Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Биологические особенности возбудителя пыльной головни ячменя Ustilago nuda 9
1.2. Общие представления об устойчивости ячменя к пыльной головне 15
1.3. Генетические аспекты устойчивости ячменя к пыльной головне 23
1.4. Применение различных систем маркеров для построения генетических карт 35
1.4.1. Морфологические маркеры 37
1.4.2. Локусы, контролирующие изоферменты и запасные белки как генетические маркеры 39
1.4.3. ДНК-маркеры 42
Глава 2. Материал и методы 47
2.1. Растительный материал 47
2.2. Методы исследований 49
2.2.1. Электрофоретический анализ ферментов 49
2.2.2. Электрофоретический анализ запасных белков 50
2.2.3. ДНК-анализ 51
2.3. Статистические методы 54
Глава III. Анализ наследования гена устойчивости к пыльной головне Run 8 56
3.1 Схема эксперимента по хромосомной локализации генов Run 56
3.2. Анализ наследования маркерных генов и гена Run8 в комбинации скрещивания ДМ х CI13664 61
3.3. Анализ комбинации скрещивания С113664хК6823 73
Глава IV. Хромосомная локализация гена устойчивости к пыльной головне Run6 79
Глава V. Гибридологический анализ комбинации скрещивания Л6823 x ДМ с целью локализации гена Run 12 84
Обсуждение 89
Выводы 95
Список литературы 96
- Биологические особенности возбудителя пыльной головни ячменя Ustilago nuda
- ДНК-маркеры
- Анализ наследования маркерных генов и гена Run8 в комбинации скрещивания ДМ х CI13664
- Гибридологический анализ комбинации скрещивания Л6823 x ДМ с целью локализации гена Run 12
Биологические особенности возбудителя пыльной головни ячменя Ustilago nuda
Порядок головневые грибы (Ustilaginales) насчитывает около 850 видов (Гаркавый, Кирдогло, 1980). Однако повсеместно распространены лишь восемь возбудителей головневых болезней, относящиеся к семействам Ustilaginaceae и Tilletiaceae, наносящие значительный вред зерновым культурам (Кривченко, 1984). Первоначально все головневые грибы культурных злаков объединяли в один вид Ustilago segetum (или U.car bo), которому приписывали поражение овса, ячменя, пшеницы и проса. В результате исследований Брефельда оказалось, что этот вид состоит из узкоспециализированных по растениям-хозяинам самостоятельных видов (цитируется по Н.И. Вавилову, 1986). На ячмене чаще всего паразитируют три вида головни: пыльная {Ustilago nuda (Jens) Kell. et Sw.), твердая или каменная {Ustilago horde і (Pers) Kell.et Sw.) и черная, или ложная пыльная головня {Ustilago nigra (Tapke). Эти виды относятся к семейству Ustilaginaceae, роду Ustilago (Pers.) и входят в состав базидиомицетов. Пыльная головня ячменя по морфологическим признакам и биологии имеет много общих черт с пыльной головней пшеницы {Ustilago tritici). По этой причине некоторое время этих возбудителей и относили к одному виду Ustilago nuda.
Заражение ячменя пыльной головней происходит во время цветения. Пылящая масса спор, попадая на рыльце пестика и стенки завязи, прорастает и проникает внутрь семяпочки. В зрелом зерне грибница находится в состоянии покоя, сохраняя свою жизнеспособность неопределенно долго. Эту удивительную биологическую способность впервые заметил С.С. Сквоцов (1937). Общая схема жизненного цикла»7 возбудителя пыльной головни представлена на рисунке 1.
При прорастании зерна грибница трогается в рост, проникает в росток и развивается вместе с растением. Инфицированные пыльной головней растения мало отличаются от здоровых. Однако, по некоторым данным, пораженные растения несколько отстают в росте, у них уменьшается число колосков в колосе, продуктивная кустистость и накопление сухого вещества (Ригина, 1965; Fisher, 1957). Снижается всхожесть семян, увеличивается восприимчивость пораженных растений к видам ржавчины, мучнистой росе, корневым гнилям, увеличивается количество дополнительных боковых побегов на 10-15% (Тымченко, 1976; Фиалковская, 1963). Зараженное зерно восприимчивых сортов дает ослабленные проростки, которые часто гибнут (Кривченко, 1978). Иногда, таким образом, происходит самопроизвольное очищение посевов от головни, особенно при пониженных температурах (Джиембаев, 1972; Кондакова, 1966). Заключительная фаза патогенеза -когда вместо нормального колоса появляется черная, пылящая масса спор. В природе споры не зимуют. Поэтому единственным источником болезни являются семена. В лабораторных условиях при температуре 18-24С споры хорошо сохраняются лишь в течение 3-4 месяцев (Кривченко, 1984).
