Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Влияние селекции животных по поведению на коррелятивные признаки: роль серотониновой системы 12
1.1. Принцип селекционного эксперимента 12
1.2. Селекция животных на отсутствие агрессии по отношению к человеку
1.2.1. Коррелированные ответы на селекцию у доместицированных серебристо-черных лисиц 15
1.2.2. Влияние селекции на низкую агрессивность крыс-пасюков на другие формы поведения и состояние серотонинергической системы 18
1.3. Влияние отбора животных по поведению на проявление патологического поведения и изменения серотониновой системы 24
1.3.1. Селекция крыс по скорости выработки реакции условного избегания
1.3.2. Влияние селекция крыс по чувствительности к ингибитору холинэстеразы диизопропилфлюорофосфату на проявление депрессивноподобного поведения 28
1.3.3. Возникновение коррелятивных признаков в ходе селекции крыс на различную чувствительность к воздействию 8-ОН DP AT, селективногоагониста серотониновых 5-HTjА рецепторов 31
1.4. Селекция на генетическую предрасположенность к каталепсии и проявление депрессивных признаков 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Экспериментальные животные 40
2.1.1. Условия содержания 40
2.1.2. Селекционный эксперимент 40
2.2. Измерение каталепсии 41
2.3. Исследование тревожности, акустической реакции вздрагивания, депрессивноподобного поведения и межсамсовой агрессии 42
2.3.1.Тест открытого поля 42
2.3.2. Тест приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) 42
2.3.3. Тест свет/темнота з
2.3.4. Измерение реакции рефлекторного вздрагивания (startle reflex) и ее престимульного торможения 43
2.3.5. Тест принудительного плавания 44
2.3.6. Тест «tail suspension» (TS) 44
2.3.7. Межсамцовая агрессия (intermale agression)
2.4. Регистрация поведенческих тестов 45
2.5. Определение функциональной активности 5-HTiA рецепторов серотонина у мышей 45
2.6. Генотипирование мышей
2.6.1. Выделение ДНК 46
2.6.2. Метод ПЦР 47
2.6.3. Электрофорез 48
2.7. Статистическая обработка результатов 50
2.7.1. Оценка выраженности каталепсии и агрессивности 50
2.7.2. Оценивание поведенческих параметров
2.7.3. Проверка гипотез по распределению генотипов в селекционном эксперименте 51
2.7.4. Проверка гипотезы о распределении AKR (а) и СВА (с) аллелей у
мышей Sjs 51
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
3.1. Изменение выраженности каталепсии в ходе селекции 53
3.2. Исследование поведения селекционируемых мышей в различных
поведенческих тестах 54
3.2.1. Поведение мышей СВА, AKR uS$u S14 в тесте открытого поля 54
3.2.2. Сравнение поведения мышей AKR, СВА и Sg в тесте приподнятого крестообразного лабиринта 57
3.2.3. Поведение мышей 5 и родительских линий в тесте свет/темнота 57
3.2.4. Время неподвижности в тесте принудительного плавания у мышей AKR, СВА и S8 59
3.2.5. Изменения во времени неподвижности в тесте «tail suspension» у мышей AKR, СВА uS9 3.3. Измерение реакции рефлекторного вздрагивания и ее престимульного торможения у мышей AKR, СВА, Sg и Sf3 61
3.4. Уровень агрессивности у мышей Si4-Si5 и родительских линий 63
3.5. Изменение концентрации генотипов и соответствующих аллелей СВА и AKR полиморфных микросателлитных маркеров D13Mit76 и D13Mit202 у мышей в ходе селекции на высокую предрасположенность к каталепсии 64
3.6. Изучение функциональной активности серотониновых 5-HTiA рецепторов у родительских линий AKR, СВА и мышей Si2 6
3.7. Картирование генома селекционируемых мышей с помощью набора полиморфных микросателлитов для получения карты расположения фрагментов геномов родительских линий AKR и СВА 67
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 72
Выводы 83
Список цитируемой литературы
- Влияние селекции на низкую агрессивность крыс-пасюков на другие формы поведения и состояние серотонинергической системы
- Исследование тревожности, акустической реакции вздрагивания, депрессивноподобного поведения и межсамсовой агрессии
- Оценивание поведенческих параметров
- Изменение концентрации генотипов и соответствующих аллелей СВА и AKR полиморфных микросателлитных маркеров D13Mit76 и D13Mit202 у мышей в ходе селекции на высокую предрасположенность к каталепсии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Выявление молекулярных и физиологических механизмов трансдукции, закодированной в ДНК информации в сложный поведенческий признак, является главной задачей нейрогеномики поведения, в которой соприкасаются важнейшие проблемы других фундаментальных биологических наук - физиологии, этологии, молекулярной биологии, генетики и эволюционного учения
Одним из основных подходов к анализу наследования поведения является селекция животных на определенный вид поведения из аутбредной популяции (Трут, 1978, Корочкин, Михайлов, 2000) Этот метод широко используется для изучения молекулярных и физиологических механизмов регуляции поведения Проблеме селекционной роли поведения посвящены исследования механизмов эволюционно-генетических преобразований домашних животных (Беляев, 1972) Дарвин, оказавший подлинно революционизирующее влияние на биологию, отметил в «Происхождении видов» важное эволюционное значение соотносительной (коррелятивной) изменчивости возникающей при селекции по поведению В последарвиновский период большим количеством экспериментально-генетических исследований было показано, что отбор по какому-либо одному признаку приводит к появлению других, порою совершенно неожиданных, коррелятивных признаков и функций, причем особенно многочисленных и разнообразных при селекции по поведению (Беляев, 1962)
