Содержание к диссертации
Введение
Перечень использованных сокращений и терминов 5
Введение 7
1. Обзор литературы. Эпигенетические, молекулярно-генетические и биохимические аспекты развития нарушений эмбриогенеза человека 14
1.1. Обзор патологических процессов, сопряженных с нарушениями эмбрионального развития человека 14
1.1.1. Комплекс состояний материнского организма, представляющих угрозу внутриутробному развитию плода 15
1.1.2. Гипергомоцистеинемия как фактор риска развития нарушений эмбриогенеза человека 21
1.1.3. Патология плаценты, сопутствующая нарушениям раннего онтогенеза человека 26
1.2. Обзор диагностических маркеров патологии раннего онтогенеза человека 31
1.2.1. Биохимические показатели в оценке развития плода 31
1.2.2. Молекулярно-генетические маркеры в диагностике состояния плода 36
1.2.3. Эпигенетические факторы в оценке состояния плода 50
2. Материал и методы исследования 54
2.1. Материал исследования 54
2.1.1. Материал для биохимических исследований 54
2.1.2. Материал для молекулярно-генетических исследований 55
2.1.3. Материал для эпигенетических исследований 56
2.2. Методы исследований 56
2.2.1. Иммуноферментный анализ концентрации гомоцистеина в сыворотке крови 56
2.2.2. Микробиологический тест определения содержания фолиевой кислоты в крови 57
2.2.3. Молекулярно-генетические методы исследований полиморфизмов генов фолатного обмена 57
2.2.4. Эпигенетические методы исследования уровня метилирования генов 59
2.2.5. Статистические методы 65
2.2.6. Контроль качества проводимых исследований 68
3. Результаты и их обсуждение 69
3.1. Результаты исследования биохимических и молекулярно-генетических показателей фолатного обмена при различном течении эмбриогенеза человека 69
3.1.1. Определение диапазонов содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты у небеременных и беременных женщин Ростовской области 70
3.1.2. Изучение роли гомоцистеина и фолиевой кислоты в развитии широкого спектра нарушений раннего онтогенеза человека 76
3.1.3. Определение частот аллелей и генотипов генов фолатного обмена у представительниц ростовской популяции 82
3.1.4. Оценка роли совокупного присутствия аномальных биохимических показателей и полиморфизмов генов фолатного обмена в развитии нарушений эмбриогенеза человека 85
3.2. Результаты исследования уровней метилирования плацентарных генов при различном течении эмбриогенеза человека 88
3.2.1. Оценка степени контаминации образцов тканей 91
3.2.2. Статус метилирования генов, вовлеченных в процессы развития и формирования плаценты, в хорионической и децидуальной тканях 93
3.2.3. Результаты исследования уровня глобального метилирования ДНК в хорионической и децидуальной тканях 101
3.2.4. Статус метилирования генов, вовлеченных в процессы развития и формирования плаценты, и уровень глобального метилирования ДНК в крови 102
3.2.5. Результаты глубокого бисульфитного секвенирования исследуемых генов в плацентарных тканях 104
Заключение 107
Выводы 109
Практические рекомендации 110
Список использованных источников 112
Приложение 144
- Гипергомоцистеинемия как фактор риска развития нарушений эмбриогенеза человека
- Молекулярно-генетические маркеры в диагностике состояния плода
- Эпигенетические методы исследования уровня метилирования генов
- Изучение роли гомоцистеина и фолиевой кислоты в развитии широкого спектра нарушений раннего онтогенеза человека
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди важнейших задач эмбриологии человека одной из первых является изучение механизмов регуляции эмбриогенеза человека, а также поиск причин и диагностических маркеров его нарушений. Высокая частота патологии развития и внутриутробной гибели плода, на сегодняшний день не имеющая тенденции к снижению, обуславливает актуальность и значимость рассматриваемой проблемы. Статистико-популяционные исследования, посвященные поиску этиологических и диагностических биохимических и молекулярно-генетических факторов осложнений эмбриогенеза человека, ведутся с середины прошлого века. Тем не менее, процент нарушений эмбрионального развития человека невыясненной этиологии пока остается достаточно высоким (Бочков Н.П., 2006).
На настоящий момент по результатам многочисленных работ накоплен большой массив клинических данных, которые позволяют выделить аномальное содержание гомоцистеина, а также ассоциированные с ним недостаток фолиевой кислоты и полиморфизмы генов фолатного цикла, в отдельную группу причин, вызывающих различные нарушения репродуктивного здоровья человека (Brustolin S., 2010, Мирошниченко И.И., 2009, Бицадзе В.О., 2008). Не так давно было отмечено существование этнических, межпопуляционных, а также межрегиональных различий содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты (Refsum H., 2004). Таким образом, для повышения качества и чувствительности диагностических мероприятий по выявлению нарушений эмбриогенеза необходимо изучение диапазонов содержания биохимических показателей, а также частот встречаемости мутантных аллелей генов фолатного метаболизма у жителей каждого отдельного региона страны.
Наряду с биохимическими и молекулярно-генетическими факторами растущий интерес представляют аберрантные эпигенетические процессы, приводящие к патологическому эмбриональному развитию человека (Yu L. et al., 2009, Diplas A.I. et al., 2009, Novakovic B. et al., 2008). Известно, что в реализации эпигенетической программы, а именно в процессе метилирования ДНК, опосредованное участие принимает гомоцистеин в качестве донора метильных групп (La Merrill M. et al., 2011, Van der Put N.M. et al., 2001). Поэтому особого внимания заслуживает сопряженное исследование нарушенных эпигенетических механизмов регуляции эмбриогенеза человека и несоответствующих норме молекулярно-генетических и биохимических показателей фолатного обмена в патогенезе эмбрионального развития человека как одной из перспективных и актуальных задач эмбриологии человека.
