Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Идентификация новых генов, контролирующих деление цианобактериальных клеток и пластид растений 45
Введение 45
Материалы и методы 49
Результаты 55
Обсуждение 62
Выводы из главы 1 74
ГЛАВА 2. Изучение клеточного деления цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 с помощью методов функциональной протеомики 75
2.1. Первая белковая карта дикого типа Synechococcus sp. РСС 7942 75
Введение 75
Материалы и методы 77
Результаты и обсуждение 81
2.2. Сравнительный протеомный анализ клеток мутантов с нарушенным клеточным делением и штамма дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 . 96
Введение 96
Материалы и методы 98
Результаты и обсуждение і 02
Выводы из главы 2 129
ГЛАВА 3. Выделение и молекулярно-генетический анализ новых ДНК-связывающих белков, участвующих в регуляции клеточной дифференцировки цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 130
Введение 130
Материалы и методы 132
Результаты и обсуждение 140
Выводы из главы 3 164
ГЛАВА 4. GAPDH-гены цианобактерии и их роль в клеточном метаболизме . 165
4.1. Генетические и биохимические доказательства различных функций двух дивергированных GAPDII
генов в катаболическом и анаболическом путях метаболизма углерода в циаиобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 165
Введение
Материалы и методы
Результаты
Обсуждение
4.2. Gapl-оперон циаиобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 кодирует гликогснфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях
Введение
Материалы и методы результаты и обсуждение
4.3. Экспрессия гена gap3 циаиобактерии Synechococcus sp. РСС 7942
концентрациям С02
Введение
Материалы и методы результаты и обсуждение выводы из главы 4
ГЛАВА 5. Получение мутантов циаиобактерии Synechocystis sp. РСС6803 для разработки систем клонирования генов фотосинтеза и устойчивости к гербицидам
Введение
Материалы и методы результаты и обсуждение выводы из главы 5
ГЛАВА 6. Создание цианобактериальных штаммов, способных продуцировать молекулярный водород .
Введение
Материалы и методы результаты и обсуждение выводы из главы 6
Заключение
Основные выводы благодарности список литературы
- Первая белковая карта дикого типа Synechococcus sp. РСС 7942
- Сравнительный протеомный анализ клеток мутантов с нарушенным клеточным делением и штамма дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942
- Генетические и биохимические доказательства различных функций двух дивергированных GAPDII
- Gapl-оперон циаиобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 кодирует гликогснфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях
Введение к работе
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ОБСУЖДЕНИЕ
4.2. Gapl-оперон циаиобактерии Synechococcus sp. РСС 7942
кодирует гликогснфосфорилазу и индуцируется в анаэробных
условиях
ВВЕДЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.3. Экспрессия гена gap3 циаиобактерии Synechococcus sp. РСС 7942
концентрациям С02
ВВЕДЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 4
Первая белковая карта дикого типа Synechococcus sp. РСС 7942
Цианобактерия S. 7942 является облигатным фотоавтотрофным микроорганизмом, принадлежащим к древней группе прокариот (Rippka et al., 1979). S. 7942, ранее известная как Anacystis nidulans R2, является первой цианобактерией, для которой была показана трансформация экзогенно добавленной ДНК (Shestakov, Khyen, 1970). S. 7942 активно используется как модельный организм в генетических и физиологических исследованиях таких важных клеточных процессов, как фотосинтез (Pakrasi et al., 1985) клеточное деление и деление пластид высших растений (Koksharova, Wolk, 2002b; Miyagishima et al., 2005), функционирование циркадных ритмов (Golden et al., 2003), активность углерод-концентрирующего механизма (Bonfil, et al., 1998), метаболизм нитрата (Sakamoto, Bryant, 1999; Vazquez-Bermudez et al., 2002), ответ на голодание по железу (Sandstrom et al., 2002) , и на стрессы, вызванные дефицитом других элементов, также как и адаптация к температурным вариациям и к различным интенсивностям света (van Waasbergen et al., 2002; Sauer et al., 2001; Sane etal., 2002).