В течение жизненного цикла Ustilago nuda проходит чередование гаплоидной, дикариотической и диплоидной фаз (рис. 1). Характерной особенностью головневых грибов является гетероталлизм, когда для осуществления полового процесса и завершения цикла развития необходимо слияние двух гаплоидных гетероталлических физиологически совместимых таллусов. Несовместимость сводит к минимуму или вообще исключает инбридинг и способствует гибридизации. В результате этого процесса головневым грибам свойственна исключительная изменчивость морфологических и физиологических признаков, что способствует формированию новых рас патогена. Гибридизация происходит как внутри вида, так и между таксонами разных видов и даже родов (Кривченко, 1984). Имеется целый ряд гипотез о гибридном происхождении многих видов головневых грибов. Так, вид Ustilago nigra, вероятно, произошел в результате гибридизации между U. nuda (U. tritici) и U. horde і (Гаркавый, Кирдогло, 1980).
Широкое развитие новых селекционных программ по созданию сортов, устойчивых к головневым болезням, привело к необходимости изучения изменчивости и структуры популяций головневых грибов. Главным критерием является патогенность (от греческого pathos - болезнь, страдание и genes - рождающий) - потенциальная способность вызывать проявление инфекционной болезни. На IV Международном ботаническом конгрессе в Амстердаме (1935 г.) было определено понятие "раса", как образец или коллекция хламидиоспор, которая имеет относительно одинаковую вирулентность на определенных сортах-дифференциаторах (Кривченко, 1984). Вирулентность (от латинского virulentus - ядовитый) представляет собой количественное выражение патогенности одного штамма микроорганизма в отношении определенного вида растения при определенных условиях. Исследованию расового состава пыльной головни ячменя посвящено большое количество работ во многих странах. Однако данные иногда трудно сопоставлять из-за отсутствия универсальных методик. За рубежом вопросами дифференциации рас пыльной головни занимались R.G Shands (1951), W.P Scoropad W.P и W.H. Johnston (1952) в Канаде, Е. Niemann (1960) в ФРГ. Почти одновременно было разработано несколько наборов сортов-дифференциаторов: V.F. Тарке (1955) в США, Cherewick (1953) в Канаде, а так же C.K.Cloninger and J.M. Poehlman (1954).
В нашей стране фундаментальные исследования головневых болезней зерновых культур были проведены В.И.Кривченко (1984). Поскольку для отечественных исследований набор Черевика (Cherewick) оказался мало пригодным, В.И. Кривченко был разработан новый набор из 6 сортов-тестеров. В итоге многолетних исследований В.И.Кривченко с сотрудниками отдела иммунитета ВИР удалось определить 18 рас возбудителя пыльной головни ячменя, а также установить их территориальное распределение. При этом была обнаружена высокая неравномерность встречаемости рас в регионах, что, вероятно, объясняется селективным действием набора районированных сортов в том или ином регионе (Кривченко, 1984).