Возникающие при селекции по поведению коррелятивные признаки в дальнейшем нередко становятся основным объектом изучения и могут представлять интерес в области моделирования различных психопатологий (Overstreet, 1993) В тоже время механизмы возникновения коррелятивных признаков остаются до сих пор не ясными и преде гавляют большой интерес для нейрогенетических исследований
К настоящему моменту в рамках программ «геном человека», «геном мыши» и «геном крысы» секвенировали и провели сравнительный анализ геномов мыши, крысы и человека Была показана высокая степень их гомологии между собой Это дает большую возможность использовать сравнительные молекулярно-генетические подходы для изучения генетической структуры поведения животных и человека, а также повышает ценность различных лабораторных линий грызунов в качестве моделей человеческих заболеваний (Waterston et al, 2002, Gibbs et al, 2004), которые становятся ключевым экспериментальным инструментом для биомедицинских исследований (Paigen, 1995, Rossant, McKerlie, 2001, Waterston et al, 2002)
Поведение животного обусловлено определенной нейрохимической регуляцией, и селекция животных по конкретному типу поведения по существу является отбором на определенный тип нейрохимизма мозга, на определенную функциональную активность систем мозга и метаболизм медиаторов, участвующих в регуляции данного поведения (Попова и др, 1980)
Так, селекция крыс на предрасположенность к пассивно-оборонительному типу реагирования (предрасположенная к каталепсии линия крыс ГК - Генетические Каталептики) привела к появлению ряда черт поведения и физиологических признаков, сходных с наблюдаемыми при депрессивных расстройствах (Барыкина и др, 1983, Колпаков и др, 2004) У этих животных наблюдаются изменения в серотониновой системе мозга (Popova, Kuhkov, 1995, Kolpakov et al, 1996, 2001), обнаружено уменьшение содержания нейромедиатора серотонина и его метаболита
5-гидроксииндоуксусной кислоты (5-ГИУК) во фронтальной коре, найдены изменения и на уровне рецепторного аппарата Так, показано, что у крыс ГК снижена плотность 5-HTia серотониновых рецепторов в некоторых отделах мозга (Попова и др, 1996) То, что серотониновые рецепторы вовлечены в механизмы каталепсии, подтверждают также данные о способности агонистов 5-HTia рецепторов 8-OH-DPAT и флезиноксана предотвращать экспрессию реакции замирания у крыс ГК (Kuhkov et al, 1994)
Перспективной моделью нейрогенетических исследований регуляции каталепсии и ее взаимосвязи с другими защитными формами поведения являются селекционированные мыши на предрасположенность к каталепсии Наличие высокой гомологии геномов крысы и мыши позволяет предположить, что у животных в регуляции реакции замирания и возникновении коррелятивных признаков будут лежать схожие механизмы
Целью данной работы было изучение генетической структуры каталепсии у мышей, селекционированных на предрасположенность к реакции замирания, влияния селекции на проявление коррелятивных признаков и исследование возможных генетических и физиологических механизмов, лежащих в основе их проявления Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи
Изучить влияние селекции мышей на высокую предрасположенность к каталепсии на изменения параметров этого признака.
Исследовать особенности генотипов селекционированных животных, составить карту распределения фрагментов хромосом родительских линий AKR и СВА на 19 аутосомах селекционированных мышей при помощи набора полиморфных микросателлитных маркеров и выявить хромосомную локализацию минорных генов, участвующих в регуляции предрасположенности к каталепсии
Исследовать влияние селекции на другие защитные формы поведения агрессию, депрессивноподобное поведение, реакцию страха на внезапный акустический сигнал и тревожность
Сравнить функциональную активность 5-HTiA рецептора нейромедиатора серотонина у селекционируемых мышей и родительских линий
Научная новизна
Впервые показано, что селекция мышей на каталепсию привела к проявлению коррелятивных поведенческих признаков депрессивноподобному поведению, снижению агрессии и повышению рефлекторной реакции вздрагивания на акустический сигнал
Селекция на каталепсию зафиксировала у селекционируемых мышей локус ДНК, полученный от каталептической линии СВА и тесно связанного с геном 5-HTia рецептора Впервые экспериментально показано вовлечение 5-HTia рецептора в селекцию на поведение
" Линия селекционируемых мышей была прокартирована с помощью 50
полиморфных микросателлитных маркеров, и составлена карта их наследования
от родительских линий СВА и AKR
Научно-практическая ценность.