Цель работы: исследование эпигенетических, молекулярно-генетических и биохимических критериев нарушений эмбриогенеза человека.
Задачи исследования.
1. Установить диапазоны содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты в сыворотке крови небеременных и беременных женщин Ростовской области при физиологическом течении гестационного процесса.
2. Оценить роль гомоцистеина и фолиевой кислоты в развитии широкого спектра нарушений раннего онтогенеза человека (спонтанный аборт, неразвивающаяся беременность, истмико-цервикальная недостаточность, гестоз).
3. Провести сравнительный анализ распределения отдельного и сочетанного носительства аллельных вариантов и генотипов генов фолатного обмена (MTHFR, MTRR, MTR) у беременных женщин ростовской популяции и изучить вклад полиморфных состояний генов фолатного обмена в развитие различного рода нарушений эмбриогенеза человека (спонтанный аборт, неразвивающаяся беременность).
4. Выяснить паттерн метилирования генов ERVWE1, ERVFRDE1, AREG, BTC, DKK1, HAND1 и MLH1 в плацентарных тканях в выборке женщин с физиологическим течением гестационного процесса и при наличии нарушений эмбрионального развития человека (спонтанный аборт, неразвивающаяся беременность).
5. Измерить глобальный уровень метилирования геномной ДНК в плацентарных тканях путем исследования статуса метилирования LINE1 элементов и HERVK.
Научная новизна работы. Впервые установлены диапазоны содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты в сыворотке крови небеременных и беременных женщин Ростовской области по триместрам. Впервые определена частота встречаемости аллелей 677T, 2756G и 66G генов MTHFR, MTR, MTRR соответственно у представительниц ростовской популяции и их прогностическая и клинико-диагностическая значимость в развитии широкого спектра нарушений эмбриогенеза человека. Впервые проведена комплексная оценка содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты в сыворотке крови беременных женщин Ростовской области, наличия полиморфизмов генов фолатного обмена и уровня глобального метилирования ДНК.
Впервые установлены уровни метилирования промоторных и отдельных внутригенных регионов генов AREG, BTC, DKK1, HAND1, MLH1, ERVWE1, ERVFRDE1, HERVK и LINE1 в плацентарных тканях на ранних этапах эмбрионального развития. Впервые обнаружено тканеспецифическое метилирование внутригенных регионов, т.е. интронов и экзонов, генов AREG и BTC в децидуальной и хорионической тканях плаценты. Впервые подтверждена роль экзона 2 в качестве альтернативного промотора гена AREG и показана его активность в плодной части плаценты, регулируемая с помощью метилирования. Впервые путем исследования статуса метилирования LINE1 элементов и HERVK показано, что глобальный уровень метилирования геномной ДНК в хорионической ткани ниже, чем децидуальной.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Установленные диапазоны содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты для женщин Ростовской области повысили качество диагностики и прогнозирования репродуктивных потерь, ассоциированных с несоответствующими норме биохимическими критериями фолатного обмена.
2. Среди широкого спектра нарушений эмбриогенеза человека повышенный уровень гомоцистеина является достоверным фактором риска и диагностическим маркером гестоза, так как было установлено, что в III триместре беременности повышенный уровень гомоцистеина в сыворотке крови женщин ростовской популяции увеличивает риск развития гестоза в 13,5 раз.
4. Сравнительный анализ вычисленных частот распространения аллелей 677T MTHFR, 2756G MTR и 66G MTRR у женщин с физиологически протекающей беременностью и эмбриональной потерей плода позволил установить группы риска по развитию осложнений репродуктивного здоровья и повысил точность прогнозирования нарушений эмбриогенеза человека, сопряженных с носительством полиморфизмов генов фолатного обмена.
5. Риск потери беременности ассоциирован с носительством полиморфизмов генов С677T MTHFR и A66G MTRR; неразвивающаяся беременность – с носительством патологического аллеля 2756G гена MTR в гомозиготном состоянии.
6. Установленные уровни тканеспецифического метилирования регионов экзона 2 гена AREG, интронов 2 и 4 гена BTC, 5`LTR генов ERVWE1 и ERVFRDE1, LTR HERVK и 5`UTR LINE1 являются потенциальными маркерами в оценке процессов формирования и функционирования плаценты, и могут быть использованы для установления эпигенетических причин возникновения различных нарушения эмбриогенеза.
Теоретическое и практическое значение работы. Научно-теоретическая значимость исследования заключается в раскрытии новых причин, а также в уточнении параметров уже установленных факторов риска, прямо или косвенно обуславливающих нарушения эмбрионального развития человека. Результаты настоящей работы расширяют имеющиеся знания об эпигенетических механизмах регуляции раннего онтогенеза человека и выяснения паттерна метилирования специфических генов плаценты при физиологически протекающей беременности. Имея теоретическое представление об эпигенетической модели регуляции экспрессии генов в норме, на практике легко обнаружить несоответствие установленному паттерну метилирования и диагностировать наличие нарушения эмбриогенеза человека.
В практическом смысле полученные диапазоны содержания гомоцистеина и фолиевой кислоты в сыворотке крови беременных женщин Ростовской области позволили оптимизировать и повысить качество прогностических и диагностических мероприятий по выявлению осложнений течения беременности и конкретных форм патологии эмбриогенеза человека, ассоциированных с отклонениями от нормы показателей фолатного метаболизма. Полученные сведения о частотах неблагоприятных аллелей генов MTHFR, MTR и MTRR в ростовской популяции предоставили возможность с более высокой точностью устанавливать риск развития нарушений эмбриогенеза человека, опосредованных наличием полиморфизмов генов фолатного обмена. Данные эпигенетических исследований могут быть использованы в ходе дальнейшего изучения наследования эпигенетического паттерна, а также имеют практический смысл для раскрытия эпигенетических механизмов возникновения различных нарушения эмбриогенеза.