Успех селекции ячменя на устойчивость к пыльной головне зависит от правильного выбора источника устойчивости, который бы обеспечивал иммунитет ко всем расам патогена, распространенным в этой зоне. Как уже отмечалось выше, внутри- и межвидовая гибридизация, характерная для головневых грибов, ведет к активному формообразовательному процессу в популяциях патогена. Так, В.И.Кривченко (1984) отмечает наличие как стабильных по вирулентности рас U. tritici (расы 2, 12 и др.) и U. nuda (расы 1, 3), так и нестабильные культуры возбудителя. Динамика структуры популяций этого возбудителя показана в работе Л.А.Марченковой и А.В.Макарычева (1985), исследовавших состав рас пыльной головни в Центральной Нечерноземной зоне в течение ряда лет. В 1980 г. биотипный состав пыльной головни, по их данным, был представлен расами 1, 6 и 13. Два года спустя ими были зафиксированы еще две расы 3 и 10. Последняя была выделена на новом сорте ярового ячменя Московский 3. За период 1982-1983 г.г. в Рязанской области на сорте Дворан было отмечено появление новой, так называемой "кейстон-вирулентной" расы 9. Исследованиями установлено, что расы I и 3 являются преобладающими в популяции возбудителя, что совпадает с данными В.И.Кривченко. При этом раса 9 является наиболее вирулентной (поражает максимально число сортов-дифференциаторов), а раса 1 - самой агрессивной (наиболее конкурентноспособной между различающимися по вирулентности расами). По данным П.Ф. Гаркового и Е.К. Кирдогло (1980), наиболее вирулентными являются расы 9, 1, 10, 6, 3. Однако, по данным В.П. Смолина (1988) на территории Нечерноземной зоны из 8 зафиксированных рас возбудителя расы 1 и 3 являются слабовирулентными, а наиболее вирулентными - 2, 7, 8.
Несмотря на быструю динамику расового состава популяций у головневых грибов, сорта могут сохранять свою резистентность на протяжении нескольких лет. Так, у пшеницы новая вирулентная раса U. tritici только через 20 лет накопилась на сорте Одесская 3 (Кириченко, 1975). Сорт яровой пшеницы Саратовская 29 сохранял устойчивость к пыльной головне в течение 15 лет (Федотова, 1974). Эти данные, по мнению В.И.Кривченко (1984), свидетельствуют о том, что вводимые в сорта пшеницы новые гены устойчивости могут быть эффективными не менее 10-15 лет. Сопоставляя, например, U. tritici с Puccinia reconduct (ржавчина пшеницы), можно отметить меньшую агрессивность пыльной головни по сравнению с ржавчиной, поскольку у нее всего лишь одна генерация за сезон. У ячменя смена рас Ustilago nuda так же происходит медленнее, чем, например, у мучнистой росы, что обеспечивает длительную иммунность сортов и эффективность селекции сортов устойчивых Cherewick к пыльной головне ячменя (Смолин, 1988).
ДНК-маркеры
Исследования организации и изменчивости геномов, а также картирование генов на хромосомах, стали широко развиваться, благодаря применению новых технологий - молекулярных маркеров, основанных на полиморфизме ДНК. Использование анализа полиморфизма ДНК позволяет более детально маркировать хозяйственные признаки, значительно ускоряет составление генетических карт растений, позволяя картировать одновременно несколько различных генов. Это делает более реалистичной программу картирования локусов, определяющих не только качественные, но и количественные признаки. За сравнительно короткий период были созданы карты сцепления молекулярных маркеров для 30 видов растений (Tanksley et al, 1995).
В настоящее время разработан ряд методов исследований на уровне ДНК. Широкое распространение получил метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) или RLFP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Он основан на рестрикции эндонуклеазами исследуемой ДНК с последующим электрофорезом и блот-гибридизацией по Саузерну с меченными изотопами зондами. ПДРФ-анализ используется для определения меж- и внутривидового разнообразия, при филогенетических исследованиях, сортовой идентификации. Но особенно интенсивно он применяется при построении генетических карт. Так, карты на основе ПДРФ маркеров были получены для таких важнейших сельскохозяйственных культур как кукуруза (Edwards et al., 1987; Helentjaris, 1992), картофель (Bonierbale et al., 1988), пшеница (Chao et al., 1989; Liu and Tsunewaki, 1991), ячмень (Graner et al. 1991; Heun et al., 1991; Kleinhofs et al.,1993) и многих других. Достоинство ПДРФ маркеров - кодоминантный характер наследования и высокая воспроизводимость результатов. Однако ПДРФ-анализ является трудоемким, дорогостоящим процессом, состоящим из нескольких этапов, с использованием радиоактивных изотопов. Это ограничивает применение ПДРФ-метода и, несмотря на его бесспорную эффективность, заставляет обращаться к другим молекулярным маркерам.