Обнаружено, что селекция мышей на предрасположенность к каталепсии приводит к проявлению ряда коррелятивных признаков, таких как снижение агрессивного поведения, повышение акустической реакции вздрагивания и депрессивноподобное поведение Изучение коррелятивных признаков способствует
более глубокому пониманию генетических и физиологических механизмов, лежащих в основе регуляции каталепсии, и связи между ней, агрессией, реакцией страха и депрессивноподобным поведением Результаты, полученные при исследовании поведения селекционируемых мышей, свидетельствуют о соответствии животных одному из основных критериев, предъявляемых к моделям депрессии - сходство проявлений (face validity) Показано, что селекция мышей на предрасположенность к каталепсии приводит к закреплению микросателлитного маркера D13Mit76, полученного от каталептической родительской линии СВА и сцепленного с геном 5-НТід рецептора нейромедиатора серотонина В то же время селекционируемые мыши наследуют повышенную функциональную активность этого рецептора, что привлекает внимание к более детальному изучению функции 5-НТід рецепторов и их роли в регуляции каталепсии и проявлении коррелятивных признаков Полученные мыши со стабильно высокой долей каталептиков были прокартированы с помощью 50 полиморфных микросателлитных маркеров и составлена карта генома мышей, что может быть использовано для выявления локусов, контролирующих «депрессивные» черты, реакцию страха и агрессивность у мышей
Положения, выносимые на защиту
Селекция на высокую предрасположенность к каталепсии привела появлению депрессивноподобного поведения, снижения агрессивного поведения, повышению амплитуды акустического рефлекса вздрагивания Повышенную амплитуду рефлекса вздрагивания и депрессивноподобное поведение можно рассматривать как закономерный коррелятивный ответ при селекции на каталепсию у грызунов, поскольку у крыс ПС, селекционированных на этот же признак, также наблюдается повышенная амплитуда рефлекса вздрагивания и депрессивноподобное поведение (Popova et al, 2000, Колпаков и др, 2004) Возможно, что в основе регуляции каталепсии, депрессивноподобного поведения и амплитуды рефлекса вздрагивания лежат сходные механизмы
Селекция на каталепсию закрепила у селекционируемых мышей аллель микросателлитного маркера D13Mit76, полученного от родительской линии СВА и тесно сцепленного с геном 5-HTia рецепторов, и высокую функциональную активность этого рецептора, что хорошо согласуется с проявлением коррелятивных признаков, так как известно, что 5-HTia рецептор вовлечен в регуляцию агрессивного поведения, акустического рефлекса вздрагивания и депрессивноподобного поведения у грызунов (Nanry, Tilson, 1989, Overstreet, 1993, Olivier et al, 1995) Это дает основание считать ген, кодирующий 5-HTja рецептор, наиболее вероятным молекулярным звеном между каталепсией, агрессией, депрессивноподобным поведением и рефлексом вздрагивания
Составлена карта распределения фрагментов хромосом родительских линий СВА и AKR в геноме селекционируемых мышей Карта генома мышей может явиться основой для выявления локусов, контролирующих депрессивноподобные черты, реакцию страха и агрессивность у мышей
Апробация работы.
Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Отчетных Сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 2006, 2007 годах, XLII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2004), съезде "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), VII Всероссийской
медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), Международной летней школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005), Международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), Международной конференции по биологической психиатрии «Стресс и Поведение» (Санкт-Петербург, 2007)
Публикации
Материал диссертации представлен в 11 публикациях, в том числе в 4 статьях в реферируемых журналах
Структура и объем работы
Влияние селекции на низкую агрессивность крыс-пасюков на другие формы поведения и состояние серотонинергической системы
Флиндеровские линии крыс FSL (Flinders Sensitivity Line) и FRL (Flinders Resistant Line) были селекционированы из крыс линии Спрег-Доули на повышенную чувствительность и устойчивость к ингибитору холинэстеразы диизопропилфлюорофосфату (ДФП), соответственно (Overstreet et al., 1979; Russel et al., 1982).
Считается, что линия крыс FSL практически полностью удовлетворяет критериям, предъявляемым к моделям депрессии (Overstreet, 1993; Willner, Mitchell, 2002) «Сходство проявлений» (face validity) Показано, что изменения веса, возникающие в течение депрессии, взаимосвязаны с изменениями аппетита и потребления пищи. Обнаружили, что FSL крысы весят меньше, чем FRL животные, но не обнаружено существенных различий между этими линиями в потреблении пищи или воды. Поэтому FSL крысы обладают лишь поверхностным сходством с депрессивными больными в отношении симптомов веса/аппетита (Overstreet, 1993). У крыс FSL показано общее снижение времени сна, но при этом у них увеличена фаза быстрого сна и укорочено время ее наступления. По этим показателям крысы имеют также частичное сходство с депрессивными людьми (Overstreet, 1993).