Полученные в работе новые экспериментальные данные внедрены в лабораторную и практическую деятельность КДЛ «Наука» и «Центра репродукции человека и ЭКО», а также используются при чтении лекций в общем курсе «Биология развития и размножения» и специальных курсах «Предиктивная медицина», «Медицинская генетика» и «Тератология».
Работа выполнена в рамках тематического плана научно-исследовательских работ НИИ биологии ЮФУ «Исследование прогностических геномных и постгеномных маркеров эмбрионального развития человека», в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009 – 2013» по теме «Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров», государственный контракт № 02.740.11.0501, а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2010 – 2013» по теме «Создание биоинформационной технологии поиска взаимосвязанных сценариев организации в геномах животных и человека некодирующей ДНК и кодирующей белок ДНК», государственный контракт № 14.740.11.0006, на базе ФЦП МОН РФ Центра коллективного пользования научным оборудованием Южного федерального университета «Высокие технологии», государственный контракт № 16.552.11.7024 и ЦКП ЮФУ «Биотехнология, биомедицина и экологический мониторинг».
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета ЮФУ (Ростов-на-Дону, 2008-2010 гг.); на II международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); на заседании кафедры генетики Университета земель Саар (Саарбрюкен, Германия, 2010); на заседании Ростовского отделения общества ВОГиС (Ростов-на-Дону, 2011); на IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 17 работ, в том числе 4 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 42 отечественных и 246 зарубежных источника, приложения. Работа содержит 22 таблицы, иллюстрирована 19 рисунками.
Гипергомоцистеинемия как фактор риска развития нарушений эмбриогенеза человека
Еще одним распространенным осложнением беременности, приводящим к нарушению эмбрионального развития, является гипергомоцистеинемия. Гипергомоцистеинемия - это патологическое состояние организма, проявляющееся повышенной концентрацией гомоцистеина в крови и связанное с вовлечением генетических и негенетических механизмов (McCully K.S., 1969). Гомоцистеин это серосодержащая аминокислота, образующаяся в процессе метаболизма незаменимой аминокислоты метионина (DuVigneaud V., 1952). Поступая в организм с пищей, метионин преобразуется в S-аденозилметионин (SAM) при участии фермента метионинаденозилтрансферазы. В дальнейшем в результате реакции метилирования, осуществляемой метилтрансферазами, и реакции гидролиза посредством S-аденозилгомоцистеингидролазы SAM превращается в гомоцистеин и аденозин. Этот каскад ферментативных реакций, обозначаемый как трансметилирование, происходит почти в каждой клетке человеческого организма (Finkelstein J.D., 2000). &4М-зависимые реакции трансметилирования важны для таких жизненно важных клеточных процессов, как метилирование нуклеиновых кислот, протеинов и фосфолипидов (Cheng X., 1995).
В плазме крови гомоцистеин присутствует в трех состояниях (рис. 2):
- свободный (восстановленный) - 1 - 2 %;
- окисленный (в виде смешанного дисульфида цистеинилгомоцистеина и гомоцистина) - около 20 %;
- связанный с белками плазмы крови (в основном с альбумином, образуя дисульфидную связь с цистеином-34) - примерно 80 % (Мирошниченко И.И., 2009).
Метаболизм гомоцистеина может осуществляться двумя путями: реметилированием в метионин и транссульфацией в цистатионин (рис. 3). В биотрансформации гомоцистеина принимают участие следующие ферменты: метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) и цистатион-Р-синтетаза (CBS). Помимо ферментов, важную роль в метаболизме гомоцистеина выполняют витамины В6, В12 и фолиевая кислота (Finkelstein J.D., 2000).
В случае реметилирования гомоцистеин трансформируется в метионин с помощью метионинсинтазы {MTR), использующей в качестве донора метильной группы 5-метилтетрагидрофолат. Этот путь метаболизма гомоцистеина распространен повсеместно в организме человека, в основном в клетках печени. Кроме того, под действием CBS гомоцистеин может превращаться в цистатионин, который разрушается цистатионин-у-лиазой до цистеина и а-кетобутирата. Эта серия реакций происходит в печени, почках, тонком кишечнике и поджелудочной железе (Мирошниченко И.И., 2009).
При фолат-дефицитных состояниях наблюдается нарушение превращения гомоцистеина в метионин и цистеин, что приводит к его накоплению в плазме крови и выделению с мочой. В норме уровень гомоцистеина в плазме крови составляет 5-15 мкмоль/л. Концентрация гомоцистеина в плазме крови в пределах 15-30 мкмоль/л свидетельствует об умеренной гипергомоцистеинемии, от 30 до 100 мкмоль/л — о промежуточной, а более 100 мкмоль/л — о тяжелой. Во время беременности в норме концентрация гомоцистеина в крови понижается на 50 - 60 %. Возможными причинами снижения концентрации гомоцистеина является гемодилюция, повышение синтеза стероидов, а также потребление метионина и гомоцистеина растущим плодом (Бицадзе В.О., 2008).
