Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературных данных
1.1. Методы направленного мутагенеза in vitro
1.1.1. Получение локализованных мутаций в результате рекомбинации фрагментов ДНК 7
1.1.2. Индукция локализованных мутаций путем химической модификации однонитевых участков ДНК . 14
1.1.3. Индукция локализованных мутаций путем введения модифицированных нуклеотидов 21
1.1.4. Индукция локализованных мутаций с помощью неполностью комплементарных ДНК-матрице олигонуклеотидных затравок 24
1.1.5. Индукция направленных мутаций с помощью комплементарных полинуклеотидов, несущих алкилирующие группы. ..... 26
1.1.6. Направленный мутагенез in vivo.
Подходы и перспективы 34
1.2. Ген, ответственный за устойчивость к тетрациклину плазмиды pBR322 - эксперимен
тальная мишень для направленного мутагенеза 38
Заключение к главе 1 43
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы 44
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение ДНК 48
2.2.2. Выделение фрагментов рестрикции ДНК. . 50
2.2.3. Бведение радиоактивной метки во фрагменты ДНК. 51
2.2.4. Гидролиз EooRI-BamHI
фрагмента рестрикции ДНК экзонуклеазой III из E.coli
для получения однонитевых фрагментов. . 55
2.2.5. Присоединение полифункционального алкилирующего реагента ТВД к молекулам ДНК 55
2.2.6. Гибридизация нуклеиновых кислот. . 56
2.2.7. Внутрикомплексное алкилирование. . 59
2.2.8. Денатурация гибридных комплексов. . 59
2.2.9. Хроматография ДНК на оксиапатите. . 59
2.2.10. Трансформация клеток E.coli
ДНК плазмидн pBR322 60
2.2.11. Определение первичной последовательности ДНК 60
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Присоединение алкилирующего реагента ТШ к ДНК. Устойчивость алкилированных оснований. . 64
3.2. Исследование способности ДНК, модифицированной ТШ, к комплементарному комплексообра-зованию 66
3.3. Разработка метода направленной модификации генов, клонированных в плазмидах 73
3.3.1. Получение однонитевой ДНК-носителя алкилирующих групп 74
3.3.2. Разработка метода гибридизации ДНК-носителя алкилирующих групп с суперспирализо-
ванной ДНК плазмиды 78
3.4. Получение направленных мутаций в гене Тсг плазмиды pBR322 84
3.5. Определение характера изменений в
первичной структуре полученных мутантов 88
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Использование ДНК в качестве носителя алкилирующих групп 93
4.2. Эффективность и направленность разработанного метода мутагенеза 96
4.3. Определение характера индуцированных мутаций. Предполагаемый механизм их возникновения. . . 97
4.4. Вероятная эволюционная роль механизма, индуцирующего образование тандемных повторов 103
Глава 5. Заключение 107
Глава 6. От автора 108
Выводы 109
Список использованной литературы ..... III
- Получение локализованных мутаций в результате рекомбинации фрагментов ДНК
- Выделение ДНК
- Получение однонитевой ДНК-носителя алкилирующих групп
Получение локализованных мутаций в результате рекомбинации фрагментов ДНК
Введение в практику молекулярной биологии эндонуклеаз рестрикции,, способных расщеплять клеточную ДНК на строго определенные наборы фрагментов, и ДНК-лигаз позволило объединять в одну молекулу ДНК различные фрагменты рестрикции. Эти методические достижения открыли возможность встраивания любых генов и регуляторних генетических элементов про- или эукариот в ДНК плазмид и бактериальных вирусов. С помощью этих же методов, в результате рекомбинации фрагментов ДНК, могут быть индуцированы перестройки в изучаемом районе встроенного в плазниды фрагмента: делеции, позволяющие оценить роль того иди иного участка, или инсерции, позволяющие исследовать функциональные связи между отдельными участками генетических структур.
