Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы генетический анализ механизмов рекомбинации у дрожжей
1. Типы рекомбинации и методы ее изучения 7
2. Тетрадный анализ мейотической рекомбинации II
3. Методы анализа митотической рекомбинации . 20
4. Генетический контроль рекомбинации 30
5. Зависимость параметров рекомбинации от расположения и природы рекомбинирующих мутаций. 36
6. Постановка задачи 44
Глава II. Материал и методы
1. Обозначения и сокращения 47
2. Штаммы дрожжей 48
3. Среды и условия культивирования 51
4. Генетические методики 53
Глава III. Получеше штаммов дрожжей дин изучения внутригенной рекомшнащи и картирование мутаций lys 2
1. Получение и характеристика мутаций lys2 62
2. Генетическая локализация мутаций lys 2
в двухсайтовых и трехсайтовых скрещиваниях 71
3. Гомозиготизация мутации his7 при рекомбинации в локусе LYS2 78
4. Получение и характеристика мутанта нгс+ 84
5. Заключение 92
Глава ІV. Анализ продуктов рекомбинации мутаций
1. Получение дишюидов, гетероаллельных по мутациям Iys2 94
2. Получение и характеристика митотических рекомбинантов Lys+ 100
3. Анализ продуктов митотической рекомбинации в двух-сайтовых скрещиваниях. 106
4. Анализ продуктов митотической рекомбинации в трех-сайтовых скрещиваниях 112
5. Получение и анализ мейотических рекомбинантов Lys+ 115
6. Заключение 123
Глава V. Обсуждение
1. Ген LYS2 как модель для изучения мутационного процесса и рекомбинация 125
2. Маркер-эффекты мутаций 1уа2 127
3. Влияние физических и генотипических факторов на внутригенную митотическую рекомбинацию 133
4. Сравнение внутригенной рекомбинации делеций в митозе и в мейозе у дрожжей 135
5. Возможные молекулярные механизмы обнаруженных маркер-эффектов 139
Выводы 145
Список литературы
- Типы рекомбинации и методы ее изучения
- Генетический контроль рекомбинации
- Обозначения и сокращения
- Получение и характеристика мутаций lys2
Введение к работе
Рекомбинация молекул ДНК - один из источников комбинативной изменчивости. Процессы рекомбинации вовлечены также в контроль стабильности генома. В результате рекомбинации происходят перестройки хромосом (см.Томилин, 1983). Специализированные системы рекомбинации обеспечивают дифференцировку типов спаривания у дрожжей (см. Herakowitz, Oahima, 1981), вариации антигенных типов у трипаносом (см. Pays et ai., 1981), развитие иммунной системы в ОНТОГенезе млекопитающих (CM. Gough, 1981; Tonegawa et al.,
1981). В последние годы изучение механизмов рекомбинации приобрело не только теоретическое, но и большое прикладное значение. Тест на рекомбиногенность широко используется при выявлении генетической активности факторов окружающей среды (см. Hagao et al., 1978; Павлов, 1980). С другой стороны, проблема рекомбинационной стабильности химерных ДНК - одна из наиболее актуальных проблем генетической инженерии (см. Вельков, 1983).
Настоящая работа посвящается изучению механизмов общей (гомологичной) рекомбинации у дрожжей-сахаромицетов. Дня общей рекомбинации необходима гомология нуклеотидных последовательностей. Один из подходов к анализу механизмов рекомбинации - исследование рекомбинационных свойств мутаций, нарушающих гомологию ДНК, например, делеций. Рекомбинацию делений изучали у различных объектов; полученные результаты были противоречивы (см.Щербаков и др., 1982; Szostak et al., 1983). У дрожжей-сахаромицетов изучали рекомбинацию делеций в мейозе (см. Pogei et ai., 1979, 1981). Детального анализа механизмов митотической рекомбинации мутаций различной природы ранее не проводили.