Тест открытого поля является наиболее применяемым тестом, используемым у грызунов для оценки тревожности, локомоторной активности и исследовательского поведения в условиях слабого стресса (Denenberg, 1969). Крысы FSL менее активны, чем FRL в данном тесте. Также FSL крысы проявляют повышенную неподвижность в тесте принудительного плавания по сравнению с FRL крысами, что рассматривается как важный показатель депрессивноподобного состояния (Porsolt et al., 1977). Изменения поведения согласуются с предположением, что FSL крысы имеют наследуемые психомоторные нарушения и усиленное стресс индуцированное повышение неподвижности (Overstreet, 1993).
Кроме того, у крыс FSL обнаружено, что они обладают лучшей памятью в выработке двухстороннего рефлекса избегания в челночной камере, чем животные FRL и Спрег-Доули (Overstreet, 1986). Поскольку этот тест включает запоминание ответа подавления наиболее вероятно, что FSL крысы имеют хорошую реакцию пассивного избегания из-за их способности становиться неподвижными под действием стресса. В тесте на обучение крысы FSL намного медленнее вырабатывали реакцию по сравнению с крысами FRL (Overstreet, Russel, 1982). Возможно, это связано с тем, что повышенное количество м-холиновых рецепторов является настолько большим, что наблюдаются патологические изменения и/или затруднения обучения возникают за счет ухудшения концентрации вследствие депрессивного состояния. (Overstreet et al., 1992).
Были обнаружены различия между FSL и FRL в доминировании и агрессии, двух социальных форм поведения, которые тоже могут изменяться у депрессивных больных (Anisman, Zacharko, 1982; Whybrow et al., 1984). В тесте соревнования за воду в парах FSL/FRL в условиях водной депривации, крысы FSL проявляют субмиссивное поведение (Pucilowski et al., 1991b), которое может быть еще одним индексом их депрессивноподобного состояния, так как субмиссивное поведение, наблюдаемое у нормальных крыс в тестах соревнования, подавляется при лечении трициклическими и атипичными антидепрессантами (Malatynska, Kostowski, 1983; Kostowski et al, 1984; Plewako, Kostowski, 1984). Похожая субмиссивность у депрессивных людей также уменьшается при воздействии анти депрессантами (Overstreet, 1993).
Некоторые данные предполагают взаимосвязь между агрессией и депрессией (Heath, 1981; Branchey et al, 1987). Так, было продемонстрировано, что FSL крысы проявляют более агрессивное поведение в тестах агрессии, индуцированной током или апоморфином (Pucilowski et al., 1991а). Оказалось, что FSL крысы с субмиссивным поведением являются более агрессивными. Сравнимая ситуация может существовать и у депрессивных людей, когда они долгое время социально изолированы, то могут остро реагировать на раздражающие стимулы (Overstreet, 1993).
Таким образом, суммируя выше приведенные данные, можно сказать, что выявленные у крыс линии FSL различные нарушения, такие как аппетита/веса, сна, снижение двигательной активности, познавательных способностей, напоминают проявления, обнаруживаемые у депрессивных больных. Нарушения поведения крыс FSL представляют большинство из возможных для животной модели симптомов депрессии человека, т.е. удовлетворяет критерию «сходство проявлений» (Overstreet, 1993; Overstreet et al., 2005). «Прогностическая достоверность» (predictive validity) У крыс FSL, хроническое введение трициклических антидепрессантов достоверно снизило время неподвижности в тесте принудительного плавания (Pucilowski, Overstreet, 1993), что согласуется с клиническим эффектом антидепрессантов (Willner, 1990; Blier, Montign, 1994). Таким образом, как модель депрессии крысы FSL соответствуют «прогностической достоверности». «Конструктивная достоверность» (construct validity) Оказалось, что крысы FSL имеют изменения во всех нейромедиаторных системах, которые участвуют в развитии депрессивного состояния (Overstreet, 1993; Overstreet et al., 2005). Нарушения, наблюдаемые в холинергической, дофаминергической, нейропептидной системах схожи с теми изменениями, которые обнаружены у депрессивных больных (Overstreet, 1993; Overstreet et al., 2005). В то же время у крыс не найдено дефектов норадренергической системе.
У линии FSL также выявлены изменения серотонинергической функции (Wallis et al., 1988; Overstreet et al., 1994; Zangen et al., 1997). Исследования показали, что FSL крысы более чувствительны к гипотермическим эффектам агониста 5-НТ1А рецепторов 8-ОН DP AT (Wallis et al., 1988; Overstreet et al., 1994), в то время как у депрессивных больных показана меньшая чувствительность к влиянию таких препаратов (Lesch, 1990).
По-видимому, можно заключить, что крысы FSL практически полностью удовлетворяют критерию «конструктивной достоверности» при изучении большинства нейрофизиологических систем и могут служить моделью депрессии.
Таким образом, селекция на повышенную чувствительность холинергической системы затронула не только эту медиаторную систему мозга, но и привела к изменениям в поведении, нейрофизиологии этих крыс. Причем изменения сложились в комплекс характеристик, которые соответствуют симптомам депрессии человека.
Исследование тревожности, акустической реакции вздрагивания, депрессивноподобного поведения и межсамсовой агрессии
Было исследовано распределение аллелей СВА (с) и AKR (а) полиморфных микросателлитных маркеров D13Mit76 у ВС, Si, S2, S8 и Sn и D13Mit202 у животных ВС и Si.