В настоящее время известно, что повышению уровня гомоцистеина в крови способствует ряд факторов. Основными причинами гипергомоцистеинемии являются:
- генетические дефекты ферментов, обеспечивающих процессы обмена гомоцистеина (5,10 -метилентетрагидрофолатредуктазы, метионинсинтазы редуктазы и метионинсинтазы) (Фетисова И.Н., 2007);
- дефицит витаминов В6, В12 и фолиевой кислоты (Бицадзе В.О., 2008, Allen L.H., 2008);
- вегетарианство (Allen L.H., 2008);
- курение (Okumura К. et al., 2011);
- чрезмерное употребление кофе и алкоголя (Chrysohoou С. et al.,2004);
- нарушения функции почек (Ferechide D. et al., 2009).
Патофизиологическое действие гомоцистеина связано с эндотелиальными нарушениями. В плазме крови гомоцистеин является источником продукции смеси дисульфидов и тиолактона гомоцистеина. Данные соединения способствуют повреждению эндотелия, что приводит к обнажению субэндотелиального матрикса и гладкомышечных клеток. Тиолактон гомоцистеина, соединяясь с липопротеинами низкой плотности, захватывается близлежащими макрофагами, которые объединяются в так называемые «пенистые клетки» внутри зарождающейся атеромной бляшки. Кроме того, гомоцистеин является сильным мутагеном для гладкомышечных клеток, вызывая их усиленную пролиферацию, тем самым специфически участвуя в развитии атеросклероза (Tsai J.C. et al., 1996).
При избыточном содержании гомоцистеина наблюдается повышенная активации Va фактора, за счет увеличения резистентности данного фактора к активированному протеину С, ингибитору внешнего пути свертывания крови (Undas A. et al., 2001). Наряду с этим, происходит повышенная агрегация тромбоцитов вследствие снижения синтеза эндотелием релаксирующего фактора и оксида азота, а также усиленного высвобождения поврежденными эндотелиоцитами фактора Виллебрандта. Обозначенные атерогенные и тромбофилические эффекты в совокупности определяют хроническую эндотелиальную дисфункцию при гипергомоцистеинемии (Tsai J.C. et al, 1996).
При беременности гомоцистеин свободно проникает через плацентарный барьер и может оказывать тератогенное и фетотоксическое действие. Предполагается, что гипергомоцистеинемия является одной из причин анэнцефалии и незаращения костномозгового канала {spina bifida) (Nelen W.L., 2001, Steegersheunissen R.P. et al, 1991). Анэнцефалия приводит к стопроцентной летальности, a spina bifida — к развитию серьезных неврологических проблем у ребенка, включая моторный паралич, пожизненную инвалидность и преждевременную смерть. Гомоцистеин оказывает прямое токсическое действие на нервную систему плода (Бицадзе В.О., 2008).
На более поздних сроках беременности гипергомоцистеинемия является одной из возможных причин развития хронической фетоплацентарной недостаточности, и как следствие - внутриутробной гипоксии и гипотрофии плода. В частности, в исследовании Линдблад и соавторов у женщин из Южной Азии риск появления внутриутробной задержки роста плода был выше в присутствии в материнской и пуповинной крови низкой концентрации фолата и высокого содержания гомоцистеина (Lindblad В. et al, 2005).
Повышенное содержание гомоцистеина в крови может сопровождаться развитием вторичных аутоиммунных реакций, и в настоящее время рассматривается как одна из возможных причин антифосфолипидного синдрома (Мирошниченко И.И., 2009). Таким образом, своевременное выявление повышенного содержания гомоцистеина в плазме крови беременных женщин может способствовать снижению риска осложнений, как у матери, так и у ребенка.
Перечисленные выше патологические состояния материнского организма, сопутствующие гестационному процессу, составляют далеко не полный список осложнений беременности. Однако они относятся к наиболее первостепенным и распространенным расстройствам, ведущим к нарушению гомеостаза в подсистеме мать-плацента-плод. Понимание патогенеза беременности несомненно важный этап поиска высокоспецифичных и прогностически значимых биомаркеров для оценки состояния плода.
Молекулярно-генетические маркеры в диагностике состояния плода
Молекулярно-генетический анализ - это единственная на сегодняшний день возможность выявить генетическую предрасположенность к различным болезням задолго до их возникновения, учитывая тот факт, что его можно проводить на любой стадии онтогенеза. Генетическое исследование - это прогнозирование заболеваний с целью их предупреждения, а не диагностика уже имеющихся болезней. В основе пренатального молекулярно генетического анализа лежит обнаружение полиморфизмов генов, предрасполагающих к той или иной патологии эмбрионального развития человека. Основной формой генетического полиморфизма является однонуклеотидный полиморфизм, при котором варианты последовательностей ДНК в определенном локусе у разных людей различаются по одной паре нуклеотидов.
Наиболее диагностируемыми и значимыми полиморфными вариантами генов в оценке состояния плода являются полиморфизмы генов гемостаза, тонуса сосудов, системы детоксикации, воспалительного и иммунного ответа (гены цитокинов и главного комплекса гистосовместимости). В случае носительства данных полиморфизмов риск развития осложнений в системе мать-плод потенциально повышен.
Среди генов гемостаза в отношении расстройств беременности особое внимание заслуживают гены MTHFR, MTRR, MTR, протромбина (FII), фактора V (FV, лейденская мутация), ингибитора активатора плазминогена I (РАІ-І), фибриногена (FGB), тромбоцитарного гликопротеина (Gp-IIIa).