Мы исследовали рекомбинацию в гене L3t-S2 у Saccharomyces cere- visiae. В ходе работы была получена коллекция точковых мутаций и делений 1уа2, определено расположение мутаций на карте рекомбинации. Выделена мутация, приводящая к повышению частоты митотическои рекомбинации в гене LYS2. Мы провели систематический анализ продуктов митотическои рекомбинации мутаций iys2. Благодаря использованию селективных методов на всех этапах анализа мы смогли проверить большие выборки митотических рекомбинантов для разных сочетаний мутаций, что не удавалось другим исследователям. Нами обнаружен новый маркер-эффект митотическои внутригенной рекомбинации, выражающийся в том, что в некоторых комбинациях мутаций с пониженной частотой происходит конверсия и с повышенной частотой - рещшрокная рекомбинация. Впервые проведено сравнение способности к митотическои конверсии точковых мутаций и делений. Проведен сравнительный анализ продуктов спонтанной и индуцированной митотическои внутригенной рекомбинации для одних и тех же сочетаний мутаций 1ув2. Обнаружено, что ультрафиолетовое и рентгеновское излучение индуцируют как конверсию, так и рещщрокную вну-тригенную рекомбинацию. Показано, что структура продуктов митотическои рекомбинации определяется природой рекомбинирующих мутаций, а не тем, как получены рекомбинанты (спонтанно или при индукции).
Наши данные свидетельствуют, что митотическая конверсия больших делений происходит реже, чем конверсия точковых мутаций. Мы предполагаем, что взаимодействие гомологичных хромосом в районе делении затруднено. Возможно, делении редко включаются в участки гибридной ДНК, образующиеся в зоне контактов гомологов, и препятствуют распространению гибридной ДНК по хромосоме. Результаты работы должны быть учтены при построении молекулярных моделей гомологичной рекомбинации. Полученные данные следует учитывать также при разработке тест-систем для определения генетической активно- сти физических и химических агентов.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического научно-исследовательского института ЛГУ в рамках плановой темы "Исследование генетического конт- роля наследственной изменчивости" (№ гос.регистрации
81045837 :).
Типы рекомбинации и методы ее изучения
Рекомбинация последовательностей ДНК может осуществляться различными способами. Выделяют гомологичную и сайт-специфическую рекомбинацию. Гомологичная рекомбинация происходит при взаимодействии протяженных гомологичных последовательностей ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация не требует протяженных участков гомологии и приурочена к определенной последовательности (сайту) , которая присутствует в обоих рекомбинирующих молекулах (при сайт-специфической интеграции бактериофага X - см. Gotesman, 1981) или только в одной из них (при транспозиции мобильных элементов - CM. Calos, Miller, 1980; Kleckner, 1981). Элиминация или мутационное изменение этой последовательности блокирует рекомбинацию. Данные, полученные при экспериментах с бактериальными плазмидами и фагами (Франклин, 1975; Ikeda et al., 1981, 1982) И С ЭукарИОТИЧеСКИМ ВИРУСОМ SV4О (Woodworth Gutai, 1981 а,ь), свидетельствуют о существовании еще одного типа рекомбинации - незаконной рекомбинации, для которой, по-видимому, не требуется ни гомологии, ни конкретных нуклеотидных последовательностей. Незаконная рекомбинация пока еще мало исследована.
Современные представления об этапах гомологичной рекомбинации сводятся к следующему (см. Hotchkiss, 1974; Fogel et al., 1981; Radding, 1982; Szostak et al., 1983). Рекомбинация начинается с синапсиса гомологичных хромосом. В районе взаимодействия гомологов осуществляется перенос последовательностей ДНК с - 8 одной хромосомы на другую.
В процессе переноса образуется гибридная ДНК, содержащая комплементарные нити от разных гомологов, и происходит нереципрок-ная рекомбинация: последовательность ДНК в одном из гомологов замещается последовательностью другого гомолога. При разъединении гомологов может произойти кроссшговер - репипрокный обмен участками, расположенными по разные стороны от области гибридной ДНК.
