повторяющихся элементов гороха и других бобовых (табл. 3.13.). Интересно отметить, что была найдена гомология двух частей Е16#840 фрагмента с двумя различными участками повторяющегося элемента гороха AJ002213, который также гомологичен (правда другим участком) последовательности фрагмента В474#550. Анализ белковых последовательностей выявил значительную гомологию продуктов трансляции Е16#840 фрагмента с предполагаемым /?о/-полипротеином ретротранспозонов арабидопсиса {Arabidopsis thaliana) (AAD22283, AAD15474, AAD20101) и риса {Oriza sativa) (ВАВ90375, ВАВ64210, AAN31788, AAN06839, ВАВ85272 и др.), с обратной транскриптазой глицинии {Glycine max) (ВАВ40834), с предполагаемым gag-pot полипротеином риса {Oriza sativa) (ААК52140, ААК26119, AAL58969, AAM95684 и др.), а также с множеством предполагаемых ретроэлементов риса {Oriza sativa) (ААК50400, AAN01247, ААК92547 и др.). Судя по этим гомологиям, Е16#840 фрагмент скорее всего является частью ретротранспозона или некой ретротранспозоноподобной последовательностью генома гороха. Часть нуклеотидной последовательности R06#1100 фрагмента с 850 по 957 нуклеотид показала 86% гомологии с частью гена полипротеина ретротранспозона Medicago sativa (AF43938), общая длина которого составила 18789 пн. Поиск гомологии в базах данных белковых последовательностей позволил установить гомологию возможных продуктов трансляции R06#1100 фрагмента с предполагаемым ретротранспозоном Opie-2 у риса {Oriza sativa) (ААМ74419, ААМ08523, AAN0531 и др.) и кукурузы {Zea mays) (ААС49502), /?о/-полипротеином соріа-типа у кукурузы {Zea mays) (ADD20307), а также с предполагаемым /?о/-полипротеином соріа-типа у риса {Oriza sativa) (ААМ23248, ААМ47619 и т.д.). Исходя из этих данных, часть R06# 1100 фрагмента возможно является частью ретротранспозона генома гороха.
Для остальных фрагментов не было выявлено существенной гомологии их последовательностей ни с одной из известных нуклеотидных последовательностей. Однако анализ белковых последовательностей выявил гомологию продуктов трансляции Rll#540 фрагмента обратной транскриптазе предполагаемого ретротранспозона, не содержащего LTR, арабидопсиса {Arabidopsis thaliana) (NP_189754, NP_178766, NP_680097, NP180666 и др.) и риса {Oriza sativa) (AAG13524 и др.). Белковая последовательность К10#950 фрагмента оказалась гомологичной предполагаемым ретроэлеметнам риса {Oriza sativa) (ААМ74265, AAN08168, ААМ74403, ААК53848 и др.), а также предполагаемому pol-полипротеину риса {Oriza sativa) (ААМО10417, ААК52540, ААМ01055, ААММ682, ААМ14675 и др.).
Таким образом, из 14 клонированных RAPD-фрагментов часть одного (В474#550) оказалась гомологичной некодирующей части гена халконсинтазы гороха, другая часть этого же фрагмента вероятно является частью ретротранспозона. Четыре фрагмента (Е16#840, R06#1100, Rll#540 и К10#950) скорее всего являются частями ретротранспозонов или неких ретротранспозоноподобных последовательностей генома гороха. Для остальных девяти фрагментов не было выявлено существенной гомологии ни с одной из известных нуклеотидных или белковых последовательностей.
Полученные результаты свидетельствуют о довольно большом количестве ретротранспозонов в геноме гороха, что согласуется с литературными данными, согласно которым ретротранспозоны широко распространены в растительных геномах [Bennetzen et al., 1998; Vicient et al., 1999; Nouzova et al., 2001; Ко et al., 2002] и у гороха, в частности [Kato et al., 1999; Pearce et al., 2000; Neumann et al., 2001]. Причем, согласно работам некоторых исследователей [Kato et al., 1999], транскрипция ряда ретротранспозонов гороха, неактивных в нормальных условиях, активируется при различного рода стрессовых воздействиях. Такие ретротранспозоны должны играть важную биологическую роль, участвуя в регуляции генов и оптимизируя генную экспрессию в ответ на различные воздействия окружающей среды [Kato et al., 1999].