В результате ферментативной амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) получен новый класс молекулярно-генетических маркеров (Mullis et al, 1986). В сравнении с ПДРФ-анализом ПЦР-метод требует выделения значительно меньших (порой на три порядка) количеств ДНК, отпадает необходимость во многих сложных операциях (блот-гибридизации по Саузерну, работе с радиоактивными изотопами и т.д.). Благодаря простоте и доступности, ПЦР-анализ за последние 10 лет произвел прорыв в области применения молекулярных маркеров (Хавкин, 1997). В зависимости от природы праймеров и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько модификаций ПЦР. Первым появился RAPD-метод (randomly amplified polymorphic DNA). Это достаточно простой метод, с помощью которого проводят генетическую оценку видов, сортов и популяций. RAPD-анализ широко применяется для получения маркеров, используемых при создании генетических карт ряда культур - томата (Giovannoni et al., 1991; Wing et al., 1994), картофеля (Hosaka et al., 1994), пшеницы (Brown et al., 1993; Asakura et al., 1997), риса (Fukuoka et al., 1992), кукурузы (Halward et al., 1992), ячменя (Kleinhofs et al., 1993; Сиволап и др., 1997). В список исследованных RAPD-методом растений уже в 1995 году входили представители 87 родов (Weising et al., 1995). Однако этот метод имеет свои ограничения. RAPD-маркеры часто ведут себя как доминантные. По одним данным, они доминантны на 95%, по другим - на 100% (Конарев, 1998). Это усложняет их использование в генетических исследованиях, т.к. для того, чтобы уровень статистической достоверности данных, полученных при RAPD-анализе, соответствовал таковому при использовании кодоминантных маркеров, необходимо увеличить выборку в 2-Ю раз (Karp and Edwards, 1995). Серьезный недостаток RAPD-технологий -недостаточно высокая воспроизводимость результатов (спектров). RAPD-анализ входит в группу методов, основанных на амплификации ДНК с произвольными праймерами. С их помощью можно сравнивать геномы, не прибегая к получению информации об их нуклеотидной последовательности. Существует несколько модификаций амплификации ДНК с произвольными праймерами, различающиеся способами идентификации конечных продуктов, разными длинами праймеров и незначительными изменениями в параметрах реакции (DAF, RAPD, AP-PCR, RPA, PEP, rPCR). Недостатки RAPD-маркеров преодолеваются в методах, занимающих промежуточное положение между ПДРФ и ДНК-анализом с неспецифическими (произвольными) праймерами (Конарев, 1998). "Целенаправленная" ПЦР предполагает использование специфичных праймеров, для создания которых необходимо предварительное сиквенирование интересующего фрагмента ДНК. Эта методика, хотя и более сложная, чем RAPD, имеет определенные преимущества: получаемые маркеры могут носить кодоминантный характер, а результаты обладают хорошей воспроизводимостью (Конарев, 1998). Она также имеет несколько модификаций (Кокаева, 1998). Широкое применение нашли праймеры группы STS (sequenceagget sites) (Мало et al., 1999), SCAR (sequence characterized amplified rigions) (Procunier, 1997) и другие (Mohan, 1997).
Как уже отмечалось, молекулярные маркеры активно используются для маркирования определенных локусов различных сельскохозяйственных культур. Для облегчения поиска максимального количества молекулярных маркеров, сцепленных с определенными генами, был предложен метод массового сегрегационного анализа - MCA (Bulk Segregant Analysis - BSA) (Michellmore et al, 1991). MCA основан на приготовлении смеси ДНК-сегрегантов, отличающихся друг от друга только одним специфическим признаком. С помощью этого метода маркировано большое количество генов у сельскохозяйственных культур. Так, у ячменя идентифицированы молекулярные маркеры для генов устойчивости к стеблевой ржавчине, листовой ржавчине, мучнистой росе и пятнистости листьев (Steffenson et al., 1995). В целом, MCA является одним из наиболее перспективных методов, позволяющих строить генетические карты, высоко насыщенные молекулярными маркерами, и переходить к направленному изучению специфических локусов (Tankssley et al., 1995; Subudhi et al., 1997).