Конкретные механизмы этих событий в различных моделях рекомбинации представляются по-разному.- Процесс рекомбинации может инициироваться однонитевым либо двунитевым разрывом ДНК. Гибридная ДНК может возникать лишь в одном из гомологов (асимметричная гибридная ДНК) либо в обоих гомологах сразу (симметричная гибридная ДНК). Распространение гибридной ДНК может происходить в одну сторону или же в обе стороны одновременно. Некоторые авторы предполагают, что весь район взаимодействия гомологов представляет собой гибридную ДНК. Другие считают, что относительно короткие последовательности гибридной ДНК фланкируют участки, где происходит перенос сразу двух нитей с одной хромосомы на другую. Структура промежуточных продуктов, предлагаемая в некоторых моделях рекомбинации, схематически изображена на рис.1. Все современные модели предполагают, что в ходе гомологичной рекомбинации происходят разрывы и перевоссоединение нитей ДНК, элиминация одних последовательностей и репликация других. В этих реакциях участвуют многочисленные ферменты. Прямоугольником обведены участки гибридной ДЖ; стрелки указывают направление распространения гибридной ДЖ. довательности ДНК должны различаться по генетическим (или физическим) маркерам. Во-вторых, требуются методы, позволяющие анализировать оба продукта каждого рекомбинационного события.
2. Изучение генетического контроля рекомбинации. Мутационное блокирование процесса рекомбинации на определенных стадиях позволяет идентифицировать гены, кодирующие ферменты рекомбинации. В результате анализа действия и взаимодействия этих генов можно установить функции ферментов и последовательность соответствующих этапов рекомбинации.
3. Идентификация и анализ рекомбинирующих последовательностей. Мутационное изменение последовательностей ДНК может нарушать или, наоборот, стимулировать рекомбинацию самих этих последовательностей. Таким образом, параметры рекомбинации зависят от расположения и молекулярной природы рекомбинирующих мутаций. Изучение этой зависимости позволяет установить, например, роль конкретных последовательностей в инициации рекомбинации, а также роль гомологии ДНК в рекомбинации.
Аналогичные подходы применяются и при исследовании сайт-специфической рекомбинации. В этом случае рекомбинация также связана с разрывами и перевоссоединениями молекул ДНК, происходящими в определенных сайтах при действии специфических ферментов. Разные сайт-специфические системы рекомбинации характеризуются разными сайтами узнавания и имеют собственные ферменты рекомбинации. Поэтому методы анализа механизмов сайт-специфической рекомбинации сильно модифицируются применительно к конкретным экспериментальным моделям.
Генетический контроль рекомбинации
В настоящее время у дрожжей-сахаромицетов получено большое количество мутантов с измененной рекомбинацией (см. обзор Kunz, Haynes, 1981). Многие из них выделены непрямыми методами (т.е. по проявлениям, не касающимся непосредственно рекомбинации). Изменения рекомбинации наблюдаются у следующих групп мутантов. 1. Мутанты, чувствительные к мутагенам и рекомбиногенам (мутации rad, mms, uvs, xrs). 2. Мутанты с нарушенным мейозом и спорулящей (mei, spo). 3. Мутанты с повышенной или пониженной мутабильностыо (mut,rev). 4. Условно-летальные мутанты с нарушениями клеточного цикла (cdc)»
Существуют и прямые методы отбора мутантов по рекомбинации. Мутации, действующие на митотическую рекомбинацию, можно индуцировать у анэуплоидов (п+1), гетероаллельных по какому-либо локу-су дисомичной хромосомы (Redarte-Ramon, Mortimer, 1972). Эта система позволяет выявить и доминантные, и рецессивные мутации. Для отбора мутантов по мейотической рекомбинации удобны дисоми-ки по хромосоме 3, гетерозиготные по типу спаривания и гетеро-аллельные по гену хромосомы 3 (Roth, Pogei, 1971). Такие дисоми-ки нормально осуществляют премейотический синтез ДЖ и мейотиче-скую рекомбинацию. Описаны мутанты с пониженной и повышенной частотой мейотической рекомбинации (cor, con), а также с пониженной и повышенной частотой митотической рекомбинации (гее, rem, міс). У этих мутантов часто наблюдаются изменения чувствительности к мутагенам, мутабильности, дефекты мейоза и споруля-вди (для обзора см. Kunz, Haynes, 1981). Вероятно, в принципе с помощью прямых и непрямых методов отбора мутантов по рекомбинации можно маркировать одни и те же гены.