Метилентетрагидрофолатредуктаза считается ключевым ферментом фолатного цикла, ответственным за трансформацию фолиевой кислоты в ее активную форму 5-метилтетрагидрофолат. Ген MTHFR локализуется на коротком плече хромосомы 1 (ІрЗб.З) и состоит из 11 экзонов (Miyaki К., 2010). Считается, что из всех аллельных вариантов этого гена практическое значение имеют два полиморфизма, вызывающие тяжелую недостаточность фермента: С677Т в экзоне 4 и А1298С в экзоне 7 (Brustolin S. et al., 2010). Миссенс-мутация С677Т, связанная с аминокислотной заменой аланина на валин (p.Ala222Val), приводит к снижению активности фермента у гомозигот и гетерозигот по полиморфному аллелю на 70 % и 35 % соответственно (Alessio А.С. et al., 2004, Weisberg I. et al., 1998). Около половины населения планеты является гетерозиготными носителями аллеля 677Т, частота гомозигот (677Т/Т MTHFR) составляет от 1 до 20 % в зависимости от популяции (Botto L.D. et al., 2000).
Кроме С677Т полиморфизма еще одним распространенным полиморфизмом в этом гене является транзиция А1298С, приводящая к замене глутаминовой кислоты на аланин в регуляторном домене фермента. Хотя эта мутация снижает активность фермента в меньшей мере, чем С677Т, при совокупном носительстве обоих мутантных аллелей в гетерозиготном состоянии (генотип 677СТ/1298АС) отмечается снижение активности фермента на 40 - 50 % и наблюдается биохимический профиль, схожий с профилем гомозиготных носителей аллеля 677Т (van der Put N.M. et al., 1998, Weisberg I. et al, 1998).
Ферментом, непосредственно осуществляющим реметилирование гомоцистеина, является 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин S-метилтрансфераза (метионинсинтаза, MTR). Активность фермента напрямую зависит от присутствия метилкобаламина или витамина В12. В гене этого белка также было описано несколько мутаций и полиморфизмов, снижающих его активность. Полиморфизм гена MTR A2756G приводит к замене аспарагиновой кислоты на глицин в белковой цепи (p.Asp919Gly). В результате этой замены функциональная активность фермента изменяется, вследствие чего повышается риск развития осложнений внутриутробного развития плода. Влияние полиморфизма усугубляется повышенным уровнем гомоцистеина (Bosco P. et al., 2003).
Для восстановления функции метионинсинтазы необходимо дополнительное метилирование с помощью фермента метионинсинтазы редуктазы (MTRR). Метионинсинтаза редуктаза участвует в большом количестве биохимических реакций, связанных с переносом метильной группы. Полиморфизм A66G (p.Ile22Met) в гене MTRR в 4 раза снижает активность фермента и приводит к развитию некоторых форм патологии, вызванных накоплением гомоцистеина в плазме (Hobbs С.А. et al., 2000, Leclerc D. et al., 1998).
Полиморфизмы генов фолатного обмена {MTHFR, MTR, MTRR) обуславливают сниженную активность ферментов, что служит основанием избыточного накопления гомоцистеина в крови и нарушения процессов метилирования в клетке (Cheng X., 1995). Гипергомоцистеинемия, как уже отмечалось выше, является причиной образования тромбов и дефектов микроциркуляции в тканях, в том числе в стенках матки и плаценте, следствием чего могут являться осложнения на ранних (дефекты имплантации эмбриона, привычное невынашивание беременности) и на поздних этапах эмбрионального развития (хроническая плацентарная недостаточность, задержка роста плода, гибель плода) (Kupferminc М J. et al., 1999, Ananth C.V. et al., 2007, Rodriguez-Guillen Mdel R. et al., 2009). Кроме того, гомоцистеин свободно переходит через плаценту и может оказывать прямое эмбриотоксическое действие. Гипергомоцистеинемия является фактором риска таких тяжелых и летальных неврологических расстройств, как незаращение костномозгового канала {spina bifida) и анэнцефалия, а также незаращение верхней губы и неба (Shaw G.M. et al., 2009, Botto L.D. et al., 2000). Снижение метилирования в клетке, связанное с недостаточной активностью ферментов фолатного обмена, приводит к изменению профиля метилирования центромерных районов хромосом, нарушению расхождения хромосом в оогенезе и, вероятно, повышает риск рождения ребенка с синдромом Дауна и с нарушением расхождения хромосомы 18 (Brustolin S. et al., 2010).
Превращение протромбина в тромбин - ключевой момент в процессе коагуляции (рис. 4). Ген, кодирующий протромбин, FII, расположен на хромосоме 11 (llpll-ql2). В этом гене был обнаружен редкий полиморфизм в пределах З -нетранслируемого участка, который, как известно, является причиной повышенного уровня протромбина сыворотки. Мутация гена протромбина G20210A характеризуется заменой гуанина на аденин в 20210 положении. Из-за увеличения экспрессии мутантного гена уровень протромбина может быть в 1,5-2 раза выше нормального содержания (Mahjoub Т. et al., 2005). Гетерозиготное состояние гена FII (мутация наследуется по аутосомно-доминантному типу) диагностировано 2 - 3 % у представителей европеоидной расы (Foka Z.J. et al., 2000, Finan R.R. et al., 2002). Предполагают, что мутация гена протромбина G20210A является причиной некоторых клинических форм гестоза, а также других патологических процессов в материнском организме, осложняющих течение беременности и эмбриональное развитие плода. Наиболее частыми осложнениями при беременности является возникновение микротромбозов, приводящих к выкидышам в первом триместре, невынашиванию беременности, плацентарной недостаточности, отслойке плаценты внутриутробной гибели плода, задержке развития плода (Agorastos Т. et al., 2002).
Фактор V свертывания крови (проакцелерин, Ас-глобулин) - это высокомолекулярный белок, отвечающий за образование фибрина и также являющийся ключевым моментом в процессе коагуляции (рис. 4). Вместе с другими факторами принимает участие в формировании комплекса протромбиназы, активируя превращение протромбина в тромбин.