Протеомика изучает большие наборы белков, используя биохимические методы их разделения (двумерный электрофорез в полиакриламидном геле) и идентификации. Эта быстро развивающаяся область науки может способствовать более глубокому пониманию функций генов и того, как организмы реагируют на разные физиологические воздействия. Основным объектом изучения протеомики цианобактерий до сих пор была S. 6803 (Sazuka et al., 1999; Huang et al., 2002). Недавно начаты исследования по протеомике Nostoc commune DRHl (Ehling-Schulz et al., 2002) и Nostoc punctiforme PCC 73102 (Hunsucker et al., 2004). К настоящему времени опубликовано всего несколько работ, в которых проводился двумерный электрофорез и идентификация нескольких специфичных для конкретных условий выращивания белков S. 7942 (Gorl et al., 1998; Pandey et al., 2000; Cha et al., 2005). Активные исследования по протеомике 5.7942 становятся возможны вследствие наличия базы данных, содержащей информацию о геноме этой цианобактерий (http://genome.jgi-psf.org/flnished microbes/synel/synel.home.html ). Существование белков, аннотированных как «гипотетические», может быть подтверждено методами протеомики. Обнаружение реального существования предсказанных генных продуктов важно для правильной аннотации генома. Кроме того, пост-трансляционные модификации белков часто не очевидны из последовательности ДНК, они выявляются обычно в результате протеомных исследований, основанных на анализе результатов двумерного (2-Д) электрофореза в полиакриламидном геле. Уровень таких модификаций можно оценить путем идентификации белковых пятен, кодируемых одним и тем же геном, но находящихся в разных позициях на 2-Д гелях. Такие модификации могут быть связаны с функцией или активностью белка (VanBogelen et al., 1999).
Целью данного исследования было построение первого белкового профиля клеток цианобактерий S. 7942.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования.
Клетки штамма дикого типа S. 7942 выращивали в среде BG11 (Rippka et al., 1979) в 100-мл колбах при 25С при постоянном освещении (18 дМолей фотонов м"2 сек"1) на вращающейся качалке в течение трех дней. Экстракция и разделение белков. 50 мл культуры цианобактерий собирали с помощью центрифугирования (3000xg) при 4С в течение 5 минут, а затем замораживали при минус 75 С и хранили так до использования. Осадок цианобактериальных клеток ресуспендировали в 300 мкл буфера для экстракции (8М мочевина, 0,5% [v/v] IPG буфер [Amersham Biosciences, Sweden] рН 3-Ю, 2% [w/v] CHAPS, бромфеноловый синий [следы], ингибиторы протеаз [Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche Diagnostics Scandinavia AB, Sweden], 0,28% DTT [w/v]. Затем образцы подвергали пяти циклам замораживания в жидком азоте с последующим оттаиванием, после чего обрабатывали ультразвуком в течение 6 циклов в течение 2 сек в каждом цикле, и выдерживали 40 секунд во льду для охлаждения и предотвращения карбомилирования (McCarthy et al., 2003). После этого образцы центрифугировали при 15800 х g в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатанты, содержащие белки, собирали и хранили при минус 20С до момента использования. Концентрацию белка измеряли с помощью RC DC Protein Assay kit (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).
Сравнительный протеомный анализ клеток мутантов с нарушенным клеточным делением и штамма дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942
Одноклеточная цианобактерия S. 7942 является модельным организмом для изучения генетического контроля цианобактериального клеточного деления (Dolganov and Grossman, 1993; Koksharova and Wolk, 2002; Miyagishima et al, 2005) и деления пластид высших растений (Vitha et al, 2003). Два новых гена, ответственных за клеточное деление, ftn2 nftn6, в S. 7942 были обнаружены в результате использования транспозонного мутагенеза с транспозоном Тп5-692. Мутантная ДНК была клонирована и секвенирована (GenBank accession nos. AF421196 и AF421197). Обозначение FTN означает /ilamen/atio«, поскольку клетки этих двух мутантов очень удленены. Они более чем в 10 раз длиннее клеток дикого типа вследствие нарушения нормального клеточного деления (Koksharova and Wolk, 2002). Белок Ftn2 содержит DnaJ домен, одиночный TPR повтор и характерную последовательность лейцинов (leucine zipper pattern), что позволяет предположить, что белок Ftn2 может быть частью белкового комплекса и может выполнять регуляторные функции. Белок Ftn6 специфичен для цианобактерии, не имеет консервативных доменов, функция его неизвестна (Koksharova and Wolk, 2002). В мутантах Ftn2 и Ftn6 не формируются четко определенные Z кольца; однако, разница в уровне белка FtsZ у мутантов по сравнению с диким типом несущественна (Miyagishima et al, 2005). Эти мутанты делятся случайным образом. На месте образования септы в клетках мутантах Ftn2 и Ftn6 отмечена незначительная и диффузная локализация FtsZ белка (Miyagishima et al, 2005). Поэтому можно предположить, что эти мутанты дефектны в процессе размещения белка FtsZ в сайте деления или в процессе последующей сборки Z кольца. Растительный ортолог белка Ftn2 в Arabidopsis thaliana, ARC6, и в цианобактерий 5.6803, ZipN, вероятно непосредственно связываются с белком FtsZ (Vitha et al., 2003; Mazouni et al., 2004). He известно, взаимодействует ли белок Ftn6 с белком FtsZ, но ясно, что потеря этих двух ftn генов дезорганизует деление клеток цианобактерий (Koksharova and Wolk, 2002; Mazouni et al., 2004; Miyagishima et al, 2005). В случае потери растительного ортолога белка Ftn2 нарушается и деление хлоропластов высших растений (Vitha et al., 2003).
