Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Нарушения внутриклеточной сигнальной трансдукции как основа злокачественного роста . 13
1.2. RAS-сигнальный каскад. 14
1.3. Ras: ГЕНЫ и БЕЛКИ. 16
1.3. 1. Ras-семейства. 16
1.3.2. Ras-гены и белки в клетках млекопитающих . 19
1.3.3. Активация Ras-белков и трансформирующие свойства. 24
1.3.4. Различия между Н-, К- и N-Ras. 26
1.4. Регуляторы сигнального Ras-каскада. 28
1.5. Белки - мишени Ras. 29
1.6. Raf. 32
1.7. WNT-сигнальный каскад. 33
1.8. Нарушения в генах K-ras, Braf и АРС при некоторых онкологических заболеваниях. 37
1.8.1. Ген K-ras. Ъ1
1.8.2. Ген B-raf. 46
1.8.3. Ген АРС. 53
1.9. Нуклеиновые кислоты крови. 56
1.10. Адресная терапия (таргет-терапия). 59
ГЛАВА 2. Материалы и методы 65
2.1. Распределение обследуемых лиц по группам и характеристика изучаемых биологических образцов. 65
2.2. Забор крови. 67
2.3. Режимы центрифугирования. 68
2.4. Выделение ДНК из биоматериала. 69
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): 71 ГЕН K-ras 72 ГЕН B-raf 78 ГЕН АРС. 80
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). 85
ГЛАВА 3. Результаты исследования 88
3.1.. Ген K-ras. 88
3.1.1. Оптимизация условий проведения обогащенной ПЦР для выявления мутаций в 12-ом кодоне гена K-ras . 88
3.1.2. Специфичность ПЦР гена K-ras с мутациями в 12-м кодоне и характер точковых мутаций. 105
3.2.Ген B-raf 121
3.2.1 Оптимизация условий электрофореза при оценке дефектов гена B-raf. 121
3.3. Ген АРС. 139
3.3.1. Специфичность ПЦР. 139
3.3.2. Оптимизация условий электрофореза. 140
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 147
Выводы 161
Практические рекомендации 162
Список использованной литературы
- Нарушения внутриклеточной сигнальной трансдукции как основа злокачественного роста
- Ras-гены и белки в клетках млекопитающих
- Распределение обследуемых лиц по группам и характеристика изучаемых биологических образцов.
- Оптимизация условий проведения обогащенной ПЦР для выявления мутаций в 12-ом кодоне гена K-ras
Введение к работе
Америки смертность от рака стоит на втором месте после смертности от
сердечно-сосудистых заболеваний. Так, например, только в США число
смертей от онкологических заболеваний в 1994 году было больше на 6% по
сравнению с 1970 годом. Известно, что при выявлении опухоли на ранних
этапах развития заболевания клинический прогноз является наиболее
благоприятным, вероятность излечения многих форм рака при этом высока,
объем оперативного или иного лечебного вмешательства в таких случаях
имеет ограниченную травматичность для больного. Вследствие этого
ранняя диагностика злокачественных новообразований, особенно на
доклинических стадиях развития опухолевого процесса, является одной из
приоритетных задач в современной онкологии.