Впервые генно-инженерная технология была применена для получения направленных мутаций Лай и Натансом (Lai, Nathans, 1974) и независимо Мертсом с соавторами ( Merfcs et al, 1974), разработавшими весьма простой метод получения делеций в кольцевых векторных молекулах ДНК. Они предложили "вырезать" отдельные участки ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции (рис.І,А). В том случае, если эндонуклеаэы имели несколько сайтов узнавания на кольцевой молекуле, авторы использовали условия неполного гидролиза, а укороченную молекулу ДНК после этого выделяли с помощью электрофореза. В первых работах, выполненных на ДНК вируса обезьян 40 С sv 40), выделенный продукт неполного гидролиза использовали для трансформации пермиссивных клеток обезьян без предварительного замыкания в кольцо с помощью ДНК-лигазы. Кольцевая структу образовавшихся в результате эксци зии фрагмента рестрикции ("экецизионных мутантов") восстанавливалась путем внутриклеточного лигирования липких концов, образованных рестриктазами. Были выделены также мутанты, у которых протяженность делеций превдаала размеры вырезанного фрагмента рестрикции ("избыточные делеций"). Такие же аномальные делеций были обнаружены и у бактериофага К после эксцизии фрагмента рестрикции и трансфекции клеток бактерий (Murray, Murray, 1974). "Избыточные" делеций возникали после трансфекции и в том случае, когда фрагмент рестрикции выщеплялся последовательным гидролизом двумя различными рестриктазами (bai, Hathans, 1976). Авторы приведенных работ считают, что такие делеций возникают в результате внутриклеточного гидролиза экзонуклеазами концов реетрикти-рованных ДНК до их лигирования.
Путем удаления фрагмента рестрикции получали также делепи-онные мутанты у однонитевых фагов (Humayan, Chambers, 1979)» Для этого однонитевую кольцевую ДНК фага ірХШ отжигали с фрагментом рестрикции ДНК фХПЧ , содержащем два сайта узнавания для рестриктазы Hindi. Затем гидролизовали образовавшийся частичный гибрид рестриктазой Hindi. Разрывы возникали только в двух сайтах в пределах дуплекса. Нуклеотидный анализ ДНК выделенных после трансфекции мутантов показал наличие делеций между двумя сайтами Hindi. Была обнаружена также делеция большего на одну нуклеотидную пару размера, возникшая по мнению авторов в результате присутствия в реакционных смесях загрязняющей их экзонукле-азы.
Выделение ДНК
Выделение ДНК плазмидыpBR322.Штамм E.coli НВІ0І, трансформированный плазмидой рВЕ322, был получен из лаборатории Бой-ра. Культуру штамма выращивали на среде 2хТТ при 37. В середине логарифмической фазы роста добавляли хлорамфеникол до 170 мкг/мл и инкубировали культуру еще 12-16 часов. Клетки собирали центрифугированием при 10000 xg в течение 15 минут. Осветленный лизат получали по методу Клевела и Хелински ( Clewell, Helinski, 1969). Для этого осадок, полученный из I л культуры E.coli, ресуспендировали при 0 в 6 мл 25%-ной сахарозы, содержащей 0,05 М трис-HCI рН 8,0. К суспензии добавляли I мл 0,2#-ного раствора лизоцима в 0,25 М трис-НСІ рН 8,0 и инкубировали при 0 5 мин. Затем добавляли I мл 0,4 М ЭДТА, инкубировали, слегка помешивая суспензию, еще 5 мин и приливали 8 мл 2$&-ного тритона Х-ЮО в 0,05 М трис-НСІ рН 8,0. После центрифугирования в течение I часа при 18000 об/мин и температуре 2 (центрифуга J -21, ротор JA -20) собирали супернатант, содержащий плазмиду. Дальнейшую очистку плазмиды осуществляли по методу Кольмена хроматографией на колонке с оксиапатитом (Colman et al,I978) или проводили равновесное центрифугирование в градиенте CsCl в присутствии бромистого этидия (Clewell, Helinski, 1969). При рестрикционном анализе плазмид, мутировавших по гену Тсг, плазмидную ДНК из клеток E.coli выделяли методом щелочной экстракции CBirnbqim,Doly, 1979)«
Получение однонитевой ДНК-носителя алкилирующих групп
Для осуществления направленной модификации участка ДНК плазмидн, выбранного в качестве мишени, необходимо провести гибридизацию этого участка ДНК с комплементарной ему ДНК-носителем алкилирующих групп. Кольцевая суперспирализованная ДНК, в том числе ДНК плазмид, может гибридизоваться в определенных условиях с комплементарной ДНК как с однонитевой ( Beattie et al, 1977), так и с двунитевой (предварительно денатурированной) ( Green, Tlbbetts, 1980), образуя Д-петли. Однако очевидно, что при использовании однонитевой ДНК эффективность гибридизации намного выше, так как в этом случае исключается возможность самогибридизации. Поэтому в качестве ДНК-носителя алкилирующих групп в нашей работе была использована однонитевая ДНК.