Плейотропия мутаций, действующих на рекомбинацию, связана, очевидно, с тем, что в контроль рекомбинации вовлечены гены, контролирующие процессы матричного синтеза и деградации ДНК, организацию хроматина и т.п. Продукты этих же генов обеспечивают нормальную жизнедеятельность клетки. Многие мутации воздействуют на рекомбинацию опосредованно. Так, у мутантов с блокированным премейотическим синтезом ДНК невозможно и мейотическая рекомбинация (Roth, 1973, 1976). Плейотропные проявления затрудняют анализ взаимодействия генов, контролирующих рекомбинацию.
Наиболее изучено взаимодействие генов, мутации в которых приводят к радиочувствительности. Выделено три эпистатических группы rad-мутаций: группа rad3, группа rad6 и группа rad52 (см. Захаров и др., 1980; Lawrence, 1982); предполагается, что они соответствуют трем основным путям репарации повреждений ДНК у дрожжей-сахаромицетов. Изменения рекомбинации наблюдаются у мутантов всех трех групп. Особый интерес для изучения рекомбинации представляют мутации группы rad52.
К этой группе относятся восемь генов (rad50-rad57). Италии в них вызывают, как правило, слабую чувствительность к ультрафиолетовому излучению, но сильную чувствительность к ионизирующим излучениям (рентгеновым и гамма-лучам)(см. Game et ai., 1980; Kunz, Haynes, 1981). Ионизирующие излучения вызывают дву-нитевые разрывы ДНК. В.Г.Королев и Л.М.Грачева (1972) предположили, а А.Н.Лучник с соавторами (Luchnick et ai., 1977) доказали, что репарация хромосом, несущих двунитевые разрывы, происходит у дрожжей-сахаромицетов только при наличии второго (неповрежденного) гомолога; гаплоиды на стадии G1 репарировать хромосомы с двунитевыми разрывами неспособны. Мутации rad52 и rad54 блокируют репарацию хромосом с двунитевыми разрывами (:Но, Mortimer, 1975; Resnick, Martin, 1976; Budd, Mortimer, 1982).
По модели М.Резника (Resniac, 1976), репарация хромосомы с дву-нитевым разрывом происходит в результате рекомбинации с неповрежденным гомологом. Т.Орр-Вивер с соавторами (Orr-Weaver et ai., 1981) обнаружили, что двунитевые разрывы, возникающие при рестрикации плазмид, действительно индуцируют рекомбинацию с неповрежденной гомологичной последовательностью ДНК; этот процесс блокируется мутацией rad52. Д.Хэйбер с соавторами облучали гаплоид iys2 гамма-лучами на стадии G1 и скрещивали его с необ-лученным гаплоидом, несущим другую аллель 1уа2; они наблюдали индукцию рекомбинантов дикого типа, причем в основном за счет конверсии облученной аллели (Haber et ai., 1982). Однако двунитевые разрывы и другие повреждения ДЖ приводят к индукции рекомбинации и в неповрежденных хромосомах. Ф.Фабр и Х.Роман (Pabre, Roman, 1977) скрещивали гаплоид, обработанный ультрафиолетовым или рентгеновским излучением, с диплоидом, гетероал-лельным по мутациям ade6. Гаплоид нес мутацию kari, препятствующую кариогамии. Тем не менее в диплоидных ядрах индуцировалась гетероаллельная рекомбинация. Авторы заключили, что экспрессия генов, контролирующих митотическую рекомбинацию, индуцируется повреждениями ДНК. Спонтанная митотическая рекомбинация, пови i-димому, также происходит преимущественно.в компетентных клетках: различные авторы (Minet et al., 1980; Montelone et al., 1981a) наблюдали, что частота одновременной конверсии в несцеп-ленных локусах значительно выше частоты, ожидаемой при случайном совпадении.