Эпигенетические методы исследования уровня метилирования генов
Выделение и бисульфит пая обработка геномной ДНК Выделение геномной ДНК из децидуальной и хорионической тканей осуществлялось согласно стандартному протоколу фенол-хлороформного метода (Grimberg J. et al., 1989). Для исследования уровней метилирования генов, геномная ДНК была обработана бисульфитом натрия, при этом неметилированные цитозины конвертировались в урацил, тогда как метилированные - оставались неизмененными.
Бисульфитная обработка ДНК была проведена с использованием стандартного протокола. Вкратце, 2 М бисульфит натрия и 0,6 М NaOH добавляли к 300 нг геномной ДНК, которая затем была инкубирована в ДНК-амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) (табл. 4).
После этого, бисульфитнообработанная ДНК была очищена путем помещения на центрифужный концентратор Microcon YM-30 {Millipore, Швальбах, Германия), десульфирования с помощью 0,3 М NaOH и промывки ІхТЕ. В завершении бисульфитнообработанная ДНК была элюирована из колонки с помощью 50 мкл ІхТЕ.
Проведение ПЦР и электрофореза. ПЦР была выполнена в 30 или 50 мкл реакционной смеси, состав которой представлен в таблице 5. Таблица 5 - Состав реакционной смеси для проведения реакции амплификации фрагментов исследуемых генов.
Последовательности праймеров к севенируемым фрагментам и параметры ПЦР реакций представлены в приложении в таблице 1.
Детекцию результатов ПЦР осуществляли методом горизонтального электрофореза, для этого 5 мкл ПЦР продукта помещали в 1,2 % агарозный гель. Анализ электрофореграмм проводили под УФ с помощью трансиллюминатора.
Проведение анализа метилирования ДНК (SIRPH)
Количественный анализ метилирования ДНК в специфических сайтах определяли SIRPH-MQTOROM, т.е. путем метода однонуклеотидной элонгации праймера (SNuPE, single-nucleotide primer extension) в сочетании с технологией разделения посредством ион-парной обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (IP-RP-HPLC) (El-Maarri О. et al, 2002, El-Maarri О., 2004).
Неизрасходованные в процессе предшествующей амплификации нуклеотиды и праймеры были удалены путем добавления к 5 мкл ПЦР продуктов 1 мкл эндонуклеазы (Exonucleasel/SAP, USB) и последующей их инкубации в течение 30 минут при 37 С и 15 минут при 80 С. После этого SNuPE реакция была выполнена в 20 мкл реакционной смеси, содержащей:
- 2,0 мМ MgCl2,
- 0,05 мМ ддЦТФ,
- 0,05 мМ ддТТФ,
- 3,6 мкМ SNuPE праймеров,
- 5 ед. TERMIPol ДНК полимеразы (Solis BioDyne, Тарту, Эстония) на один SNuPE праймер,
- 1х буфер С (Solis BioDyne),
- 6 мкл очищенного ПЦР продукта.
В результате реакции элонгации праймера, отжигаемого в непосредственной близи с искомым QG-cafiTOM, удлинение на ддЦТФ или ддТТФ происходила в зависимости от того, метилирован или неметилирован исследуемый CpG-сзш. Режимы SNuPE реакций описаны в приложении в таблице 2.
Полученные SNuPE продукты были загружены на DNASep колонку (Transgenomic, Омаха, США) и разделялись в праймер-специфическом 7TM ацетонитрильном градиенте с помощью WAVE system (Transgenomic). Индексы метилирования (ИМ) были получены путем расчета по формуле: АС/(АС+АТ), где АС и AT - площадь пиков, соответствующих ддЦТФ или ддТТФ продленным праймерам соответственно (рис. 6).
Расчет производился с помощью Wave Maker v4.1 (Transgenomic). Для каждого исследуемого ампликона были проанализированы один или два CpG-сайта.
Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов для оценки степени контаминации плацентарных тканей
Для того чтобы проанализировать образцы на наличие контаминации, т. е. проверить хорионическую ткань на момент присутствуя в ней клеток материнского происхождения и наоборот, во всех парах образцов (хорионическая и децидуальная ткани) нами были генотипированы однонуклеотидных полиморфизма с высокой гетерозигонтостью. Генотипирование проводили путем SNuPE метода с последующей денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией (dHPLC) для подсчета количества аллелей. Генотипированные однонуклеотидные полиморфизмы, последовательности праймеров и условия ПЦР представлены в приложении в таблице 3. Для каждого однонуклеотидного полиморфизма был получен индекс, равный количеству рецессивного аллеля, и, вычисленный с помощью отношения: Ат/(Ат+АМ), где Am и AM - площади пиков, относящихся к продленным на один нуклеотид праймерам, комплементарным рецессивному и доминантному аллелям соответственно.
В случае если однонуклеотидный полиморфизм был информативен, т. е. генотипы матери и плода отличались, степень контаминации вычислялась с помощью отношения: НИ- ОЩ/0,5, где НИ и ОИ - наблюдаемый и ожидаемый индексы для отдельного генотипа. Далее для каждого образца был определен средний индекс контаминации.
Глубокое бисулъфитное секвенирование ДНК
Регионы экзон 2 гена AREG, интроны 2 и 4 гена ВТС, 5X77? генов ERVFRDE1 и ERVWE1, LTR HERVK и 5TOR LINE1 были более детально проанализированы методом глубокого бисульфитного секвенирования (ultradeep bisulfite sequencing). Для этого были приготовлены ампликоны соответствующих регионов с использованием сайт-специфических праймеров (табл. 1 в приложении) с легированными на 5 -конце А и В адапторами с известной рекомендованной последовательностью. ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей:
- 0,2 мМ каждого из четырех нуклеотидов,
- 3 ед. HOTFIREPol ДНК полимеразы (Solis BioDyne) - їх буфер В (Solis BioDyne),
- 2,5 мМ MgCl2,
- по 83 нМ прямого и обратного праймеров,
- 2 мкг Hotstart-ITсвязывающего белка (USB),
- 2 мкл бисульфитнообработанной ДНК.