Известно, что рак - это комплексное заболевание, возникающее в
результате прогрессивного накопления генетических повреждений и
эпигенетических изменений в клетке. В последние несколько десятилетий
наука добилась больших успехов в раскрытии молекулярных механизмов
канцерогенеза: было описано около 200 генов и их белковых продуктов,
напрямую или косвенно связанных с возникновением рака, однако
большинство исследований в данной области не выходит за рамки
академической науки. В последние годы наметилась тенденция интеграции
фундаментальных и прикладных лабораторных исследований и
медицинской практики для нужд медицины в диагностике и выборе тактики
лечения онкологических заболеваний. Результаты многих научных
исследований применяются в клинике, подходы к диагностике и лечению многих онкологических заболеваний базируются на достижениях молекулярной генетики. Раскрытие молекулярных механизмов канцерогенеза позволяет создавать новые высокоэффективные нетоксичные агенты, действующие непосредственно при повреждениях тех или иных генов, повреждающихся при возникновении неоплазий. Так, например, разработаны препараты, действующие при гиперэкспрессии рецептора к эпидермальному ростовому фактору - ZD 1839 ("Iressa"), OSI-774 (Tarceva) - ингибиторы тирозинкиназного домена рецептора. BAY 43 9006 - новый агент, ингибирующий белковый продукт гена B-raf, часто повреждающегося при меланомах и папиллярных опухолях щитовидной железы. Также созданы и проходят клинические испытания препараты, действующие на молекулярные шапероны - ингибиторы Hsp90 (17AAG), блокаторы ростовых факторов сосудистого эндотелия - Avastin, SU11248 и многие другие [1]. При таком подходе увеличивается терапевтический эффект лечения и уменьшается проявление побочных эффектов. Для применения целевых агентов необходимо иметь информацию о наличии дефектов, которые данное средство призвано исправить. Это требует разработки новых, применимых в клинике методов обнаружения генетических мутаций.
Хотя современная медицина обладает большим арсеналом методов инструментальной клинической диагностики онкологических заболеваний, раннее обнаружение опухолей возможно не всегда. Кроме того, многие
«инструментальные» диагностические процедуры имеют инвазивный характер.
Иммунохимические методы, хотя и не инвазивны и имеют относительно невысокую стоимость проведения анализа, имеют недостаточную чувствительность для выявления неоплазии на ранних стадиях. Важно отметить, что иммунохимические онкомаркеры, как правило, являются нормальными компонентами плазмы крови. При злокачественных новообразованиях увеличивается их концентрация в крови, но такой эффект может быть вызывай воспалительными процессами.
Для установления диагноза часто используют гистологическую верификацию, для чего прибегают к биопсии. Несмотря на то, что биопсия дает информацию о морфологических характеристиках, результат ее зависит от точности попадания в опухолевый очаг. Кроме того, биопсия травматична для пациента.
В связи с недостатками вышеперечисленных методов возникает задача поиска новых, более чувствительных и надежных методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. К числу таких методов относится новое направление в современной медицине - молекулярно-генетическая диагностика. В отличие от иммунохимических онкомаркеров, молекулярно-генетические онкомаркеры обычно являются мутантными генами опухолевого происхождения, изменения в которых имеют как качественный, так и количественный характер. Выявление молекулярно-генетических онкомаркеров основано на исследовании нуклеиновых кислот
плазмы крови. Факт присутствия нуклеиновых кислот в плазме крови был обнаружен еще в 1948 году [2]. При более поздних исследованиях состава и происхождения нуклеиновых кислот плазмы крови было обнаружено, что опухолевые клетки выделяют свою ДНК в кровоток [3], причем количество ДНК в плазме крови онкологических пациентов обычно намного больше, чем у здоровых [3,4].
При исследовании ДНК из опухоли и плазмы крови обнаруживаемые мутации в генах-онкомаркерах идентичны, в то время как при исследовании ДНК плазмы крови здоровых пациентов (не имеющих онкологического диагноза) такие мутации не выявляются [5, 6]. Отсутствие в норме и присутствие при раке в плазме крови мутантных генов опухолевого происхождения является принципиальным преимуществом молекулярно-генетических онкомаркеров перед иммунохимическими. Преимуществом является и более высокая чувствительность молекулярно-генетических маркеров (в тысячу и более раз).