Изучили распределение фрагментов геномов родительских линий AKR и СВА в геноме мышей Sig, с помощью 5Q полиморфных микросателлитных маркеров, равномерно покрывающих 19 аутосом. При выборе микросателлитных маркеров для настоящего исследования руководствовались чтобы аллели избираемого маркера максимально четко дифференцировались в агарозном или полиакриламидном гелях (Куликов и др., 2003). Все маркеры были синтезированы в фирме «Биосан», г. Новосибирск
Геномную ДНК выделяли из кончика хвоста мыши (1-1,5см) по Маниатис с соавт. (1984) в модификации, разработанной в лаборатории (Куликов и др., 2003). Реактивы: 1. Лизирующий раствор; 2. Фенол: хлороформ : изоамиловый спирт (12:12:1); 3. Изопропиловый спирт; 4. Этиловый спирт 75%; 5. Стерильная вода (MiliQ, обработанная автоклавированием). Приготовление лизирующего раствора (для выделения одной пробы): 12 мкл раствора протеиназы К -10 мг/мл "GibcoBRL"; 50 мкл 10%-го раствора SDS; 1 мл буфера В (0,1 М NaCl, 0,05 М Т НС1, рН 7,8 и 0,1 М EDTA). Лизирующий раствор приготовляли непосредственно перед выделением ДНК. Кончик хвоста помещали в пробирку на 10 мл, добавляли по 1 мл лизирующего раствора и инкубировали в течение ночи при 45 С и покачивании до полного растворения хвоста. Затем в пробирку добавляли 1,5 мл смеси фенола и хлороформа и встряхивали 30 мин с помощью шейкера. Гомогенат центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин, водную фазу (750 мкл) пипеткой переносили в стерильную пробирку Эппендорф на 1,5 мл, содержащую 750 мкл изопропилового спирта, осторожно перемешивали. ДНК осаждали при 10000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Эппендорф, супернатант осторожно удаляли, остатки жидкости удаляли кусочком стерильной фильтровальной бумаги. В пробирку добавляли 1 мл 75% этанола и тщательно встряхивали. Центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. Спирт удаляли, и его остатки удаляли из пробирки кусочком стерильной фильтровальной бумаги. Осадок ДНК растворяли в 1 мл стерильной воды и прогревали 10 мин при 60С. Для измерения оптической плотности при 260 нм брали аликвоту 200 мкл раствора ДНК. Концентрацию ДНК в мкг/мкл определяли по формуле:
Концентрация = оптич. плотность 5 Далее ДНК разводили до концентрации 20 нг/мкл стерильной водой и хранили при-20С. Реактивы: 1. Тая-полимераза-5ед/мкл «СибЭнзим»; 2. Набор dNTP (dATP, dCTP, dGTP и dTTP) - ЮОмМ «Сибэнзим»; приготовляли смесь, содержащую по 4 мМ каждого трифосфата; 3. Буфер для Taq-полимеразы ПЦРхЮ (КС1, 0,5 М; Т НС1, рН 9; 0,1 М; Triton Х-100,1%); 4. Смесь прямого и обратного праймеров для микросателлитных маркеров -в конечной концентрации 1,1 мкМ каждый; 5. MgCL2-0,lM. Приготовление рабочих буферов: Буфер ПЦР (1мл) 655 мкл стерильной воды; 200 мкл ПЦРхЮ; 35 мкл MgCL2-lM; 100 мкл смеси dNTP; 10 мкл Taq-полимеразы. Буфер готовили непосредственно перед реакцией ПЦР. Реакция ПЦР: Реакцию ПЦР проводили в пробирках Эппендорф на 200 мкл на амплификаторе «БИС». В каждую пробирку добавляли по 5 мкл ДНК, 5 мкл праймера к микросателлитному маркеру, 10 мкл буфера ПЦР. Денатурировали 4 минуты при 94 С. Проводили 35 циклов: 94 С -1 мин, 55 С -1 мин, 72 С - 1 мин.
После проведения ПЦР в пробирки добавляли по 5 мкл буфера для нанесения, перемешивали с помощью пипетирования и наносили по 15 мкл на дорожку геля. На первую дорожку наносили 5 мкл (2,5 мкг) маркера. Форез проводили в 0.5х ТБЕ при напряжении 100 V в течение 1.5-2 часа. Затем гель сканировали на сканере для гелей в ультрафиолетовом свете (300 нм) и изображение полос продуктов ПЦР заносили в компьютер.
После проведения ПЦР в пробирки добавляли по 5 мкл буфера для нанесения, перемешивали с помощью пипетирования и наносили по 15 мкл на дорожку геля. На первую дорожку наносили 5 мкл (2,5 мкг) маркера. Форез проводили в 0.5х ТБЕ при напряжении 200 V в течение 3-4 часов. Затем гель сканировали на сканере для гелей в ультрафиолетовом свете (300 нм) и изображение полос продуктов ПЦР заносили в компьютер.