Далее ампликоны были очищены, измерены с использованием интеркалирующего флюоресцентного красителя на флюориметре Qubit (Invitrogen, Дармштадт, Германия) и объединены. На следующем этапе была проведена эмульсионная ПЦР, в результате которой ДНК, содержащаяся в пластиковых сферах, «клонально амплифицировалась». Таким образом, на поверхности каждой сферы удерживалось около 10 млн. копий уникальной ДНК-матрицы. Далее сферы, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы помещались на пластину XLR70 Titanium PicoTiterPlate (Roche) и проводилось секвенирование согласно протоколу производителя. Прочтения были извлечены из файлов и сопоставлены с референтной последовательностью. Уровни и паттерны метилирования были проанализированы с помощью BiQ Analyzer НТ (Lutsik P. et al., 2011). Выделение РНК и проведение обратной транскрипции (ОТ) Выделение тотальной РНК из образцов плацентарных тканей проводилось экстракцией смесью гуанидинтиоционат-фенол-хлороформ (Chomczynski P. et. al., 1987). Синтез кДНК, комплементарной тотальной РНК, осуществляли с использованием набора реагентов для ОТ (Синтол, Москва), в состав которого входит обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV RT). Вкратце, в стерильную пробирку к 1 мкл праймера (Random-б) и 1 мкл тотальной РНК было добавлено 14 мкл Н20. Далее пробирки с указанной смесью нагревали при 70С в течение 5 минут для разрушения вторичной структуры матрицы и отжига праймеров. Затем сразу же охлаждали пробирки на льду в течение 5 минут. После этого в пробирки добавляли следующие реагенты: 10х буфер для ОТ (2 мкл); dNTP, 5mM (2 мкл); M-MLV RT, 50 ед/мкл (1 мкл); ингибитор РНКаз, 5 ед/мкл (Імкл). Пробирки аккуратно центрифугировали и 10 минут инкубировали при комнатной температуре, затем 30 минут при 40С. Конечное нагревание проводили при 92С в течение 7 минут для инактивации M-MLVRT.
Изучение роли гомоцистеина и фолиевой кислоты в развитии широкого спектра нарушений раннего онтогенеза человека
Исследования последних лет показали, что в основе отдельных видов эмбриональных нарушений человека лежит отклонение от нормы уровней биохимических показателей фолатного обмена. В том числе, повышенное содержание гомоцистеина рассматривается в качестве возможного фактора риска таких нарушений как, спонтанный аборт (Nelen W.L. et al., 2000), неразвивающаяся беременность (Vollset S.E. et al., 2000), преэклампсия (Cotter A.M. et al, 2003, Cotter A.M. et al., 2001). Однако роль аномального содержания биохимических показателей фолатного обмена до конца не изучена, а критические значения их концентраций, вызывающие ту или иную патологию, еще предстоит выяснить.
Первоначально нами были измерены уровни гомоцистеина и фолата в сыворотке крови при патологическом течении I триместра гестации, а именно при спонтанном аборте и неразвивающейся беременности. При изучении уровня гомоцистеина нами было обнаружено, что его концентрация ниже на 0,5 и 1,1 мкмоль/л в I и II исследуемых группах соответственно по сравнению с контрольной группой I (табл. 9).
Таблица 9 - Содержание гомоцистеина (мкмоль/л) в сыворотке крови женщин на I триместре беременности с различным диагнозом
Споры относительно роли несоответствующего норме содержания гомоцистеина помимо других этиологических факторов в генезе таких нарушений эмбрионального развития человека, как спонтанный аборт и неразвивающаяся беременность ведутся достаточно давно (Gris J.C. et al., 2003, Доброхотова Ю.Э., 2005). К основным отличиям между собственно спонтанным абортом и неразвивающейся беременностью относят способ отторжения эмбриона (самопроизвольно или путем хирургического вмешательства), время прекращения развития зародыша или плода (эмбриональный или фетальный периоды развития) и патогенез (Айламазяы Э.К., 2003).
Зачастую, исследователи отмечают, что повышенное содержание гомоцистеина в сыворотке крови беременных женщин приводит к микротромбообразованию, нарушению микроциркуляции и, как следствие, к осложнениям беременности. Однако до сих пор неизвестно, является ли повышенная концентрация гомоцистеина истинной причиной вышеупомянутых нарушений эмбриогенеза или всего лишь фактором риска их развития. К тому же, существует ряд исследований отрицающих такую ассоциацию, например, в недавней работе М. L. Hoffman было показано отсутствие корреляции между повышенным уровнем гомоцистеина и риском спонтанного прерывания беременности (Hoffman M.L. et al., 2008).
При измерении уровня фолиевой кислоты в I группе было отмечено более низкое содержание фолата, чем в контрольной группе (р 0,05), тогда как во II исследуемой группе напротив - более высокое (р 0,05) (рис. 10).
Как уже было отмечано раннее, одной из функций фолатов является участие в реакциях одноуглеродного переноса, включая биосинтез пуринов и тимидина (Gnimpieba E.Z. et al., 2011, Lucock M., 2000). Биосинтез пуринов и тимидина - это необходимое событие, лежащее в основе синтеза ДНК и РНК.