Известно, что на пути трансформации в клетке происходит ряд генетических событий, ведущих к нарушению функций генов, контролирующих клеточный цикл и поддержание целостности генома. Такими событиями в клетке являются генетические (замена оснований, делеции-инсерции, сдвиг рамки считывания, амплификация генов, реципрокные и нереципрокные транслокации и др.) или эпигенетические (изменение статуса метилирования регуляторных областей генов) нарушения [7, 8]. Следствием таких событий являются сбои в регулировке
клеточного цикла, при котором клетка приобретает повышенный пролиферативный потенциал; потеря клеткой дифференцировки и неспособность выполнять свои функции в организме; утрата генетической стабильности, ведущая к дальнейшему накоплению мутаций. Молекулярно-генетический анализ позволяет выявить такие мутации, когда количество трансформировавшихся клеток в организме исчисляется несколькими тысячами, то есть на самых ранних, еще доклинических этапах онкологического заболевания.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось усовершенствование существующих методов анализа генов K-ras, B-raf и АРС для использования их в диагностике и мониторинге некоторых онкологических заболеваний.
Для осуществления цели исследования были определены следующие задачи:
адаптация метода обогащенной ПЦР гена K-ras для выявления мутаций этого гена в различных биологических образцах;
оптимизация условий проведения ПЦР и последующего анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов (SSCP) для выявления мутаций в гене B-raf,
разработка праймеров и подбор условий проведения ПЦР и SSCP-анализа для выявления мутаций в гене АРС;
4) оценка применимости разработанных методических приемов к
анализу различных биологических образцов, включая плазму крови, для массового обследования.
Научная новизна работы.
Научная новизна данного исследования заключается в:
1) адаптации методов исследования молекулярно-генетических
онкомаркеров, известных для опухолевых тканей, к ДНК плазмы
крови, где концентрация ДНК в тысячи раз меньше, чем концентрация
ДНК из опухолевого материала того же объёма;
2) разработке методики определения мутаций в гене B-raf (15-й экзон)
в различных биологических образцах, включая ДНК плазмы крови,
методом SSCP-анализа.
3) разработке праймеров и подбора условий методики определения
мутаций в гене АРС (15-й экзон, район 1309-го кодона) в различных
биологических образцах, включая ДНК плазмы крови, методом SSCP-
анализа.
Практическая значимость.
1) методики анализа генов K-ras, B-raf и АРС адаптированы к использованию в научно-исследовательских медицинских учреждениях и молекулярно-диагностических центрах. Методы анализа генов K-ras и B-raf внедрены в работу Казанского Государственного Университета,
Ростовского Медицинского Университета, Саратовского Медицинского Института; ООО «Центр молекулярно-генетической диагностики» (г. Тюмень).
2) на основе полученных данных сформировано новое прикладное исследование - «Создание набора для диагностики ряда онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта».
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях и 5
тезисах докладов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Нарушения внутриклеточной сигнальной трансдукции как основа злокачественного роста
Фундаментальные процессы клеточного роста, дифференцировки, реакции на стресс регулируются большим числом гормонов, ростовых факторов и цитокинов. Эти молекулы обеспечивают передачу сигнала в цитоплазму и ядро клетки.
Инструментом передачи в этом процессе служат сложные комплексы, составленные из большого количества участников, взаимодействующих друг с другом, следствием чего служат различные изменения в клетке, опосредуемые данными комплексами. Существует 17 известных путей передачи клеточного сигнала и как минимум два пути, задействованных при стрессорных воздействиях [9]. Эти каскады регулируют три основных ответа клетки на внешние воздействия: пролиферацию, апоптоз и дифференцировку. При нарушениях регуляторной сети этих процессов поведение клетки может стать аномальным, и при определенных обстоятельствах привести к её трансформации в злокачественную.
Ключевую роль в возникновении важнейших свойств неопластической клетки играют нарушения функции онкогенов, протоонкогенов, опухолевых супрессоров и генов, которые при нарушении их функции способны увеличивать темп возникновения генетических изменений. Опухолевые супрессоры - гены, инактивация функции которых ведёт к возникновению и/или прогрессии новообразований. И, наоборот, восстановление функции некоторых из таких генов в опухолевых клетках может подавить их дальнейшее размножение. Онкогены - это гены, неконтролируемая экспрессия которых может привести к развитию новообразования. Протоонкогены - нормальные клеточные гены, усиление или модификация функции которых в результате повреждений превращает их в онкогены.