Клеточное деление - это хорошо скоординированный процесс. Точная регуляция и размещение аппарата клеточного деления вовлекает большое количество структурных и регуляторных компонентов, многие из которых до сих пор не идентифицированы. Потеря правильной регуляции механизма деления клетки часто ведет к формированию очень длинных и/или мини клеток. Такоке ненормальное изменение размера может вызвать сильный внутренний стресс в мутантных клетках и может существенно изменить их клеточную физиологию. Когда клеточное деление блокировано, вероятно, что многие клеточные метаболические системы, которые регулируются клеточным циклом, будут затронуты или изменятся в порядке адаптации к новым условиям в клетке, отличающейся так сильно своей морфологией от дикого типа. Совсем мало известно на сегодняшний день об изменениях, происходящих на белковом уровне в клетках с нарушенным делением.
Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2-Д гель) (O Farrell, 1975) явдяется pre-eminent инструментом для наблюдения за изменениями в протеоме. Этот подход пригоден для изучения ответов клеток бактерий на условия стресса (Neidhardt and VanBogelen, 2000). Однако, протеомные исследования ответов на стресс у цианобактерий, включая потенциально стрессовые условия, которые могут быть созданы блоком клеточного деления, до сих пор очень лимитированы. Протеомный анализ был использован для идентификации нескольких периплазматических белков, синтезируемых в клетках 5.6803, подвергнутых солевому стрессу (Fulda et al, 2000). В другом исследовании 2-Д гель-электрофорез с предшествующим ему мечением белков in vivo [358]метионином был применен для изучения продолжительного хлорозиса клеток 5.7942 (Sauer et al., 2001) с последующей идентификацией небольшого количества белков.
В этом исследовании нашей целью было установление спектра клеточных функций, связанных с блокированным клеточным делением и плейотропным ответом, индуцированным ftn2 и ftn6 мутациями в 5.7942. Мы впервые описываем и сравниваем протеомы мутантов по клеточному делению и дикого типа S. 7942, представляем идентифицированные белки, которые экспрессируются по разному в этих штаммах. Предполагаемые функции этих белков мы обсуждаем в свете клеточных функций и метаболических путей, затронутых нарушенным клеточным делением.
Генетические и биохимические доказательства различных функций двух дивергированных
В растениях фотосинтетический цикл Кальвина и гликолиз/глюконеогенез функционируют в двух различных метаболических компартментах, в хлоропласте и цитоплазме клетки, соответственно. Эти компартменты разделены физически оболочкой хлоропласта, несущей определенный набор специфических транспортных систем (Stitt, 1990). Как следствие этого, разнообразные реакции, общие для обоих метаболических путей катализируются различными изоферментами, уникальными для каждого компартмента (Gottlieb, 1982). Хлоропластная и цитоплазматическая фосфорилирующие глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) являются примером таких изоферментов. Они катализируют одну и ту же реакцию 1,3-бифосфоглицерат + NAD(P)H «- глицеральдегид-3-фосфат + NAD(P)+ в каждом компартменте, но отличаются в отношении косубстратной специфичности, изоферментного полиморфизма, состава субъединиц и первичной структуры (Brinkmann et al., 1989; Cerff, 1978; Cerff, 1982; Cerff, Chambers, 1979; Martin, Cerff, 1986).