Обозначения и сокращения
В работе использована стандартная трехбуквенная номенклатура для обозначения генотипов и фенотипов дрожжей (см. Инге-Вечто-мов, 1982). Ашс" - общее обозначение ауксотрофности. Ade , His" , Lys , Met"", Thr \ Leu , Aro - потребности соответственно в адепине, гистидине, лизине, метионине, треонине, лейцине, ароматических аминокислотах (фенилаланине, тирозине),
Рпо - отсутствие активности кислой фосфатазы I. Те же символы с индексом "+" использованы для обозначения прототрофности (или наличия активности кислой фосфатазы I). Рецессивные аллели соответствующих генов обозначены строчными буквами и цифрами (например, ade 2-192). Доминантные аллели обозначены прописными буквами (например, ADE2). Uvr " - чувствительность к ультрафиолетовому излучению (дикий тип обозначен тем же символом с индексом "+"). Adp+ - способность усваивать о(-ашноадипиновую кислоту в качестве источника азота. Нгс и Нгс - повышенная частота внутригенной митотической рекомбинации (hyper-recombination). Для обозначения дикого типа использованы те же символы с индексом "-". а и d - типы спаривания дрожжей. Соответствующие аллели ло-куса типа спаривания обозначены МАТа и МАТоч. xrs2 - мутация, приводящая к чувствительности к ионизирующей радиации и ультрафиолетовому излучению. MIC - мутации, приводящие к повышению частоты внутригенной митотической рекомбинации. ssai - мутация, приводящая к сверхчувствительности к о(-фактору у клеток типа спаривания а. lts3 - мутация, приводящая к холодочувствительности. cyh2 - мутация, приводящая к устойчивости к циклогексимиду. CE1I - центромера. УФ - ультрафиолетовое излучение. Х-лучи - рентгеновское излучение. ЭМС - этилметансульфонат. ММС - метилметансульфонат. АФ-2-аминофлуорен. ААК - БЬ-оС-аминоадипиновая кислота. YAPD - полная органическая среда. ІШІФ0- органическая среда, содержащая фосфат калия. MD - минимальная синтетическая среда. АА - среда с о(-аминоадипиновой кислотой.
Исходным материалом для работы послужили штаммы дрожжей-сахаромицетов Петергофской генетической коллекции, обозначения и генотипы которых приведены в табл.4. Расположение маркеров на генетической карте дрожжей приведено на рис.7.
Кроме того, в качестве тестеров типа спаривания использовали штаммы 2Б-П2393(МАТа his5) и 78А-П2393(МАТ his5), в качестве тестеров на аллелизм ade2 - штаммы р80-15В-П4 (МАТа ade 2-80) и І-ПЗІІ5 (МАТо ade2-80);B качестве тестеров на аллелизм his3 -штаммы І-ПГІ04 (см.табл.4) и І7Б-П2393 (МАТс( his3); в качестве тестеров на аллелизм his7-40I4I209I (МТа his7) и 29В-П209І (см. табл.4). мутаций lys2 использовали штаммы 3-П2І9 (МАТа adei-14 his7-i 1ув2-12) И 4-П2І9 (МШ ade1-14 his7-1 1уз2-12). Д установления аллельности мутаций 1уэ5 первоначально применяли штамм ХА77-34В (МАТоС lys5 met13 leul aro2 cyh2 lts3).B ходе работы были сконструированы тестеры на аллелизм 1уа5:Л70-І-ПГІ22 (ЖТа ade2-120 lys5-4 xrs2) и Ю-П3875 (МШ lys5-4 leu2-2 xrs2). При изучении внутригенной митотической рекомбинации в локусе ADE2 применяли штаммы 57А-П2І56 (Ш& ade2 911 thr4 leu2-2), ЗВ-П22ІІ (МШ ade2 9l6 leu2-2), 5Г-П22І2 (ЖТ ade2-917 thr4), 76В-П22І2 (ЖТс ade2-917 leu2-2) и 66А-П22ІЗ (MAT ade2-951 iys9), маркированные тошшвыми мутациями ade2..№ идентификации гомозигот по аллели МТоС у прототрофных диплоидов применяли штамм 54Б-П3228 (ЖТа his3 metAi ssai), сверхчувствительный к d-фактору.