Два последних десятилетия характеризовались бурным открытием все новых и новых онкогенов и опухолевых супрессоров. К настоящему времени известно около сотни потенциальных онкогенов и около нескольких десятков опухолевых супрессоров. [10-15]. Долгое время знания о каждом из онкогенов или опухолевых супрессоров представлялись дискретными, в значительной мере не связанными между собой. Однако в последние годы стала вырисовываться общая картина, показывающая, что подавляющее большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами нескольких общих сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома и дифференцировку клеток. Изменения именно в этих сигнальных путях приводят к развитию злокачественных новообразований.
Одним из сигнальных путей, нарушения в котором приводят к возникновению трансформированных клеток, является RAS-сигнальный каскад. RAS-белки взаимодействуют с широким спектром эффекторов, опосредующих различные клеточные ответы, включая пролиферацию, дифференцировку или апоптоз. Ras гены были первыми открытыми онкогенами, вовлеченными в процесс образования опухолей человека. Изначально они были выявлены как трансформирующие гены вирусов мышиной саркомы Харви и Кирстена (Ha-MSV, Ki-MSV) [16, 17]. При молекулярном анализе генома этих ретровирусов выяснилось, что рассматриваемые гены вошли в вирусный геном из клеток хозяина. Анализ кодирующих последовательностей указывал на белки с массой 21 кДа [18]. Ras-белки - это g-белки, которые связывают гуаниновые нуклеотиды (гуанозинтрифосфат - GTP и гуанозиндифосфат - GDP) с высокой аффинностью и обладают собственной вТРазной активностью. Обмен между неактивной GDP-связанной и активной GTP-связанной формами строго регулируется, при этом Ras-белки функционируют как молекулярные переключатели в передаче сигнала. Ras-белки вовлечены в передачу самых разнообразных сигналов в клетке, например таких как стимуляция ростовыми факторами; активация Т-клеток; апоптоз; пролиферация, индуцированная цитокинами и дифференцировка гематопоэтических клеток; дифференцировка клеток, индуцированная фактором роста нейронов; развитие и регенерация нервной системы и ингибирование пролиферации клеток трансформирующим фактором р (TGF Р) [19-21].
Ras-гены и белки в клетках млекопитающих
Первичная структура генов ras. Клетки млекопитающих кодируют три функциональных гена: H-ras, K-ras и N-ras, имеющих очень сходные структуры и функции. Они составлены из четырех экзонов и 5 некодирующего экзона (экзон ф) и различаются по размерам и нуклеотидным последовательностям интронов. Геномные последовательности человека насчитывают 3 кВ для H-ras, 7 кВ для N-ras и более 35 кВ для K-ras. В клетках человека ген H-ras локализован на 11-й хромосоме (район 11р15.5), ген N-ras - на 1-й хромосоме (район 1р13.2), а ген K-ras2 - на 12-й хромосоме (район 12р12.1). Эти гены локализованы на разных хромосомах. Ген K-ras имеет две слабо различающиеся формы, имеющие отличие в 4-м экзоне (4А и 4В), экспрессия которых дает два изоморфных белка: K-rasA и K-rasB. Эти две формы различаются лишь двадцатью пятью С-концевыми аминокислотами [19, 27].
Белковые продукты ras-генов позвоночных имеют массу около 21 кДа и состоят из 188 (H-ras, K-rasA и N-ras) или 189 (K-rasB) аминокислот. Сильный консерватизм между видами, эволюционно далекими, такими как дрожжи и человек, говорит о том, что продукты ras-генов играют фундаментальную роль в ключевых процессах клетки. Гены Н-, К- и N-ras имеют консервативные последовательности у всех изученных видов.
