Содержание к диссертации
Введение
Список сокращений 4
Введение 6
1. Обзор литературы. Биохимические и молекулярно-генетические маркеры эмбриогенеза человека 12
1.1 Биохимические методы оценки прогноза развития плода 12
1.1.1 Биохимический пренатальный скрининг. Ретроспектива и перспектива 13
1.1.2 Эндокринная регуляция роста и развития плода 20
1.1.3 Биохимические маркеры окислительного стресса в оценке роста и развития плода 29
1.2 Молекулярно-генетические маркеры в прогнозе развития плода 34
1.2.1 Генетические маркеры системы гемостаза и патология беременности 36
1.2.2 Гены системы детоксикации ксенобиотиков 52
2 Материал и методы исследования 59
2.1 Материал исследования 59
2.1.1 Отбор пациентов для проведения ретроспективного пренатального скрининга 59
2.1.2 Материал для исследования биохимических маркеров при низкой массе плода 59
2.1.3 Материал для исследования молекулярно-генетических маркеров прогноза развития плода 60
2.2 Методы исследований 60
2.2.1 Иммуноферментный и иммунофлуоресцентный методы определения альфа-фетопротеина, хорионического гонадотропина и свободного эстриола 60
2.2.2 Методы исследования содержания плацентарных гормонов 61
2.2.3 Методы оценки окислительного статуса маточно-плацентарных отношений 61
2.2.4 Молекулярно-генетические методы исследования полиморфизма генов 61
2.2.5 Статистические методы 63
2.2.6 Контроль качества проводимых исследований 65
3 Результаты и их обсуждение 67
3.1 Исследование региональных медиан биохимических маркеров развития плода, с целью совершенствования существующего пренатального скрининга 65
3.2 Исследование гормонов плода и плаценты как прогностических маркеров эмбриогенеза 75
3.3 Показатели окислительного статуса беременных, родивших детей с низкой массой тела 84
3.4 Исследование частот полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови при невынашивании беременности 90
3.5 Исследование частот полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков при невынашивании беременности 99
Заключение 112
Выводы 120
Список использованных источников 121
Приложение 139
- Эндокринная регуляция роста и развития плода
- Генетические маркеры системы гемостаза и патология беременности
- Исследование региональных медиан биохимических маркеров развития плода, с целью совершенствования существующего пренатального скрининга
- Исследование частот полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови при невынашивании беременности
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важной проблемой понимания процессов эмбрионального развития человека являются вопросы прогностического значения. Высокая пластичность организма в раннем периоде делает эмбрион более чувствительным к различным факторам среды, с другой стороны, существует возможность воздействия на него в целях коррекции. Существующие биохимические маркеры развития плода, такие как альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и свободный эстриол, достоверны в прогнозе синдрома Дауна и пороков развития нервной трубки, и малоэффективны в прогнозе врожденных пороков развития других соматических органов и наследственных заболеваний, а также в прогнозе развития гипоксии и гипотрофии плода. История разработки биохимических маркеров развития плода насчитывает более 40 лет, тем не менее, большинство современных исследований направлено на изучение узкого круга патологий - хромосомных анеуплоидий, грубых врожденных пороков развития. В то же время существует необходимость дальнейшего углубленного изучения механизмов развития ранних этапов эмбриогенеза и разработки методов прогноза течения беременности на основе индивидуальных особенностей генотипов родителей.
Успехи молекулярной генетики, достигнутые в последние годы, сделали возможным изучение генной природы и молекулярных механизмов многофакторной патологии. Например, все метаболические процессы инактивации токсичных веществ контролируются генотипом и зависят от его индивидуальных особенностей (Van Lieshout, е.а., 1998; Баранов B.C., 2007; Coto, е.а., 2010). В группу генов предрасположенности к невынашиванию беременности, относят гены системы биотрансформации ксенобиотиков - любых чужеродных токсичных веществ, поступающих в организм. Повреждающее действие ксенобиотиков может реализоваться как в ходе гаметогенеза, так и при оплодотворении, имплантации, синцитилизации, плацентации и последующих стадиях эмбриогенеза.
Дальнейшая оптимизация программы пренатальной диагностики плода может быть направлена как на поиск новых маркеров, так и на повышение чувствительности уже используемых маркеров.
Актуальность проблемы, стремление теоретически и практически обосновать применение новых маркеров для оценки состояния плода с позиций современной эмбриологии, используя новые биохимические и молекулярно - генетические подходы, обусловило выполнение настоящей работы.
Цель работы: проведение исследований по оценке эффективности существующего биохимического пренатального скрининга, разработка способов его оптимизации, поиск новых биохимических и молекулярно-генетических маркеров крови беременных женщин для оценки развития плода.
Задачи исследования.
1. Провести ретроспективный и проспективный анализ биохимического пренатального скрининга у беременных Ростовской области в период с 2006 по 2009 гг. Исследовать региональные медианы понедельного развития плода по сывороточным маркерам, определяемым иммуноферментным и иммунофлуо-
ресцентным методами, с целью оптимизации существующего пренатального скрининга.
-
Исследовать прогностическую значимость биохимических показателей эмбрионспецифических белков и гормонов (АФП, ХГЧ, св. эстриола, ТБГ, прогестерона, тестостерона, кортизола, ДГЭА-С, 17-ОН-прогестерона) в сыворотке матерей, родивших детей с низкой массой тела.
-
Исследовать прогностическую значимость показателей окислительного статуса крови матерей, родивших детей с низкой массой тела.
-
Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы гемостаза в процессе эмбриональных потерь.
-
Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы детоксикации (первой и второй фазы) в процессе эмбриональных потерь.