Дрожжи выращивали на полной органической среде YAPD. Для отбора митотических сегрегантов Ade (красного цвета) использовали среду полную с пептоном, для определения активности кислой фоефа-тазы І-среду ПЕПФО, для определения дыхательной компетентности -среду полную с глицерином. Состав приведен в табл.5.
Селективные среды приготавливали на основе минимальной синтетической среды MD (см. табл.5). В среду MD входят витамины и микроэлементы Yeast llitrogen Base (по Rose, 1975, с модификациями). Витамины добавляли после автоклавирования в следующих концентрациях: биотин - 2 мкг/л, пантотенат кальция - 400 мкг/л, фолиевая кислота - 2 мкг/л, инозит - 2 мкг/л, никотиновая кислота -400 мкг/л, парааминобензойная кислота - 200 мкг/л, пиридоксина -гидрохлорид - 400 мкг/л, В -аланин - 500 мкг/л. Микроэлементы добавляли после автоклавирования в следующих концентрациях: борная кислота - 500 мкг/л, сульфат меди - 40 мкг/л, иодид калия -100 мкг/л, хлорид железа (Ш) - 200 мкг/л, сульфат марганца -400 мкг/л, молибдат натрия - 200 мкг/л, сульфат цинка - 400 мкг/л. В селективные среды добавляли также аминокислоты и азотисные основания, необходимые для роста дрожжей, в следующих концентрациях: аденин - 20 мг/л, гистидин - 20 мг/л, лизин - 30 мг/л, мети-онин - 30 мг/л, треонин - 150 мг/л, лейцин - 120 мг/л. При отборе гибридов фенотипа Lys использовали среду, содержащую двойное количество (60 мг/л) лизина. Для отбора рекомбинантов Lys+ и количественного учета митотической рекомбинации мутаций lys2 применяли полуобогащенную среду, содержащую I мг/лЬ -лизина.
Получение и характеристика мутаций lys2
Мы получали мутантов Adp+, усваивающих ААК в качестве единственного источника азота, у четырех гаплоидных и двух диплоидных штаммов дрожжей Петергофской генетической коллекции (см.табл.6). Диплоид П3887 получен при скрещивании штаммов р192-15В-П4 и ф2-оСі. диплоид П3887 -алф7 выделен из штамма П3887 в результате митотической гомозиготизации аллели MATrt под действием УФ. Встречаемость спонтанных мутантов Adp+ варьирует в пределах 10-5 10 (для гаплоидных штаммов) и 10 -10"" (для диплоидов). Частоту возникновения спонтанных мутантов Adp+ определяли у гаплоидов р192-15В-П4 и І-ПГІ22. У р192-15В-П4 было проанализировано 1019 клонов; средняя частота мутирования составляет (8,8+ 0,28)«10 . У І-ПГІ22 проанализировано 785 клонов, частота мутирования (4,5+0,23)10 . Количественный учет индуцированного мутирования был затруднен из-за неконтролируемых остаточного роста и гибели клеток на среде АА. Для разных штаммов при действии УФ (300 Дж/м ) или Х-лучей (1000 или 1600 Гр) наблюдалась индукция мутантов Adp+ в 10-10 раз.