Экспрессия генов. Три гена ras имеют промоторы с высоким содержанием GC-нуклеотидов, не имеющих ТАТА-мотива, что является характерным для «генов домашнего хозяйства». Участки, контролирующие экспрессию Ras, были найдены на 5 -конце этих генов и в их первом интроне [28, 29]. Так же были описаны элементы, находящиеся на 3 -конце H-Ras-rem, которые могут влиять на его экспрессию [19]. Например, негативный регуляторный элемент в последнем интроне человеческого гена H-Ras вызывает альтернативный сплайсинг, подавляющий экспрессию p2i"-.rem [30].
Гены ras млекопитающих экспрессируются во всех клетках разных органов, хотя существуют некоторые различия в уровне экспрессии каждого из этих генов в эмбриональных тканях и тканях взрослого организма [31, 32]. У гена K-rasA паттерн экспрессии более ограничен [33]. Различные паттерны экспрессии четырех Ras-белков являются, по всей видимости, проявлением их функциональных различий, однако, как минимум один Ras-ген экспрессируется во всех типах клеток.
Уровень itas-mRNA практически постоянен в клетке, поскольку активность Ras-белков регулируется связыванием GDP или GTP -процессом, катализируемым различными регуляторами Ras. Известно, что активность Ras-белков индуцируется сывороткой. При этом примерно 0,3-5% (в зависимости от метода детекции) из 20 000 - 30 000 молекул Ras белков в клетке находятся в активной GTP-связанной форме в NIH ЗТЗ клетках, выращиваемых на среде с сывороткой теленка. [19, 34]. Было показано, что не только активность, но и экспрессия трех Ras-генов слабо увеличивается в присутствии сыворотки [35]. Кроме того, было описано взаимное регулирование индукции транскрипции ras-генов. Такая индукция зависит от элементов, находящихся вне промоторной области [36]. В случае N-ras, дополнительное регулирование может возникать благодаря его последовательности, находящейся непосредственно ниже другого гена: ипг (upstream N-ras). N-ras и ипг образуют тесный тандем повсеместно экспрессирующихся генов.
Распределение обследуемых лиц по группам и характеристика изучаемых биологических образцов.
В качестве положительных контролен для исследования гена K-ras использовали ДНК клеточной линии SW480. В качестве положительного контроля при исследовании гена B-raf использовали ДНК клеточных линий НТ29 и SK-MEL-28, любезно предоставленных П. М. Чумаковым. Кроме того, в целях проверки качества определения мутантного гена K-ras и как межлабораторный контроль использовали ДНК, полученную из послеоперационного материала от больного опухолью толстой кишки с установленным наличием в этой ДНК мутантной формы гена K-ras. Аликвота этой ДНК была любезно предоставлена профессором А. Руссо (Antonio Russo), онкологический институт г. Палермо, Италия, а также ДНК, полученную из послеоперационного материала с охарактеризованной мутацией в гене K-ras, аликвота которой была любезно предоставлена М. Г. Якубовской, РОНЦ РАМН. В качестве образцов, имеющих мутации в гене B-raf и АРС, использовали ДНК из послеоперационного материала, характер мутаций в котором был установлен методом прямого секвенирования. В качестве отрицательных контролей при исследовании гена K-ras использовали ДНК клеточных линий Н-9, предоставленные А. А. Ставровской, РОНЦ РАМН, а также линий НТ29 и SK-MEL-28, в которых ген K-ras представлен аллелями дикого типа.
Отрицательным контролем при исследовании гена B-raf служила ДНК клеточной линии SW480.
Оптимизацию условий проведения анализа вышеперечисленных генов проводили как с использованием контрольных препаратов, так и с использованием клинических образцов. Клиническими образцами служили препараты ДНК, полученные из послеоперационного материала (свежая ткань и парафинированные блоки для гистологических исследований), плазмы и клеток крови, клетчиого осадка мочи, а также буккальных клеток (соскоб со щеки).