Частоты распределения каталептиков в разных поколениях селекции и у родительских линий, а также процент агрессивных животных в S14-S15 и у родительских линий сравнивали с помощью нормального распределения после преобразования долей в арксинусы по Фишеру.
Поведенческие параметры в тестах открытого поля, ПКЛ, реакции вздрагивания, TS, свет/темнота, принудительного плавания, и параметры теста на функциональную активность 5-HT]A рецепторов в мозге у мышей выражали как среднее с ошибкой М ± m и сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA, с последующим множественным сравнением по Дункану, в качестве независимых факторов были взяты различные поведенческие параметры.
Было предположено, что селекция на каталепсию повышает концентрации с/с {с - аллель полученный от СВА, а - аллель полученный от AKR) и снижает с/а и а/а генотипов маркера D13MU76, сцепленного с основным геном каталепсии. Концентрации генотипов для маркера D13MU76 в Sj и S2 были подсчитаны с использованием концентраций аллелей самцов и самок у ВС и Si, соответственно. Концентрации генотипов для маркера D13Mit202, взятого в качестве контроля в Si были подсчитаны с использованием концентраций аллелей самцов и самок у ВС. Сравнение значений с/с, с/а и а/а генотипов для D13MU76 у Si и S2 со значениями генотипов у ВС, сравнение значений генотипов между Si и S2 и сравнение значений генотипов для D13Mit202 у Si со значениями генотипов у ВС проводили по Fisher exact test.
Влияние селекции на распределение аллелей с (СВА) и a (AKR) для каждого маркера оценивали с помощью критерия %2 с одной степенью свободы. Для этого были вычислены NcSig (общее число аллелей с у мышей Sig) и NaSig (общее число аллелей а у мышей Sig) по формулам: NcS,8 = 2xNc/c + Nc/a и NaSig = 2xNa/a + Nc/a, где Nc/c, Nc/a и Na/a -полученные в эксперименте числа с/с, с/а и а/а генотипов. В случае, когда предрасположенность к каталепсии не связана с хромосомным локусом у селекционированных животных при отсутствии воздействия селекции соотношение сна аллелей для маркера будет таким же, как и у ВС, т. е. 3:1, соответственно. Исходя из этого, были подсчитаны Nc ожид и Na ожид, і ожидаемые значения количества аллелей с и а, которые будут наблюдаться в случае отсутствия селекции на каталепсию: Nc ожид = 3x2x(Nc/c + Nc/a + Na/a)/4 Na ожид = 2x(Nc/c + Nc/a + Na/a)/4 Таким образом, формула для вычисления %2 выглядит как у2 = (Nc Sig - Nc ожид)2Мс ожид + (Na Si8 - Na ожид)2Л Га ожид Критическое значение %2 при уровне значимости, равном 0.05, для проверки гипотезы о влиянии селекции, скорректированное на число маркеров, равное 50 (Р = Р0/50), было 10,8.
Оценивание поведенческих параметров
Среди многообразных форм охранительно-пассивного поведения реакция замирания привлекает особое внимание. Эта форма обездвиженности относится к типам адаптивного поведения, направленным на сохранение вида (Gallup, 1977; Klemm, 1990; Dixon, 1998). Следует отметить, что у грызунов замирание возникает не только в ответ на неожиданные изменения в окружающей обстановке, но и входит в состав внутривидового поведения. Замирание и неподвижность являются неотъемлемыми элементами поз подчинения: субординантный самец мыши, будучи атакован более агрессивным сородичем, демонстрирует субмиссивное поведение с элементами каталептоидной неподвижности (Пошивалов, 1976; Кудрявцева, Ситников, 1986), а побежденные крысы пребывают в застывших позах, пока атакующая особь не отойдет в сторону (Grant, Mackintoch, 1963; Takahashi et al., 1983). Таким образом, замирание одного из партнеров снижает выраженность агонистического внутривидового взаимодействия (Dixon, 1998).
Большим количеством экспериментально-генетических исследований было показано, что отбор по какому-либо одному признаку поведения приводит к изменению других признаков и функций (Беляев, 1964; Трут, 1978; Overstreet, 1993).
В данной работе наиболее интересный результат был получен в ходе исследования агрессивного поведения у селекционируемых на каталепсию мышей. Было показано, что высокая предрасположенность к каталепсии сопровождается понижением агрессивности мышей. Процент агрессивных животных у S14-15 не только на порядок меньше, чем у исходных родительских линий (4.1%), но он был значительно меньше, чем у какой-либо из десяти ранее протестированных инбредных линий мышей (Куликов, Попова, 1980; Popova, Kulikov, 1986; Kulikov et al., 2005). Снижение агрессивности у S]4.i5 невозможно объяснить тем, что у селекционируемых мышей снижена двигательная активность, поскольку родительские различаются по локомоторной активности, а по агрессивности нет. В то же время уменьшение процента агрессивных самцов у мышей с высокой предрасположенностью к каталепсии хорошо согласуется с ранее полученными результатами об эффекте агрессивного опыта на проявление каталепсии у линии СВА. Так, опыт повторяющихся побед в межсамцовых конфликтах вызывал у мышей этой линии повышение агрессивности, приводящей к ингибированию генетически детерминированной предрасположенности к каталепсии (Kulikov et al., 1995).