Однонитевую ДНК получали, как описано в гл.2.2, путем гидролиза двунитевнх фрагментов рестрикции экзонуклеазой III из E.coli. В качестве исходного двунитевого фрагмента рестрикции был использован рестрикт ДНК размером в 377 пн, выделенный из района гена Тсг плазмиды pER322 . Этот фрагмент ДНК был получен, как описано (гл.2.2), гидролизом ДНК плазмидн PBR322 рестриктазами ЕСОЕІ И Ватні (Генетическая карта плазмиды приведена на рис.5.) На рис.15 представлена электрофореграмма продуктов частичного гидролиза ЕсоНі-ВатНі фрагмента экзонуклеазой III из E.coli . Как видно из рисунка, в результате гидролиза помимо основного продукта реакции образуется серия дискретных фрагментов ДНК. Появление стабильного набора дискретных фрагментов ДНК объясняется тем, что экзонуклеаза III способна интенсивней гидролизовать определенные нуклеотидные последовательности ДНК (Linzweiler, Horz, 1982). На рис.15 приведены размеры продуктов гидролиза
EcoRI-BamHI фрагмента экзонуклеазой III. В качестве молекулярных стандартов при их определении использовали набор фрагментов с известными размерами, полученный при частичном расщеплении одной из нитей ДНК EcoRI-BamHI фрагмента по остаткам гуанина и гуанина+аденина (см. гл.2.2). Основной продукт экзонуклеазно-го гидролиза EcoRI-BamHI фрагмента представляет собой однони-тевой полинуклеотид длиною 121 нуклеотид, что несколько меньше половины молекулы фрагмента. В то же время, как следует из данных о механизме действия экзонуклеазы III (Rogers, Weiss, 1980;
Linzweiler, Horz, 1982), в результате гидролиза двунитевого фрагмента ДНК должны образовываться два однонитевых фрагмента с суммарной длиной не меньше, чем у исходного двунитевого. Обнаруженное несоответствие объясняется, вероятно, тем, что используемый двунитевой фрагмент ДНК имел однонитевые разрывы, к которым способна присоединяться экзонуклеаза III.
Для последующей гибридизации с ДНК плазмиды существенно, чтобы продукты экзонуклеазной реакции представляли собой однонитевые ДНК и были не способны к самогибридизации. Чтобы убедиться в этом, мы проанализировали продукт гидролиза EcoRI-BamHI фрагмента хроматографией на колонке с оксиапатитом. Оксиапатит, как известно, обладает большим сродством к двунитевой ДНК, чем к однонитевой ( Bernardi, 1971). Как видно из рис.1б,двунитевая ДНК EcoRI-BamHI фрагмента элюируется 0,18-0,21 М ИаР, тогда как EcoRI-BamHI фрагмент, который был предварительно денатурирован теплом, элюируется 0,1-0,13 М НаР (pHC.I66).5EeoRI-BamHI фрагмент после гидролиза экзонуклеазой III также элюируется с оксиапатита 0,1-0,13 Ш НаР(рис.16 в).
![Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4480/365685.png "Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae Киктев Денис Александрович")