Научная новизна работы. Впервые, опираясь на большой статистический материал (более 30000 беременностей и их исходов), доказана целесообразность внедрения в существующий пренатальный скрининг региональных медиан для сывороточных маркеров крови независимо от их метода исследования. Введение региональных медиан сывороточных маркеров для беременных Ростовской области увеличивает чувствительность пренатального скрининга в среднем на 10%. Впервые показано, что увеличение уровня прогестерона, тестостерона, кортизола, хорионического гонадотропина человека и снижение концентрации свободного эстриола в крови матери во втором триместре достоверно ассоциировано с рождением детей с низким весом. Впервые показано, что снижение уровня антиоксидантных ферментов во втором триместре беременности может служить прогностическим маркером рождения ребенка с низкой массой тела. Впервые показано, что сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля A114V гена глутати-on-S-трансферазы Р1 ассоциировано с увеличением риска эмбриональной гибели плода. Впервые показано, что суммарное носительство в супружеской паре более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков приводит к достоверному увеличению риска эмбриональных потерь.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Введение региональных норм для медиан альфа-фетопротеина, свободного эстриола и хорионического гормона человека повышает эффективность пренатального скрининга независимо от метода определения - иммуноферментного или иммунофлуоресцентного анализа.
-
Определение повышенного уровня хорионического гонадотропина человека во втором триместре беременности в сочетании с увеличением уровня кортизола, прогестерона, тестостерона и снижением уровня свободно эстриола является прогностическим алгоритмом для оценки риска развития гипотрофии плода.
-
Снижение уровня супероксиддисмутазы в сыворотке крови женщин во втором триместре беременности более чем на 35% ассоциировано с низкой массой тела новорожденного.
-
Риск ранних эмбриональных потерь увеличивается при гетерозиготном но-сительстве как матерью, так и эмбрионом полиморфного аллеля A114V гена глутатион-8-трансферазы PL
-
Риск гибели эмбриона увеличивается при наличии у него более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков.
Теоретическое и практическое значение работы. В общетеоретическом плане, полученные результаты расширяют представления о патобиохимических процессах эмбрионального развития человека и открывают новые перспективы их практического применения в пренатальной диагностике плода. Выполненная работа расширяет существующие представления о прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркерах эмбриогенеза человека.
В результате проведения комплексных исследований по поиску биохимических и молекулярно-генетических прогностических маркеров эмбриогенеза человека получены новые данные, позволяющие существенно оптимизировать существующий пренатальный скрининг, расширить спектр выявляемых нарушений развития плода и прогнозировать раннюю летальность эмбриона по генотипам родителей. Разработан алгоритм прогноза рождения детей с низким весом по уровню гормонов (хорионический гонадотропин, кортизол, прогестерон, тестостерон, свободный эстриол) и уровню антиоксидантов в крови матери во втором триместре беременности. Доказана целесообразность определения носительства аллеля глутатионтрасферазы GSTP1 Alal 14Val у обоих супругов с целью прогноза эмбриональной гибели плода. Предложен и внедрен способ оптимизации существующего биохимического пренатального скрининга в Ростовской области на основе расчета региональных медиан. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкурсах «Эмбриология человека», «Медико-генетическое консультирование», «Свободные радикалы в живых системах», «Предиктивная медицина».
Работа выполнена в рамках научной тематики НИИ биологии ЮФУ «Изучение механизмов окислительного стресса», и в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров», государственный контракт № 02.740.11.0501, в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2020 гг)» проект № 2.2.3.3/2370, а также в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Создание и апробация нового способа FIAV для быстрой идентификации аллельных вариантов генов» № 02.740.11.5015 и ФЦП МОН РФ ЦКП научным оборудованием «Высокие технологии» № 02552.11.7072.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета ЮФУ (2005, 2008, 2009); на междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине» (Судак-2006); на II международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); на заседании Ростовского отделения об-
щества ВОГиС (2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 11 работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 59 отечественных и 101 зарубежных источника, приложения. Работа содержит 23 таблицы, иллюстрирована 25 рисунками.
Эндокринная регуляция роста и развития плода
Окружающая среда, в которой развивается плод, важна для его выживания и долговременного здоровья. Регуляция нормального роста плода у человека включает множество разнонаправленных взаимодействий между матерью, плацентой и плодом. Мать обеспечивает плод питательными веществами и кислородом через плаценту. Плод влияет на снабжение материнскими питательными веществами с помощью плацентарной продукции гормонов, регулирующих материнский метаболизм. Плацента является точкой обмена между матерью и плодом и регулирует рост плода посредством продукции и метаболизма гормонов, регулирующих рост, таких как инсулиноподобный фактор роста и глюкокортикоиды. Правильная инвазия трофобласта на ранней стадии беременности и усиленный кровоток обеспечивают достаточный рост матки, плаценты и плода. Плацента может отвечать на эндокринные сигналы плода, направленные на увеличение потока питательных веществ от матери, посредством роста плаценты, активации транспортной системы и продукции плацентарных гормонов, влияющих на материнскую физиологию и поведение (Evain-Brion D., 1994; Anthony R.V. е.а., 1995; Murphy V.E. е.a., 2006).
В отличие от эндокринной регуляции роста новорожденного, когда основными гормонами, непосредственно влияющими на рост плода, являются соматотропин и инсулиноподобные факторы роста, эмбриональный рост на протяжении всей беременности зависит от материнских факторов, функционирования плаценты и скоординированных действий в системе мать-плацента-плод совместно с факторами роста. Нарушения роста выявляются в большинстве случаев только постнатально, но они могут быть напрямую связаны с процессами, протекающими на протяжении всего эмбрионального периода (Murphy V.E. е.а., 2006; Mullis Р.Е., Tonella P., 2008).
Во время беременности плацента, снабжаемая предшественниками гормонов, за счет работы системы мать-плацента-плод синтезирует в больших количествах стероидные гормоны, а также различные белковые и пептидные гормоны, и, в свою очередь, секретирует эти продукты в кровоток матери и плода. Кроме того, белковые и пептидные гормоны, продуцируемые плацентой, действуют посредством паракринного механизма, регулируя секрецию стероидных гормонов плаценты (Гриффин Дж., Охеды С, 2008).