Таким образом, селекция мышей на пассивно-оборонительную форму поведения ведет к исчезновению активной защитной реакции. С одной стороны, этот результат оказался неожиданным, так как мыши каталептической линии СВА и некаталептической AKR являются довольно агрессивными животными. С другой стороны, селекция на каталепсию, видимо, закрепила такое состояние нейрофизиологических систем, при котором мыши не проявляют агрессии. Все вышесказанное подтверждает предположение о том, что агрессия и замирание представляют собой две альтернативные формы поведения в межсамцовых конфликтах (Blanchard, Blanchard, 1986). Следовательно, существенное снижение агрессии у мышей - каталептиков можно считать закономерным коррелятивным ответом на селекцию.
Было показано, что селекция крыс на генетическую предрасположенность к каталепсии сопровождается изменениями и в других формах адаптивного поведения. Все наблюдаемые изменения поведения у крыс ГК интерпретированы как депрессивноподобные признаки (Колпаков и др., 2004). В связи с этим было интересно посмотреть, к каким изменениям привела селекция у мышей.
Тесты открытого поля и крестообразного лабиринта традиционно используют для изучения реакции животного на стимулы, вызывающие страх и тревогу. Также полагают, что животное редко посещает центр открытого поля и открытые рукава крестообразного лабиринта вследствие естественного страха перед открытым и освещенным пространством. Поэтому число заходов в центр открытого поля и открытые рукава крестообразного лабиринта, как и время пребывания там, традиционно считают показателями, свидетельствующими о степени выраженности тревожности животного (Pellow et al., 1985; Chopin, Briley, 1987; Ramos et al, 1997). Отсутствие различий по этим показателям между мышами СВА, AKR, Sg и SH в тесте открытого поля и отсутствие различий в тесте приподнятого крестообразного лабиринта между мышами СВА, AKR и S8 можно рассматривать как доказательство отсутствия ассоциации между наследственной каталепсией и тревожностью животных.
Другим тестом, оценивающим тревожность, является тест свет/темнота. Нами не было найдено взаимосвязи тревожности в тесте свет/темнота с каталепсией. Несмотря на то, что число переходов и время пребывания в светлом отсеке у мышей устойчивой к каталепсии линии AKR были снижены по сравнению с мышами СВА, не было выявлено различий по этим признакам между AKR и So. Полученные данные хорошо согласуются с отсутствием взаимосвязи между каталепсией и тревожностью в тестах открытого поля и приподнятого крестообразного лабиринта у селекционируемых мышей. Кроме этого, было показано, что крысы линии ГК также не отличаются от животных линии Вистар по индексам тревожности в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (Петрова, 1990).
Таким образом, селекция на предрасположенность к каталепсии не приводит к усилению тревожности у мышей, как она не привела и у крыс. Это служит доказательством того, что отсутствие изменений в этой форме поведения у данных грызунов закономерно при селекции на каталепсию.
Увеличение неподвижности в тестах принудительного плавания и «tail suspension» является общепризнанным индексом усиления депрессивноподобных характеристик поведения. Это представление основано на способности антидепрессантов селективно снижать время неподвижности в этих тестах (Stem et al., 1985; Borsini, Meli, 1988).
Родительские линии не различались по времени неподвижности в тесте принудительного плавания, хотя наблюдалась определенная тенденция к его увеличению у животных AKR. По длительности неподвижности в тесте «tail suspension» более склонными к проявлению «депрессивности» были мыши AKR. Мыши Sg и S9 характеризовались более высокими показателями склонности к «депрессивности» в обоих тестах.
Изменение концентрации генотипов и соответствующих аллелей СВА и AKR полиморфных микросателлитных маркеров D13Mit76 и D13Mit202 у мышей в ходе селекции на высокую предрасположенность к каталепсии
В тесте крестообразного лабиринта установлены существенные межлинейные различия по времени пребывания в центре (F2,54= 19.21, р 0.001) и числу пересеченных квадратов в открытых рукавах (F2 54=10.78, рО.001). Мыши Sg и СВА достоверно больше времени проводили в центре (рО.001) и меньше двигались в открытых рукавах (р 0.001) по сравнению с животными AKR. Не обнаружено межлинейных различий по числу заходов в открытые рукава и времени пребывания там, а также по числу заглядываний вниз (табл.3).