Для оценки пригодности использования выбранных условий проведения анализов генов K-ras, B-raf и АРС использовали различные биологические образцы, полученные от обследуемых пациентов. При этом пациентов условно разделили на 4 группы: здоровые доноры; лица без онкологического диагноза; лица, работающие во вредных условиях, связанных с канцерогенной опасностью; онкологические и онкогематологические больные со злокачественными новообразованиями.
В первую группу (здоровые доноры) вошли 34 человека, у которых анализировали ДНК из плазмы и/или клеток крови, а иногда ДНК из буккальных клеток.
Вторую группу составляли лица без онкологического диагноза, обратившиеся самостоятельно или по направлению врача для исключения или обнаружения возможности онкологического заболевания (94 человека).
Третью группу составляли лица, работающие во вредных условиях, связанных с канцерогенной опасностью (386 человек, не приведены в приложении 1). Эти лица работают в условиях загрязнения воздуха цехов парами органических растворителей и промежуточными продуктами химического органического синтеза искусственных каучуков.
Четвертую группу составляли онкологические и онкогематологические больные со злокачественными новообразованиями (233 человека). Эта группа была разделена на подгруппы в зависимости от локализации опухоли и других характеристик.
Описание всех пациентов, обследованных в данной работе, а также биологических образцов некоторых типов опухолей и результаты анализа генов K-ras, B-ra/и АРС приведены в прил. 1.
Девять мл крови забирали одноразовым шприцем из локтевой вены и переносили в полипропиленовую пробирку объемом 10 мл (ТС-10.РР, Хеликон, или аналогичные пробирки), содержащую 1 мл раствора ЭДТА на антикоагулянтном изотоническом растворе рН 7,35. Как показано в [304], при исследовании ДНК плазмы крови использование ЭДТА лучше по сравнению с другими антикоагулянтами. Кровь в пробирках осторожно перемешивали 2-3-кратным переворачиванием и трижды центрифугировали для разделения плазмы, ядросодержащих клеток и эритроцитной массы.
Первое центрифугирование осуществляли в мягких условиях при ускорении 315 g для максимального сохранения целости ядросодержащих клеток в течение 15 мин при 4С. Использовали центрифугу 5804 R с бакет-ротором фирмы «Eppendorf» (Германия). Далее плазму со взвесью ядросодержащих клеток переносили в новую пробирку, не захватывая осевшие эритроциты. Последующим центрифугированием при 1260 g (15 мин, 4С) осаждали ядросодержащие клетки, а плазму переносили в новую пробирку. Около 150 - 200 мкл плазмы оставляли с осадком. Осадок ядросодержащих элементов крови ресуспендировали в оставшемся количестве плазмы и переносили в микропробирку типа «Eppendorf» объёмом 1,5 мл. Плазму центрифугировали при 3500 g (15 мин, 4С) для полного осаждения единичных оставшихся клеток. Конечный образец плазмы переносили в новую пробирку и сохраняли при минус 80С до выделения ДНК.
Оптимизация условий проведения обогащенной ПЦР для выявления мутаций в 12-ом кодоне гена K-ras
Содержание ДНК в плазме крови здоровых доноров в среднем составляет около 20 нг/мл, т. е. примерно в 2500 раз меньше, чем в клетках из того же объема крови. Этот факт потребовал адаптации условий проведения ПЦР применительно к ДНК плазмы крови.
Для оптимизации анализа проводили подбор условий для каждого этапа. Оптимизировали параметры ПЦР: количество ДНК полимеразы, кратность буфера для проведения ПЦР, концентрацию ионов магния, температуру отжига праимеров и временные характеристики проведения ПЦР.
Подбор оптимального количества Taq-полимеразы и кратности буфера для ПЦР.
Для определения оптимальных условий проведения первой ПЦР при анализе гена K-ras варьировали количеством полимеразы, добавляемой в реакционную смесь, и кратностью ПЦР-буфера, входящего вместе с полимеразой в набор. Для четкой визуализации результатов этого эксперимента количество циклов в ПЦР увеличили с 25 до 40. Электрофореграмма с результатами эксперимента приведена на рис. 15.