Стероидные гормоны занимают особое место в гестационном процессе. В этой многочисленной группе производных циклопентан-пергидрофенантрена ведущая роль с точки зрения контроля репродуктивной функции принадлежит эстрогенам, прогестерону и глюкокортикоидам. Обладая, выраженными эффектами при действии на многие органы-мишени, ткани, клетки, ферментативные реакции, эти гормоны не только могут оказывать взаимное влияние на процессы биосинтеза внутри стероидной группы, но также способны регулировать биологическую активность друг друга. Основными местами их синтеза на ранних этапах беременности являются яичники и надпочечники, а позднее — плацента, надпочечники плода и матери (рис. 1).
Важное место в эндокринной функции плаценты принадлежит синтезу прогестерона (Gellersen В. е.а., 2009; Hill М. е.а.., 2010; Feinshtein V. е.а., 2010). Прогестерон синтезируется с ранних сроков беременности. В первые три месяца основная роль в продукции этого гормона принадлежит желтому телу беременности, а затем плаценте (Савельева Г.М. и др., 2000; Гриффин Дж., Охеды С, 2008). Полагают, что развитие трофобласта в качестве главного источника секреции прогестерона происходит к 8-й неделе беременности,поскольку удаление желтого тела до этого срока ведет к спонтанному аборту. После 8 недель беременности желтое тело беременности продолжает секре-тировать прогестерон, но этот секретируемый прогестерон составляет лишь долю того, что секретируется плацентой. Во второй половине беременности содержание прогестерона является показателем гормональной функции плаценты. В конце беременности плацента продуцирует приблизительно 250 мг прогестерона ежедневно (Гриффин Дж., Охеды С. , 2008). Недостаточный уровень прогестерона или недостаточный ответ на прогестерон могут вести к прерыванию беременности или бесплодию (Young, Lessey, 2010).
Несмотря на то, что плацента синтезирует большое количество прогестерона, при нормальных условиях она обладает очень ограниченной способностью синтезировать холестерин из ацетата. Главным источником субстрата-предшественника для биосинтеза прогестерона у беременной женщины служит материнский холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛНЦи Холестерин ЛНП присоединяется к своему рецептору на трофобласте и захватывается и разрушается трофобластом до свободного холестерина, который затем превращается в прогестерон и секретируется. Прогестерон связывается с рецепторами в гладкой мускулатуре матки, тем самым ингибируя сократимость гладкой мышцы, вызывая покой миометрия и предотвращая сокращения матки. Он также ингибирует образование простагландинов, которые играют важную роль при родах. Возможно, прогестерон способен ин-гибировать опосредуемые Т-лимфоцитами клеточные ответы, участвующие в отторжении трансплантанта. Поскольку плод является чужеродным телом в матке, высокий уровень прогестерона может блокировать клеточные иммунные ответы на чужеродные антигены и важен для достижения иммунологической привилегированности матки при беременности (Гриффин Дж., Охеды С, 2008).
Показано, что во время беременности скорость продукции эстрогенов в плаценте заметно возрастает. Эстриол - представитель эстрогенов - является главным стероидным гормоном, синтезируемым плацентой. На первой стадии синтеза, которая происходит в эмбрионе, холестерин, образующийся de novo, либо поступающий из крови матери, превращается в прегненолон, который сульфатируется корой надпочечников плода в дегидроэпиандростерон сульфат. Гидроксилирование этого соединения в печени по 16а-положению и отщепление сульфата сульфатазами плаценты приводит к образованию эстриола (рис. 2). Таким образом, 90 % эстриола имеет плодовое происхождение и лишь 10 % гормона образуется из эстрона и эстрадиола, секретируемых яичниками матери (Шабалова Н.П., Цвелева Ю.В., 2004; Кащеева Т.К., 2007; Кишкун А.А., 2007; Гриффин Дж., Охеды С, 2008; Марри Р. и др., 2009).
Ферментные системы, участвующие в биосинтезе и метаболизме эстрогенов при беременности распределены между плацентой и плодом таким образом, что одни реакции — образование андрогенных предшественников эстрогенов, их гидроксилирование и сульфатирование происходят в организме плода, а другие - расщепление.сульфатов и ароматизация андрогенов в эстрогены - в плаценте (Куцев СИ., Гуськов Е.П., 2004).
Поскольку в образовании эстриола принимают участие как плод, так и плацента, изменение уровня эстриола в сыворотке крови матери может служить идеальным показателем функции фетоплацентарной системы. При нормально развивающейся беременности продукция эстриола повышается в соответствии с увеличением срока беременности и ростом плода. В крови матери уровень свободного эстриола возрастает с 4 нмоль/л в 15 недель до 40 нмоль/л к родам или на 20 - 25 % еженедельно с 15 до 22 недели. Имеется прямая связь между размерами плода, массой плаценты, состоянием надпочечников плода и уровнем эстриола в крови беременной. Возрастающая концентрация эстриола обеспечивает рост и развитие матки, усиление её кровоснабжения; пролиферацию протоков молочных желёз.
Снижение концентрации эстриола может произойти при любой акушерской или соматической патологии, причём быстрое снижение концентрации гормона служит наиболее ранним диагностическим признаком аномалии плода, поскольку примерно на месяц предшествует развитию клинических проявлений нарушения состояния плода (Куцев СИ., Гуськов Е.П., 2004).
По данным авторов (Куцев СИ., Гуськов Е.П., 2004; Кащеева Т.К., 2007) снижение уровня эстриола в крови беременных обусловлено: гипотрофией плода; гипоплазией надпочечников плода; анэнцефалией, что, по-видимому, связано с отсутствием стимуляции надпочечников гормонами гипофиза плода; синдромом Дауна (снижение концентрации неконъюгирован-ного эстриола до 0.73 МоМ (Гинтер Е.К., 2003); внутриутробной инфекцией; лечением беременной глюкокортикоидами или некоторыми антибиотиками (подавление активности надпочечников плода по принципу отрицательной обратной связи); поздним токсикозом беременных; фетоплацентар-ной недостаточностью (снижение уровня эстриола на 50 - 60 %); угрозой гибели плода (при внутриутробной гибели плода снижение уровня гормона на 80 - 90 % от нормы или до 0:5 МоМ). Снижение эстриола ниже .нормы в третьем триместре беременности позволяет прогнозировать преждевременные роды. Кроме того, с низкой концентрацией- гормона коррелирует не только высокая анте- и интранатальная смертность, но и повышенная неона-тальная заболеваемость и смертность. Повышение уровня эстриола в крови беременных наблюдается при: многоплодной беременности; крупном плоде.