Характеристика поведения мышей AKR, СВА и мышей Sg в тесте приподнятого крестообразного лабиринта Характеристика AKR (п=21) СВА (п=21) S8(n=21) Время в центре (%) 18.4 ±1.7 54.0 ± 5.3 т 52.1 ± 4.8 т# Число квадратов, пересеченных в центре 26.9 ±3.7 25.2 ±4.8 17.0 ±1.8 Время в открытых рукавах (%) 15.8±1.7 16.0 ±3.3 10.8 ±2.6 Число квадратов, пересеченных в открытых рукавах 13.5 ±2.2 4.2 ± 1.4 ш 4.7 ± 1.2 ш Число заглядываний вниз 13.6±1.5 12.2 ±1.8 9.1 ±0.9 Время в центре и в открытых рукавах выражали процентом от общего времени наблюдения (5мин), ###р 0.001 по сравнению с AKR
Считается, что животное редко посещает открытые рукава ПКЛ вследствие страха перед открытым и освещенным пространством. Число заходов в открытые рукава ПКЛ, как и время пребывания там, считаются показателями, свидетельствующими о тревожности животного. Следовательно, в тесте ПКЛ по тревожности мыши СВА, AKR и Sg не отличались.
Значительные межлинейные различия были выявлены по числу переходов в тесте свет/темнота (F2,27=5.25, рО.01, рис.4а) и по времени, проведенном в светлом отсеке (F2,27=3.38, р 0.05, рис.4б). Значения числа переходов (р 0.01) и время в светлом отсеке (р 0.05) у мышей СВА значительно превышали таковые у животных AKR. Значения этих показателей у S13 мышей носили промежуточный характер. число заходов в светлый отсек
Число заходов в светлый отсек (а), и время, проведенное в светлом отсеке (б) в тесте свет/темнота у AKR (п=10), СВА (п—11) и Sj3 (п—9). Время, проведенное в светлом отсеке, выражали процентом от общего времени наблюдения (5мин). р 0.05, р 0.01 по сравнению с СВА
Традиционными показателями тревожности животного в этом тесте считается количество выходов в освещенный отсек (либо число переходов между отсеками) и общее время, проведенное животным в светлом отсеке (Crawely, 1985). Таким образом, этому показателю мыши S)3 не отличались от родительских линий, тогда как животные линии AKR характеризовались повышенной тревожностью по сравнению с мышами СВА.
В тесте принудительного плавания время неподвижности для линий AKR, СВА и S8 были, соответственно, 110.1 ± 4.4 сек, 95.7 ± 5.8 сек и 114.8 ± 6.0 сек (F2,60=3.30, р 0.05, рис.5). По этому показателю различаются достоверно только мыши СВА и S8 (р 0.05). Данные по двигательной активности (числу пересеченных квадратов) составляют для линий AKR, СВА и S8, соответственно, 127.9 ± 7.8, 142.9 ± 13.2 и 108.7 ± 12.6. Статистически значимых различий по этому параметру не обнаружено. Время неподвижности в этом тесте считается показателем степени «депрессивности» животного. Следовательно, более «депрессивными» по сравнению с родительскими линиями являются мыши Sg.
Время неподвижности (с) в тесте принудительного плавания у мышей AKR, СВА и Sgt п=21 животных в каждой группе. р 0.05 по сравнению с СВА 3.2.5. Изменения во времени неподвижности в тесте «tail suspension» у мышей AKR, СВА и S9
В тесте «tail suspension» были обнаружены различия по времени неподвижности между мышами родительских линий и S9 (136.5 ± 7.0 сек у AKR, 97.1 ± 6.6 сек у СВА и 129.2 ± 8.1 сек у S9, F2,3o=7-87, рО.001) (рис.6). Время неподвижности у мышей AKR и S9 было существенно выше по сравнению с СВА (рО.01).
Повышенная неподвижность в тесте «tail suspension» рассматривается как показатель депрессивноподобного поведения. Таким образом, в этом тесте повышенной степенью «депрессивное» обладают мыши AKR и S9.
Таким образом, из исследования различных форм поведения мышей в тестах: открытого поля, ПКЛ и свет/темнота видно, что мыши Sg и Sj4 не отличаются от родительских линий по степени выраженности тревожного поведения. В тоже время мыши Sg и S9 характеризовались более депрессивноподобным поведением в тестах принудительного плавания и «tail suspension», по сравнению с животными СВА. В то время как мыши линии AKR были более «депрессивны» только в тесте «tail suspension» по сравнению с СВА.
Результаты тестирования реакции вздрагивания не показали никаких различий по среднему значению престимульного ингибирования для животных AKR (68 + 4), СВА (72 ± 3) и S8 (75 ± 2). Однако линии СВА, AKR и Sg существенно различались по величине амплитуды рефлекса вздрагивания (1120 ± 90 у СВА, 770 ± 80 у AKR и 1390 ± 86 у S8, F2,52=13.02, рО.001). У мышей S8 величина амплитуды рефлекса вздрагивания была в 1.2 раза выше, чем у СВА (р 0.05) и в 1.7 раза выше, чем у AKR (рО.001) (рис.7а).
При тестировании реакции вздрагивания у мышей Sn были также найдены значительные межлинейные различия в амплитуде рефлекса вздрагивания (рис.7б, 2,26= 11-28, рО.001). Величина амплитуды была выше у мышей СВА (рО.001) и So (р 0.001) по сравнению с мышами линии AKR. Амплитуды у животных СВА и Si3 не различались(р 0.05).