В исследованиях генома ячменя широко применяются различные ДНК-методы. Так, более 1000 молекулярных маркеров было локализовано на хромосомах с помощью анализа пяти различных гибридных популяций (Qi et. al., 1996). Совместный анализ данных по четырем комбинациям скрещивания: Proctor х Nudinka, Igri х Franka, Steptoe х Morex и Harrington х TR306, позволил составить объединенную карту, включающую 898 маркеров. В результате этой работы была составлена генетическая карта сцепления длинной 1060 сМ и заполнены пробелы, присутствующие на индивидуальных картах групп сцепления (Qi et. al, 1996). Помимо ДНК-маркеров на ней локализованы и некоторые морфологические маркеры (тп, mhex-v, mPub, mSrh) а также некоторые гены устойчивости к болезням (dMla6, dMlg, dym4, dRpgl, dRun x). Распределение такого большого количества маркеров по всем хромосомам ячменя позволяет успешно использовать объединенную карту в дальнейших генетических исследованиях. Интегрированная генетическая карта ячменя, включающая молекулярные, биохимические и морфологические маркеры продолжает активно разрабатываться и в настоящее время (Kleinhofs, 1999; Jensen, 2000).
Анализ наследования маркерных генов и гена Run8 в комбинации скрещивания ДМ х CI13664
Для установления хромосомной локализации гена Run8 была получена гибридная комбинация ДМ х СИ 3664, в которой родители различались по генам, контролирующие морфологические признаки, представленные в таблице 3.
Из данных, представленных в таблице 4, видно, что расщепления в F2 по всем маркерным генам, контролирующим морфологические признаки стебля, листа и колоса, соответствовали теоретически ожидаемым 3:1, а по гену Run8 -1:3.
Анализ наследования гена Run8 относительно маркерных генов, контролирующих морфологические признаки, показал его сцепленное наследование с геном В, расположенным в длинном плече хромосомы 5 (Ш). При этом величина рекомбинации между генами В и Run8 составила 18,56±3,36% (табл. 5).
Таким образом, в результате гибридологического анализа установлено, что ген Run8 находится в пятой группе сцепления и локализован в длинном плече хромосомы 5. С целью картирования данного гена на хромосоме 5 мы пытались подобрать дополнительные генетические маркеры. Для этого анализировали родительские формы с помощью молекулярного (STS) маркера АВС261, локализованного в длинном плече хромосомы 5.
Ячменя в районе гена В (Jensen, 2000; Kleinhofs, 1999). Однако анализ ДНК линий СН3664 и ДМ не показал различий между продуктами амплификации у родительских форм. Так же для анализа гибридной комбинации ДМ х СП 3664 пытались подобрать биохимические маркеры. С этой целью у родительских линий анализировали изоферменты и запасные белки, контролируемые локусами Gpil, Mdhl, Adh3, 6Pgd2 и НогЗ, локализованными в хромосоме 5 ячменя. Электрофоретический анализ перечисленных белковых систем у линии ДМ и образца СП 3664 показал различия между родителями только по аллелям локуса Gpil (рис. 11).
Как видно из рисунка, аллели этого локуса контролируют белковые продукты с различной электрофоретической подвижностью. Сам фермент, контролируемый локусом Gpil, имеет димерную структуру, о чем свидетельствует появление у гибрида Fi зоны активности с промежуточной подвижностью. Кроме этого, при анализе 6PGD были выявлены различия между родителями по локусу 6Pgd3 (рис. 12), локализация которого до сих пор остается неизвестной. Исследованиями P.M. Бияшева (1985) показано независимое наследование данного локуса относительно некоторых генетических факторов хромосом 1, 5 и 7. Электрофоретический анализ родителей показал, что образец СП 3664 несет нормальный аллель, а линия ДМ - "нуль -аллель", который в гомозиготном состоянии обуславливает отсутствие зоны активности фермента на электрофореграмме (рисЛ 2, дорожка 3).
Таким образом, для гибридной комбинации скрещивания ДМ х СП 3664 в качестве биохимических маркеров возможно использовать только локусы Gpil и 6Pgd3. Расщепления по каждому из них существенно не отличались от теоретически ожидаемых 1:2:1 и 3:1, соответственно (табл. 6).
Проведенный анализ сцепления гена Run8 с локусами Gpil и 6Pgd3 показал, что они наследуются независимо и не могут использоваться в качестве генетических маркеров для картирования гена RunS (табл. 7).
Поскольку в рассматриваемой гибридной комбинации ДМ х СП 3664 родители различались по гену 6Pgd3, локализация которого неизвестна, представлялось возможным оценить наследование данного локуса относительно 8 маркерных генов, описанных выше (табл. 8).