Концентрация глюкокортикоидов и минералкортикоидов в ходе беременности также возрастает. Однако, уровни ДГЭА и ДГЭА-С в сыворотке матери снижаются по мере увеличения срока беременности из-за их утилизации плацентой в качестве предшественников для синтеза эстрогенов (Гриф-фин Дж., Охеды С, 2008). Кортизол продуцируется и в надпочечниках плода и в плаценте, в связи с чем, концентрация кортизола в крови матери отражает состояние, как плода, так и плаценты (Савельева Г.М. и др., 2000). Содержание кортизола в крови при нормально протекающей беременности увеличивается (Arumugam R. е.а., 2008). При нормальном функционировании фетоп-лацентарного комплекса отклонение уровня кортизола от среднего значения, характерного для нормы при данном сроке беременности может составлять до 50%. При состоянии напряжения кортизол повышается более чем на 50%. При истощении ФПК концентрация кортизола снижается более чем на 50% (Зяблицев СВ. и др., 1998).
Повышение общего кортизола плазмы обусловлено главным образом одновременным повышением кортикостероидсвызывающего глобулина (КСГ), известного как транскортин. Продукция КСГ в плаценте может играть роль в увеличении материнского адренокортикотропного гормона и кортизола. Происходит небольшое повышение свободного кортизола плазмы и свободного кортизола мочи, но у беременных женщин какие-либо явные признаки гиперкортицизма не проявляются. Материнский кортизол слабо проходит через плаценту, поскольку он инактивируется в кортизон трофобластом (ферментом 11(3 -гидроксистероиддегидрогеназой типа 2) (Гриффин Дж., Охеды С, 2008).
Генетические маркеры системы гемостаза и патология беременности
Основными компонентами системы гемостаза являются сосудисто-тромбоцитарное звено; система свертывания крови; физиологические антикоагулянты и фибринолитическая система (Белязо О.Е. и др., 2000; Бокарев И.Н. и др., 2009). Патофизиология тромбообразования включает три связанных фактора: повреждение сосудистой стенки, замедление скорости кровотока, повышение свёртывания крови (Баркаган З.С., 1996). Система свертывания крови представляет собой каскад взаимосвязанных реакций, протекающих с участием протеолитических ферментов, ведущих к образованию тромбина - ключевог о компонента коагуляции, превращающего фибриноген в фибрин (рис. 3).
Нарушения, возникающие при недостаточном образовании фибрина или при неполноценности функционирования тромбоцитарного звена гемостаза, так же как и при избыточной активности плазмина или неполноценности функционирования компонентов сосудистой стенки, приводят к нарушению механизма гемостаза в целом. Данные нарушения - основная причина развития кровоточивости. Напротив, избыточное формирование фибрина из-за неполноценности антикоагулянтов или слабости фибринолитического звена, а также в сочетании с дефектами сосудистой стенки становится причиной избыточного внутрисосудистого свертывания крови, которое может приводить к нарушению проходимости сосудов или полной их окклюзии тромбо-тическими массами - развитию феномена тромбоза с соответствующими последствиями. Иногда наблюдаются сочетания тромботических и геморрагических проявлений (Рудакова B.C. и др., 2007; Бокарев И.Н. и др., 2009).
В крови имеется определённая группа факторов — фибринолитическая система (рис. 4), регулирующая интенсивность внутрисосудистого образования фибрина путём растворения его избыточного количества. Данная регуляция происходит за счёт действия протеолитического фермента плазмина (фибринолизина). Плазмин образуется из постоянно присутствующего в плазме белка плазминогена под действием активатора плазминогена. В крови имеются так же субстанции, ограничивающие действие активаторов плазминогена - ингибиторы активаторов плазминогена (РАІ-1, PAI-2) (Балуда В.П. и др.,1995; 1999).
Эндотелиальноподобные клетки трофобласта участвуют в поддержании внутрисосудистого гемо— и гомеостаза, поскольку экспрессируют целый ряд генов, участвующих как в регуляции свертывания крови (тромбомоду-лин, эндотелиальные рецепторы протеина С EPCR, ингибитор внешнего пути свертывания крови TFPI, аннексии V, активируемые протеазами рецепторы PARI, 2, 4), так и в регуляции сосудистого тонуса, процессов воспаления и взаимодействия клеток - лейкоцитов и тромбоцитов, как с эндотелием, так и между собой (Е-селектин, индуцируемая NO-синтетаза i-NOS, простацик-лин-синтетаза, циклооксигеназа—2 - СОХ-2) (Berry Е. е.а., 2003; Hewitt D. е.а., 2006).
Клетки трофобласта продуцируют основной инициатор свертывания крови - тканевой фактор TF независимо от степени дифференцировки трофобласта, и ингибиторы свертывания (TFPI и ТМ) — по мере дифференцировки стволовых клеток трофобласта в различные его производные. Экспрессия ТМ именно в плаценте, но не в эндотелии материнских сосудов, является необходимым условием для роста эмбриона.
Как на недифференцированных, так и на дифференцированных клетках трофобласта представлены рецепторы протеаз, PARI, PAR2 и PAR4, которые активируются после взаимодействия с тромбином. Тромбин может взаимо- действовать с PARI прямо или опосредованно через активированный протеин С. Активация PARI усиливает пролиферацию клеток трофобласта, в то время как активация PAR2 и PAR4 вызывает снижение пролиферации клеток трофобласта (Berry et al., 2003; Rodie et al., 2005). Процесс дифференцировки трофобласта сопровождается длительным экспонированием на наружную мембрану клеток отрицательно заряженных фосфолипидов, в частности, фосфатидилсерина, который является матрицей для активации протромби-назного комплекса и протромбина.