Набор вариантов соотношения количества Taq-полимеразы и кратности буфера для ПЦР, использованные для проведения первого этапа обогащенной полимеразной цепной реакции приведено в подписи к рис. 15.
Была изучена воспроизводимость результатов ПЦР при выявлении мутаций в 12-м кодоне гена K-ras в условиях изменения концентрации праймеров. Чувствительность анализа была максимальной при снижении концентрации праймеров с 200 до 20 нМ на первом этапе ПЦР. Для подбора концентрации праймеров в первом этапе ПЦР и выявления влияния этой концентрации на результаты анализа провели три этапа анализа обогащенной ПЦР: первую ПЦР (различные концентрации праймеров), первую рестрикцию и вторую ПЦР, условия которй оставались постоянными (рис.21).
Из рисунка видно, что концентрации праймеров менее 10 нМ недостаточно для наработки целевого продукта в первом этапе. В то же время увеличение концентрации праймеров в первом этапе ПЦР (в первую и вторую ПЦР праймеры берутся разные, см. объяснения в описании трехпраймерной схемы выше) до 30 нМ увеличивает количество неспецифических продуктов (рис. 21, дорожка 14), либо из-за вероятной интерференции праймеров для первой и второй ПЦР количество целевого продукта снижается (рис. 21, дорожка 7). Увеличение концетрации праймеров более 30 нМ увеличивает количество неспецифических продуктов в условиях малых концентраций ДНК (электрофореграмма не приведена). Количество и «чистота» целевого продукта при концентрации 20 нМ являются оптимальными. Эти условия были использованы для анализа образцов ДНК плазмы крови, поскольку количества ДНК в этих образцах сопоставимы с таковыми в эксперименте (рис по подбору концентрации).
Условия проведения реакции рестрикции рестрикции использовали такие, как рекомендовано в инструкции фирмы-производителя.
Таким образом, оптимальными для выявления мутантной формы гена K-ras (мутация в двух первых нуклеотидах 12-го кодона) оказались следующие условия ПЦР:
Первый этап. Температурно-временной режим: активация полимеразы - 95С, 15 мин, отжиг праймеров - 54С, 1 мин, элонгация цепи - 72С, 1 мин, плавление цепей - 94С, 1 мин, количество циклов - 25, конечный отжиг - 54С, 3 мин, конечная элонгация - 72С, 5 мин. Концентрация праймеров - 20 нМ, количество полимеразы - 2 ед. (полуторократный буфер для ПЦР). Терминальный отжиг - 54С, 3 мин, терминальная элонгация - 72С, 5 мин.
Первая обработка эндонуклеазой рестрикции BstNl: инкубация реакционной смеси при 60 С, 60 мин. Второй этап. Температурно-временной режим: активация полимеразы - 95С, 15 мин, отжиг праймеров - 54С, 1 мин, элонгация цепи - 72С, 1 мин, плавление цепей - 94С, 40 с, количество циклов - 35, конечный отжиг - 54С, 3 мин, конечная элонгация - 72С, 5 мин. Концентрация праймеров -100 нМ, количество полимеразы - 2 ед.
Вторая обработка эндонуклеазой рестрикции BstNl: инкубация реакционной смеси при 60 С, 60 мин.
В этих условиях была исследована чувствительность выявления мутантной формы гена K-ras. Для этого использовали контрольные образцы ДНК, которые по концентрационным соотношениям соответствовали диапазону концентраций ДНК, полученной из плазмы крови:
1) образец ДНК, полученный из послеоперационного материала при иссечении опухоли толстой кишки. Общая концентрация ДНК в данном образце известна, количество мутантной формы - не известно.
2) образец ДНК из клеточной линии SW480. Данная клеточная линия гомозиготна по мутации в 12-м кодоне гена K-ras. Концентрация ДНК в этом образце известна.
![Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4480/365685.png "Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae Киктев Денис Александрович")