Таким образом, совершенно очевидно, что несостоятельность фолат зависимых реакций может ограничивать рост и развитие плода и, в конечном счете, способствовать высокому риску самопроизвольного прерывания беременности (George L. et al., 2002). Тем не менее, как и в случае с ассоциацией гомоцистеина и обозначенных нарушений эмбриогенеза, трудно сделать окончательные выводы о влиянии дефицита фолиевой кислоты в сыворотке крови на исход беременности. На сегодняшний день нет достаточного количества фактов, подтверждающих данную ассоциацию, и, более того, имеют место расхождения в результатах. Gindler J. и соавторы сообщили, что употребление добавок фолиевой кислоты до и во время беременности не влияло на риск развития спонтанного аборта (Gindler J. et al., 2001). В нашем исследовании снижение уровня фолата на 36 % в сыворотке крови женщин, перенесших спонтанный аборт, может служить свидетельством негативного влияния несоответствующего норме содержания фолиевой кислоты на течение эмбриогенеза человека. С другой стороны, отмеченное повышение концентрации фолата практически в 2 раза по сравнению с контролем при неразвивающейся беременности может отражать то, что уровень фолата не является определяющим фактором риска развития данной патологии. Кроме того, так как использованная нами методика позволяет определять все формы фолиевой кислоты, имеющиеся в сыворотке крови, то, вероятно, для решения поставленных перед нами задач и более точного анализа необходимо измерять содержание 5 метилтетрагидрофолата, 5,10-метилентетрагидрофолата и тетрагидрофолата по отдельности.
Далее нами была проанализирована ассоциативная связь между истинной угрозой прерывания беременности на фоне истмико-цервикальной недостаточности и аберрантными уровнями биохимических показателей фолатного метаболизма. Истмико-цервикальная недостаточность (ИЦН, некомпетентность шейки матки) является одной из распространенных причин досрочного прерывания беременности во втором и третьем триместрах, при этом происходит бессимптомное укорочение шейки матки, расширение внутреннего зева, приводящее к разрыву плодного пузыря и потере беременности (Айламазян Э.К., 2003). Различают органическую и функциональную ИЦН. К первой могут привести повреждения мышечной ткани в области внутреннего зева канала шейки матки (сфинктера шейки матки), изменение соотношения между соединительной и мышечной тканью в шейке матки, а также нарушение нейрогуморальных воздействий на шейку матки. Во втором случае, патогенез сложен и изучен недостаточно (Васеленко В.В., 2008).
В нашем исследовании мы измерили уровни гомоцистеина и фолиевой кислоты в сыворотке крови беременных женщин с угрозой прерывания беременности, которая развивалась на фоне ИЦН во II триместре гестации. Как оказалось, средний уровень гомоцистеина практически не отличался в двух исследуемых группах женщин (М±т: 5,99±0,45 и 6,61±0,66; 95 % ДИ: 5,07 - 6,91 и 5,05 - 8,18, при Р 0,05, для контрольной группы II и III группы соответственно). В отношении концентрации фолиевой кислоты была отмечена тенденция повышения ее уровня в группе женщин с ИЦН (М±т: 13,33±1,11 и 20,91±3,35; 95 % ДИ: 10,92 - 15,75 и 12,71 - 29,11, при Р 0,05, для контрольной группы II и III группы соответственно). Вместе с тем, в III группе была отмечена обратная линейная зависимость между уровнями фолиевой кислоты и гомоцистеина (г=-0,85; 95 % ДИ: (-0,97) - (-0,26), при р 0,05).
В литературе пока нет данных об изменениях биохимических показателей при развитии истмико-цервикальной недостаточности. Хотя можно предположить, что образование тромбов и дефектов микроциркуляции в тканях в условиях повышенного уровня гомоцистеина или пониженного содержания фолатов, в том числе в стенках матки, является потенциальным звеном в процессе морфологических изменений шейки матки при ИЦН.
Далее нами были изучены уровни гомоцистеина и фолиевой кислоты в сыворотке крови беременных женщин при наличии у них диагноза гестоз. Гестоз определяют как нарушение адаптации женщины к беременности (Кустаров В.Н., 2000) и относят к одной из главных и наиболее частых причин неблагоприятного исхода эмбриогенеза человека (Duley L., 2009).
Все попытки объяснить этиопатогенез гестоза пока не дали в полной мере обоснованных результатов. Однако было доказано, что основы этого патологического состояния материнского организма закладываются на ранних этапах эмбриогенеза (Кулаков В.И., 2006). Известно, что на начальных этапах развития гестоза происходит нарушение взаимоотношений между инвазией раннего трофобласта и ремоделированием спиральных артерий, приводящее к недостаточности кровоснабжения плаценты и оксидантному стрессу ее тканей (Kang A. et al., 2008). В свою очередь, дефекты плацентации могут возникать по причине дисфункции эндотелия, опосредованной повышенным содержанием гомоцистеина в крови (Boushey C.J. et al., 1995). Wang J. и соавторами было показано, что гипергомоцистеинемия может быть маркером патологического развития плаценты и, соответственно, указывать на наличие гестоза (Wang J. et al., 2000). В более поздних работах была отмечена дозазависимая корреляция между уровнем гомоцистеина и степенью тяжести гестоза (Mignini L.E. et al., 2005, Singh U. et al., 2008), но зачастую она была слабо аргументирована и мало достоверна (Mignini L.E. et al, 2005).
Похожие диссертации на Эпигенетические, молекулярно-генетические и биохимические критерии нарушений эмбриогенеза человека
![Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс]](/i/i/4419/185836.png "Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс] Высоцкий Александр Юрьевич")