На ранних сроках беременности, на этапе слабой дифференцировки стволовых клеток превалируют прокоагуляционные свойства, в то время как позднее уже дифференцированные клетки трофобласта проявляют антикоа-гуляционные свойства.
Успех беременности во многом зависит от адекватной имплантации, трансформации спиральных артерий (в результате инвазии трофобласта) и плацентации с установлением полноценного кровотока в системе мать-плацента-плод. Данные этапы развития могут быть нарушены при тромботической тенденции и в случае генетических тромбофилий (Scifres СМ., Nelson D.M., 2009). После оплодотворения зигота активно делится, на 6-й день после овуляции происходит первый контакт образовавшейся бластоцисты с эпителием матки, на 7-й день начинается прикрепление и инвазия, эффективность которой во многом зависит от уровня прогестерона, поскольку гены, индуцированные данным гормоном, ответственны за адгезию трофобласта к эпителию эндометрия, а также участвуют в регуляции роста и дифференцировки зародыша (Spencer Т. е.а., 2008). Между 10 и 13-й днями после овуляции между пролиферирующими клетками трофобласта начинают образовываться лакуны, которые в дальнейшем будут увеличиваться, сливаться и преобразовываться в межворсинчатое пространство плаценты. Процесс инвазии трофобласта ведет к инвазии спиральных артерий, снабжающих межворсинчатое пространство. По мере замещения эндотелия и внутренней эластической мембраны клетками трофобласта артерии,с узким просветом постепенно превращаются в широкие синусоидальные сосуды (Радзинский В., Оразмурадов А., 2005). Эти изменения носят адаптивный характер, поскольку позволяют сформироваться относительно автономной системе с низким давлением и высокой скоростью кровотока, что обеспечивает адекватный приток крови к плоду.
Наиболее частыми цатологическими состояниями беременности являются ее самопроизвольное прерывание, гестозы, внутриутробная задержка развития плода, обусловленные нарушением формирования плаценты и развитием плацентарной недостаточности. На сегодня известно, что причиной развития акушерской патологии в 70-75% случаев являются наследственные и приобретенные аномалии гемостаза. Роль тромбогенных генетически обусловленных дефектов для развития синдрома привычной потери плода и нарушения репродуктивной функции изучена недостаточно (Николаева М. и др., 2008). По литературным данным (Bick R.L. е.а., 1998), наследственные тромбофилий среди причин привычной потери беременности составляют 10 30 %, и чаще встречаются у женщин с различными акушерскими и тромботическими осложнениями. Дефекты свертывания крови тромбофилического и геморрагического характера могут быть основной причиной как бесплодия, ранних преэмбрионических потерь, привычной потери беременности так и отягощенного течения беременности. В условиях генетически обусловленного гипофибринолиза, активации внутрисосудистого свертывания крови происходит десинхронизация процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. Это мешает адекватному внедрению оплодотворенной яйцеклетки в стенку матки на достаточную глубину (Баймурадова С. и др., 2008).
В условиях нормы система гемостаза находится в состоянии равновесия, обеспечиваемого слабой активацией коагуляционного каскада и активностью антикоагулянтной и фибринолитической систем, что предотвращает развитие спонтанных тромбозов. Беременность является состоянием, многократно увеличивающим риск венозных тромбозов. Даже при физиологически протекающей беременности, особенно в Ш триместре; наступает гиперкоагуляция, что в первую очередь связано с увеличением почти на 200% I, II, VIII, IX, X факторов свертывания крови в сочетании со снижением фибринолитической активности и естественной антикоагулянтной активности. Помимо этого, в III триместре скорость кровотока в венах нижних конечностей уменьшается наполовину, что обусловлено частично механической обструкцией беременной маткой венозного оттока, частично — снижением тонуса венозной стенки из-за гормональной перестройки организма во время беременности. Таким образом, тенденция к стазу крови в сочетании с гиперкоагуляцией при физиологической беременности предрасполагает при неблагоприятных условиях к развитию тромбозов и тромбоэмболии. А при предшествующей тромбофилии (генетической и/или приобретенной) риск тромбоэм-болических и акушерских осложнений во время беременности повышается в десятки и сотни раз.
Так как полноценное плацентарное кровообращение зависит от сбалансированного соотношения прокоагулянтных и антикоагулянтных механизмов, наследственные тромбофилии могут приводить не только к развитию тромбозов во время беременности и в послеродовом периоде, но и к различным плацентарным сосудистым осложнениям, следствием которых могут быть нарушение имплантации или развития зародыша (Grandone Е., Margag-lione М., 2003; Younis J.S., Samueloff А., 2003). К ним относят: выкидыши I и II триместров беременности, задержку внутриутробного развития плода, пре-эклампсию, внутриутробную гибель плода, отслойку нормально расположенной плаценты. Во многих публикациях подчеркивается ассоциация одних и тех же наследственных тромбофилических факторов у женщин с венозными тромбозами и с осложнениями беременности (DeAngelo А. е.а., 1997; Girling J., de Swiet M., 1998; Озолиня Л. и др., 2001; Brenner В., 2003; Rey Е. е.а., 2003). Генетические формы тромбофилии занимают одно из ведущих мест в акушерской патологии и обуславливают гестозы, преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты, неудачи экстракорпорального оплодотворения, синдром потери плода.
В качестве механизмов развития синдрома потери плода рассматривают нарушения с тенденцией к геморрагиям и нарушения с тромботической тенденцией. Геморрагические дефекты встречаются довольно редко. Они, как правило, связаны с нарушением образования фибрина, что препятствует адекватной имплантации оплодотворенной яйцеклетки в толщу эндометрия. К таким дефектам относятся дефицит фактора XIII, фактора X, фактора VII, фактора V, фактора II (протромбина), синдром фон Виллебрандта, дефекты фибриногена, гемофилия, а также дисфибриногенемии, связанные с геморра-гиями.