Анализ сцепления этого локуса с маркерными генами, контролирующими морфологические признаки и фосфоглюкоизомеразу, показала его независимое наследование относительно каждого из них (табл. 8).
Таким образом, в результате анализа в комбинации скрещивания ДМ х СП 3664 наследования гена Run8 относительно 9 маркерных генов, контролирующих морфологические и биохимические признаки, установлено, что он находится в длинном плече хромосомы 5 на расстоянии 18,56±3,36% рекомбинации от гена В. Картировать ген Run8 в данной гибридной комбинации не представляется возможным из-за отсутствия различий между родителями по маркерным генам, локализованным в длинном плече хромосомы 5 ячменя. Показано также независимое наследование локуса 6Pgd3 относительно 8 маркерных локусов, расположенных на хромосомах 2, 3, 4, 5 ячменя, и гена Run8. Кроме этого, в результате анализа данной гибридной комбинации установлены генотип линии ДМ по локусам 6Pgd3 "О" и Gpil S, что позволяет дополнить к маркерным генам, контролирующим морфологические признаки у линии ДМ, еще и два локуса, кодирующих изоферменты.
Гибридологический анализ комбинации скрещивания Л6823 x ДМ с целью локализации гена Run 12
Для определения хромосомной локализации гена Run 12 анализировали потомства F2, полученные от скрещивания источника устойчивости Л6823 с линией ДМ. В данной гибридной комбинации родители различались по восьми генам, контролирующим морфологические признаки (табл. 14).
Расщепление по морфологическим признакам и гену Run 12 соответствовало теоретически ожидаемому при доминантном наследовании генов (табл. і 5).
Гибридологический анализ комбинации скрещивания Л6823 х ДМ показал независимое наследование гена Run 12 относительно всех используемых генетических маркеров, контролирующих морфологические признаки (табл. 16).
С целью локализации гена Run 12 пытались подобрать дополнительные биохимические маркеры: Adhl (хр. 4), Mdhl (хр. 5), Mdh2 (хр. 3), 6Pgdl (хр. 1), 6Pgd2 (хр. 5), Gpil (хр. 5) (Sogaard and Wcttstcin-Knowles, 1987). Однако анализ родительских форм не выявил различий между ними по этим изоферментам , что не позволяет использовать указанные локусы в качестве гентических маркеров при гибридологическом анализе рассматриваемой комбинации скрещивания. Для определения хромосомной локализации гена Run 12 был использован еще один класс генетических маркеров - молекулярные. В работе применяли только STS-праймеры, которые дают, один, легко идентифицируемый, продукт амплификации. Из STS-маркеров использовали следующие: АВС717 (хр. 7), АВС302 (хр. 7), ABC 170 (хр. 6), АВС455 (хр. 1), ABG58 (хр. 2), АВС168 (хр. 7), АВС253 (хр. 1). Анализ ДНК линий Л6823 и ДМ, амплифицированпой с помощью описанных праймеров показал, что продукты амплификации родительских форм различаются только при использовании праймера АВС253 (рис.18).
В целях экономии реактивов для установления наличия сцепления между маркером АВС253 и геном Runll первоначально анализировали только класс устойчивых растений. В случае отсутствия сцепления между геном Runl2 и АВС253 расщепление по молекулярному маркеру в группе устойчивых растений не должно существенно отличаться от 1:2:1. При тесном сцеплении этих двух локусов, в группе устойчивых растений должен значительно преобладать вариант молекулярного маркера АВС253 (S), характерный для линии Л6823. В результате анализа молекулярного маркера АВС253 в группе устойчивых растений было получено расщепление 8(F):i4(F/S):8(S), что соответствует теоретически ожидаемому при независимом наследовании генов и говорит об отсутствии сцепления между АВС253 и геном Run!2.
Таким образом, в результате анализа гибридной комбинации Л6823 х ДМ показано независимое наследование гена Run 12 от маркерных генов расположенными на хромосомах 2, 3, 4, 5 ячменя. Для определения хромосомной локализации гена Run 12 необходимо создание специальных комбинаций скрещиваний, в которых возможно использование дополнительных генетических маркеров.