Совместно с С.П.Солдатовым и В.М.Глазером (МГУ) мы показали, что спонтанные и индуцированные УФ и Х-лучами мутанты Adp+ у диплоидов возникают преимущественно в результате мутирования одной из аллелей дикого типа и последующей ее митотической гомозиготизации (данные, не включенные в диссертационную работу). Этот вывод согласуется с результатами, полученными ранее Д.А.Гордени-ным и С.Г.Инге-Вечтомовым (1981) при изучении возникновения му тантов по гену ADE2 у диплоидов дрожжей.
Результаты анализа мутантов Adp+ приведены в табл.6. Мы отобрали в общей сложности более 4000 мутантов - как спонтанных, так и индуцированных УФ и Х-лучами. Большинство из них (около 85$) были ауксотрофами по лизину (фенотип Lys ). Подавляющее большинство мутантов Lys" (более 98%) несли мутации в гене Iys2. Мутанты Lys" Adp+, неаллельные iys2, несли мутации iys5. Около 15% мутантов Adp+ характеризовались нечетким проявлением (фенотип Lys+). Некоторые из них по росту на среде без лизина практически не отличались от дрожжей дикого типа, однако большинство росли без лизина слабее, чем дрожжи дикого типа. Мы проверили аллельность 105 мутантов Adp+ с нечетким проявлением. Тест на ал-лелизм проводили двумя способами.
1. Мутанты Adp+ скрещивали крест-накрест с тестерами lys2 и Iys5 на YAPD и переносили методом отпечатков на среду без лизина. Если гибрид рос на среде без лизина лучше родительских штаммов, мутации считали неаллельными.
2. Мутанты скрещивали с тестерами 1уз2 и lys5, отбирали гибриды и сеяли их на среду АА. Фенотип Adp+ гибрида свидетельствовал об аллельности мутаций. Если гибрид имел фенотип Adp \ мутации считали неаллельными.
Оказалось, что 73 мутанта Lys+Adp+ несли мутации lys2,18-му-тации lys5, 14 мутантов не были аллельны ни 1уа2, ни iys5. Таким образом, большинство мутантов Adp+ (как с четким, так и с нечетким проявлением) несут мутации в гене LYS2. Наши результаты согласуются с данными, полученными в лаборатории Ф.Шермана (Chattoo et ai., 1979). Мутанты Adp+, неаллельные ни lys2, ни lys5, описали М.Уинстон и Дж.Ехаттачарджи (Winston, Bhattacharj-ее, 1982). По их данным,это мутанты по гену LYS14.
Схема получения тестерных штаммов, несущих точковые мутации Iys2, представлена на рис.П. Мутанты по гену LYS2, выделенные у штамма І-ПГІ04 (a his3) под действием Заминофяуорена (АФ) Ю.И.Павловым (см. Павлов, 1980), скрещивали со штаммом 29В-П209І ( о( his7). В мейотическом потомстве гибридов отбирали сегреган-тов Ы his7 lys2. Мутанты по гену LYS2, полученные нами у штамма о(«1(о( 1еи2), скрещивали со штаммом р2089-15В П4 (a ade2); в мейотическом потомстве отбирали сегрегантов a ade2 lys2. Таким образом, были получены штаммы, с помощью которых можно было анализировать рекомбинацию мутаций 1уа2 друг с другом. Первоначально мы выделили 17 мутаций Iys2, способных рекомбинировать друг с другом во всех попарных сочетаниях. Мы будем дальше обозначать эти мутации как точковые. В дальнейшем были выделены еще четыре точковых мутации у штамма р192-15В-П4 (a ade2). Для получения штаммов типа спаривания с/ эти мутанты скрещивали с оП или ф2-о(п (см.рис. 10).
![Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4480/365685.png "Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae Киктев Денис Александрович")