Фактор V свертывания крови является высокомолекулярным белком, входящим в состав протромбиназного комплекса. Протромбиназный комплекс возникает при активации свертывания крови и состоит из активированного фактора X, активированного фактора V и ионов кальция, связанных с фосфолипидными мембранами тромбоцитов. Функция протромбиназного комплекса заключается в отщеплении от молекулы протромбина пептидных фрагментов с образованием тромбина. На мембране клеток эндотелия тромбин соединяется с белком тромбомодулином и теряет способность участвовать в образовании фибрина. Комплекс тромбин/тромбомодулин активирует протеин С, отщепляя от него участок молекулы. Активированный протеин С расщепляет активированный фактор V и тем самым препятствует неуправляемому расширению процесса свертывания крови. Неспособность протеина С инактивировать протромбиназный комплекс характеризуется повышенной склонностью к тромбозам. Самой частой причиной такой резистентности является Лейденская мутация, когда активированный фактор V становится устойчивым к расщеплению активированным протеином С в результате замены аргинина на глютамин в позиции 506 (Bertina R.M. е.а., 1994).
Снижение скорости деградации фактора V приводит к повышению образования тромбина и снижает инактивацию активированного фактора VIII. К тому же, прокоагулянтное действие FV может опосредоваться через стит. муляцию активируемого тромбином ингибитора фибринолиза, что приводит в конечном итоге к повышенной устойчивости фибринового сгустка к деградации. Резистентность к активированному протеину С может быть и приобретенной, возникая во время беременности (Cumming A.M. е.а., 1995). При гипергомоцистеинемии также может возникать резистентность к активированному протеину С из-за ковалентного соединения гомоцистеина с активированным фактором V (Undas А. е.а., 2001).
Исследование региональных медиан биохимических маркеров развития плода, с целью совершенствования существующего пренатального скрининга
Пренатальная диагностики в России проводится для беременных женщин с целью профилактики наследственных и врожденных заболеваний у детей (приказ Минздрава России № 457 от 28.10.2000 г.). У всех беременных во втором триместре осуществляется забор проб крови для проведения исследования уровня сывороточных маркеров: АФП, ХГЧ, св. эстриола. По данным разных авторов, информативность «тройного теста», включающего определение альфа-фетопротеина, хорионического гонадотпропина и св. эстриола в сыворотке крови беременной во втором триместре в выявлении синдрома Дауна у плода составляет 60-70 % (Золотухина Т.В., Шилова Н.В.,2003; Ка-щеева Т.К., и др:, 2007; Кащеева Т.К., 2009). Для совершенствования метода и повышения его чувствительности мы сравнили два основных метода исследования пренатального скрининга — иммуноферментный и иммунофлуорис-центый, рассчитали региональные медианы, изучили размах их варьирования.
Для оценки уровня отклонения значений сывороточных маркеров используют относительные уровни их содержания, выраженные в единицах МоМ (Multiple of Median). Единицы МоМ показывают, во сколько раз измеренный уровень маркера выше (или ниже) значений медианы (нормы) для данного срока беременности. Медиана является средней в ряду упорядоченных по возрастанию значений уровня сывороточного маркера при нормальной беременности одного и того же срока гестации.
Проведенное исследование позволило определить понедельные медианы содержания АФП, ХГЧ и свободного эстриола в сыворотке беременных, проживающих в городах и районах Ростовской области.
Как видно из данных представленных в таблицах 6, 7 и на рисунке 7 значения региональных медиан, полученных при использовании иммуноферментного метода (табл. 6, рис. 7) и иммунофлуорисцентного (табл. 7) существенно выше, в среднем более чем на 10%, медиан предлагаемых изготовителями, на всех сроках развития плода. При этом обращено внимание, что на 16 и 17 неделях беременности зарегистрированы максимальные различия. Так, значение медианы, полученное для беременных на 16 неделе с использованием иммуноферментного метода выше на 22%, а на 17 — на 24%, и составило 40,47 МЕ/мл и 52,11 МЕ/мл соответственно.
Значения медиан содержания АФП, полученные с использование иммунофлуорисцентного метода (табл. 6, рис. 7) также достоверно отличались от медианы производителя (МП). На 16 неделе для беременных Ростовской области значение региональной медианы (MP) составило 34,86 МЕ/мл, что на 23% выше медианы производителя, а на 17 неделе - 39,1 МЕ/мл, что соответственно выше на 19%. Полученные результаты для 20 недели беременности статистически не отличались, что скорее всего обусловлено малой выборкой на данном сроке беременности.
Также были получены существенные различия между значениями понедельных медиан для Р-ХГЧ у беременных Ростовской области. При сравнении региональных значений медиан с нормами производителей - (табл. 8, рис. 8) выявлены более низкие показатели у беременных Ростовской области определяемые иммуноферментным методом. 3 арегистрировано отклонение региональных медиан от медиан производителя на 12-38 % практически на всех этапах развития плода, исключение составила 20-ой неделя, на которой зарегистрировано повышение значения медианы (21120±3588 МЕ/л) относительно 19-ой недели (18728±1428 МЕ/л).
Различия значений медиан P-free ХГЧ, выполненного с использованием иммунофлуорисцентного метода (табл. 9, рис. 8) были достоверными на 10% в сторону более низких значений для региональных медиан относительно; медиан производителя. Исключение составили медианы, для 19-ой и 20-ой недель беременности, где наблюдалось повышение уровня региональных медиан на 8 и 36% соответственно.
Определение понедельных медиан неконьюгированного эстриола у беременных Ростовской области, выполненного на тест-системах «DRG» им-муноферментным методом (табл. 10, рис. 9), выявило максимальное отклонение значений от медиан производителя при сроке беременности 15-20 недель, они были направлены в сторону снижения региональных медиан, на 14 неделе наблюдалось противоположное изменение — региональное значение медианы (1,62 нг/мл) превышало значение производителя (0,8 нг/мл) в два раза.
Значения региональных медиан для неконьюгированного эстриола, выполненного с использованием тест-систем «Delfia» имммунофлуорисцентым методом (табл. 11, рис. 9), превышают значения медиан, представленных производителем на всех сроках гестации на 6-40%.
Проведенный анализ полученных результатов показал существенные, в подавляющем большинстве статистически значимые различия региональных медиан сывороточных маркеров у беременных Ростовской области при сроке гестации 15-18 недель от представленных производителями тест-систем. Медианы, рассчитанные для 14, 19 и 20 недель требуют дальнейшей корректировки по мере увеличения обследованных беременных на этих сроках. Раннее данные о внедрении региональных медиан были получены для жительниц Санкт-Петербурга (Кащеева Т.К. и др., 2007).
Мы рекомендуем для жителей Ростовской области в целях совершенствования существующего пренатального скрининга сузить диапазон проведения биохимического скрининга с 14-20 недель до 15-18 недели беременности.
По данным разных авторов, информативность «тройного теста» в выявлении синдрома Дауна у плода составляет 60-70 %, при этом количество «ложноположительных» результатов составляет около 5% от числа обследованных (Золотухина T.B.,2003j Кащеева Т.К, и др. 2007). При отклонении медианы только одного маркера на 10% в сторону увеличивающую риск, доля беременных, отнесенных в группу риска; может возрасти на Г-2% соответственно, при использовании нескольких маркеров этот процент будет ещё выше (табл. 12). При использовании медиан с отклонением в сторону уменьшения риска будет падать эффективность биохимического скрининга, другими словами возрастет количество «ложноотрицательных» результатов. Допустимым отклонением является колебания медианы в диапазоне 5% от установленной величины (всего в пределах 10%).
Полученные результаты демонстрируют достоверную разницу региональных медиан от медиан производителя, при этом это разница не зависит от возраста беременных женщин, что является основанием для использования в дальнейшей практике биохимических прогностических маркеров региональные нормативные величин.
При расчете риска рождения ребенка с ДЗНТ с использованием региональных медиан количество беременных с ложноположительными результатами уменьшилось с 6,59 % до 2,57 % а для синдрома Эдвардса группа риска уменьшилась на 10 % от общего числа обследованных - с 22,49 % до 12,22 % — т.е. практически в 2 раза. Другая динамика изменений при введении региональных норм наблюдается при синдроме Дауна, группа риска расширилась с 4,06% до 11,9%.
При введении региональных медиан для сывороточных белков крови женщин Ростовской области, используемых в пренатальной диагностике ВПР и ХА во втором триместре беременности, снизилось количество ложно-положительных результатов по риску рождения ребенка с синдромом Эдвар-дса и ДЗНТ, при этом не было выявлено ложноотрицательных результатов для этих патологий. Можно сказать, что эффективность скрининга на синдром Эдвардса и ДЗНТ при переходе на региональные медианы повысилась, однако, что касается скрининга на синдром Дауна — это не так: с одной стороны повысилась чувствительность скрининга на синдром Дауна, с другой — увеличилось количество ложноположительных результатов, относящих беременных в группу риска по данной патологии плода. Все это лишний раз демонстрирует низкую специфичность маркеров, используемых в современной пренатальной диагностике.
Исследование частот полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови при невынашивании беременности
Причины потери беременности многообразны. Одной из ведущих причин невынашивания беременности, особенно на ранних сроках, являются генетические факторы. Начиная с середины XX века основной наследственной причиной невынашивания беременности и бесплодия считались хромосомные мутации, которые регистрировали у 70 % абортусов ранних стадий развития (Баранов, 2007). В настоящее время установлено, что синдром потери плода обуславливается не только хромосомными аномалиями, но и генными мутациями, а также наличием полиморфных аллелей генов, активно функционирующих в период гестации. Эти гены можно условно разделить на несколько функциональных групп, каждая из которых является самостоятельной генной сетью. Основными группами генов являются: гены системы де-токсикации ксенобиотиков, гены фолатного цикла, гены факторов свертывающей системы крови и факторов, контролирующих функцию эндотелия, гены факторов роста хориона и плаценты, гены метаболизма гормонов, а также гены факторов иммунной системы.
Нами был проведен анализ частот полиморфных аллелей некоторых генов факторов свертывающей системы крови у женщин из двух групп: контрольной и группы женщин с синдромом потери плода. Носительство полиморфных аллелей генов фибринолитической системы может сопровождаться гиперкоагуляцией, тромбообразованием в ранних сосудах плаценты, приводить к нарушению жизнедеятельности имплантировавшегося плодного яйца.
Частоты генотипов исследуемых генов среди женщин двух групп представлены в таблице 16. Частоты генотипов по полиморфному аллелю Leu33Pro гена (33-субъединицы тромбоцитарного рецептора фибриногена в контрольной группе и среди женщин с потерей беременности практически одинаковы: преобладают гомозиготы по нормальному аллелю, гомозигот по полиморфному аллелю не выявлено. В то же время среди женщин с невынашиванием беременности около 11 % являются гомозиготами по полиморфному аллелю 807Т гена а2-субъединицы тромбоцитарного рецептора фибриногена. Однако статистически частоты генотипов по данному полиморфному аллелю гена ITGA2 в двух сравниваемых группах не отличаются (табл. 16). Не выявлено статистически значимых отличий и для гена ингибитора активатора плазминогена 1, несмотря на то, что доля гомозигот по полиморфному аллелю 4G среди женщин с невынашиванием беременности почти в 2 раза выше по сравнению с контрольной группой. Распределение частот генотипов гена фактора F VII и гена фибриногена одинаково в исследуемых группах — значительно преобладают гомозиготы по нормальным аллелям; гомозигот по полиморфным аллелям не выявлено.
Частоты генотипов исследуемых генов в эмбриональных тканях представлены в таблице 17. Распределение частот генотипов по генам ITGB3, IT-GA2, F VII у эмбрионов при нормально протекающей беременности и в случае потери беременности одинаковы. Однако среди погибших эмбрионов 31 % являются гомозиготами по полиморфному аллелю гена ингибитора активатора плазминогена PAI 1, в то время как в контрольной группе данный генотип не зафиксирован. Однако частота носителей полиморфного аллеля -455А гена фибриногена в гомо- и гетерозиготном состоянии выше в контрольной группе.
Известно, что при гетерозиготном носительство полиморфного аллеля 5G/4G гена PAI 1 в 2 раза повышается риск развития осложнений беременности, так как данный полиморфный аллель наследуется по аутосомно-доминантному типу. В случае гомозиготы по полиморфному аллелю 4G риск повышается в 4 раза по сравнению с вариантом нормы (5G/5G) (YamadaN. et al., 2000). Аллель 4G ассоциирован с повышенной продукцией ингибитора активатора плазминогена 1, что приводит к ингибированию процессов фиб-ринолиза. Фибринолиз необходим не только для лизиса тромбов, но и для деградации коллагена и процессов ангиогенеза. Повышение доли гомозигот 4G по гену PAI 1 как среди женщин, так и эмбрионов может тормозить фибринолиз, снижать степень инвазии трофобласта, интенсивность маточно-плацентарного кровотока, а, следовательно, повышать риск нарушения формирования и функционирования плаценты и невынашивания беременности (Engelmann et al., 2003).
Частоты исследуемых аллелей у матерей представлены на рисунке 14. Частота полиморфного аллеля ЗЗРго гена ITGB3 практически одинакова среди женщин двух групп. Наибольшей частотой в обеих группах характеризуется полиморфный аллель 4G гена ингибитора активатора плазминогена 1. Реже всего регистрируется полиморфный аллель -455А гена фибриногена. При этом в контроле частота данного аллеля более чем в 2 раза ниже по сравнению с группой женщин с невынашиванием беременности. Однако все выявленные различия между частотами аллелей в двух группах являются статистически не достоверными, возможно, из-за объема выборки.
Общий характер распределения частот аллелей у эмбрионов сходен с таковым материнским. Однако необходимо отметить, что среди погибших эмбрионов частота полиморфного аллеля 4G гена PAI 1 в 1,4 раза выше, а частота полиморфного аллеля -455А гена FGB в 2,4 раза ниже по сравнению с контролем (рис. 15, рис. 16).
При сочетанном анализе носительства полиморфных аллелей установлено, что как среди матерей, так и среди эмбрионов в контрольной группе преобладают носители 1-3 полиморфных аллелей пяти исследуемых генов (рис. 17). При невынашивании беременности, как среди женщин, так и среди эмбрионов снижается доля носителей одного полиморфного аллеля. Среди женщин 28,6 % составляют носители 4 полиморфных аллелей. Среди погибших эмбрионов 21,4 % были носителями 4 полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови.
Сочетанный анализ генотипов показывает, что у женщин с невынашиванием беременности преобладают лица гетерозиготные одновременно по трем генам - РЗ -субъединицы и а2-субъединицы тромбоцитарного рецептора фибриногена и ингибитора активатора плазминогена. При таком генотипе повышенная склонность тромбоцитов к агрегации сочетается с возможным снижением активности процессов фибринолиза, что увеличивает риск тром-бообразования. С такой же частотой встречаются женщины, гетерозиготные по гену ингибитора активатора плазминогена и гену фибриногена, а также лица гомозиготные по аллелю 4G гена РАІ 1 при одновременном гетерозиготном носительстве полиморфного аллеля С807Т гена ITGA2 (рис. 18). В контрольной группе женщин не выявлено носительниц полиморфных аллелей, одновременно по четырем генам, в то время как среди женщин с невынашиванием беременности данный показатель составил 7,1 %. В группе с невынашиванием беременности 17,8 % женщин были гетерозиготами по полиморфному аллелю двух исследуемых генов и гомозиготой по полиморфному аллелю третьего гена (как правило, гена ингибитора активатора плазминоге-на).
В генотипе неразвивающихся (летальных) эмбрионов чаще всего встречается сочетание гетерозиготного носительства полиморфных аллелей генов субъединиц тромбоцитарного рецептора фибриногена; полиморфного аллеля гена а2-субъединицы тромбоцитарного рецептора фибриногена и ингибитора активатора плазминогена (в гетерозиготном или гомозиготном состоянии). В целом, в 65,5 % случаев эмбрион имеет полиморфные аллели как гена PAI 1, так и одного или обоих генов субъединиц тромбоцитарного рецептора фибриногена.
На ранних сроках беременности, на этапе слабой дифференцировки клеток превалируют прокоагуляционные процессы, которые необходимы для имплантации оплодотворенной яйцеклетки-в слизистую оболочку матки. При подготовке к имплантации под влиянием прогестерона в эндометрии повышается уровень ингибитора активатора плазминогена 1 при одновременном снижении содержания активатора плазминогена (Karmakar, Das, 2002). Эмбрион может синтезировать активаторы плазминогена, которые необходимы для разрушения экстрацеллюлярного матрикса в процессе имплантации (Lockwood et al., 1999). Процесс коагуляции в зоне имплантации скоординировано регулируется факторами свертывающей системы крови матери и факторами, синтезируемыми клетками трофобласта, что определяется генотипом плода (Sood, 2009).
В нашем случае, судя по материнским генотипам, активность ингибитора активатора плазминогена 1 и уровень фибриногена сходен у женщин обеих групп. Однако анализ генотипов эмбрионов показывает, что при нормальном содержании ингибитора активатора плазминогена 1 у эмбрионов контрольной группы возможен повышенный уровень фибриногена, что обеспечивает осуществление имплантации при физиологически протекающей беременности. В то же время у погибших эмбрионов повышение содержания ингибитора активатора плазминогена 1, обусловленное генотипом, сочетается с нормальным уровнем фибриногена. Можно предположить, что в данном случае происходит чрезмерное тромбообразование, нарушение имплантации и кровоснабжения формирующейся плаценты.