В отличие от наземных растений и водорослей, цианобактерий, свободноживущие родственники хлоропластов (Gray, 1993), не имеют органелл и соответственно физических барьеров их оболочек, разграничивающих биосинтетические реакции цикла Кальвина от реакций гликолиза/глюконеогенеза.
Кроме того, цианобактериальные тилакоидные мембраны несут как фотосинтетическую, так и дыхательную электрон-транспортные цепи, которые связаны через цитохром b6/f комплекс и ряд общих переносчиков электронов, таких как пластохинон, пластоцианин и цитохром Ь553 (Morand et al.,1994; Schmetterer, 1994). Поэтому можно было бы ожидать, что функционально эквивалентные реакции в анаболическом и катаболическом путях цианобактерий могли бы катализироваться единичными амфиболическими ферментами. В самом деле, предшествующие биохимические исследования описывающие единственную GAPDH, активную как с NADP, так и с NAD в трех различных видах Anabaena (Hood, Carr, 1967, 1969; Papen et al., 1986), казалось, согласуются этой гипотезой. Однако, более поздние сообщения о молекулярном клонировании и характеристике нескольких GAPDH генов в A.v. (Martin et al., 1993) не согласуются с этим ранним взглядом. Неожиданно, три отдельные достаточно сильно дивергировавшие GAPDH гена были обнаружены в этой цианобактерий, два из которых, gapl и gap2, тесно связаны с эукариотическими ядерными генами GapC и GapAB, кодирующими цитоплазматическую и хлоропластную GAPDH, соответственно. На основе этих данных была предложена гипотеза о том, что оба эукариотических гена, как кодирующий хлоропластную GAPDH, так и цитоплазматическую GAPDH, были перенесены в ядро от эубактериальных предков хлоропластов и митохондрий, соответственно (Liaud et al., 1994; Martin et al., 1993; Cerff, 1995).
Поскольку структурные сравнения ясно указывали на специфическую филогенетическую связь между gapl и GapC с одной стороны, и gap2 и GapAB, с другой стороны, а функциональные роли gapl и gap2 в метаболизме цианобактерий не были до сих пор установлены, и поэтому использование методов молекулярной генетики для выяснения этого вопроса расматривалось нами вполне правомерным. Одноклеточная цианобактерия Synechocysis РСС 6803 представляется очень удобным модельным объектом для такого рода исследований. Этот штамм способен расти фотоавтотрофно и фотогетеротрофно (Anderson, Mcintosh, 1991; Rippka et al., 1979) и для него применимы методы бактериальной генетики, включающие хромосомную и плазмидную трансформацию (Shestakov, Reaston, 1987). В данной работе мы продемонстрировали, что гены gapl и gap2 также существуют в Synechocysis РСС 6803. Полностью сегрегированные нулевые мутанты были получены с помощью инсерционного мутагенеза либо для gapl гена, либо для gap2 Synechocysis. Неожиданно оказалось, что мутанты проявляют реципрокные физиологические фенотипы в условиях анаболического или катаболического роста, что позволяет предположить, что продукты генов gapl и gap2 играют различные роли в гликолизе и в цикле Кальвина/глюконеогенезе, соответственно.
Gapl-оперон циаиобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 кодирует гликогснфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях
Одноклеточная цианобактерия S. 6803 сходна с нитчатой цианобактерией A.v. в том, что она имеет два GAPDH гена, gapl и gap2, которые гомологичны ядерным генам GapC и GapAB, кодирующим цитоплазматическую и хлоропластную GAPDH эукариот (рисунок 21). Хотя эубактерии, в общем, содержат ряд ортологов GAPDH генов, gapl и gap2 были найдены до сих пор ислючительно в цианобактериях {gapl и gap2) и в протеобактериях (только gapl), свободноживущих родственниках хлоропластов и митохондрий, соответственно (Cerff 1995; Gray 1993; Martin et al, 1993). Synechocystis отличается от A.v. отсутствием третьего цианобактериального GAPDH гена с неизвестной фунцией. Она также отличается в отношении gapl оперонной структуры, которая в A.v. является полицистронной с дополнительными открытыми рамками считывания, кодирующими пируваткиназу и трансальдолазу. В Synechocystis оба gap гена представлены моноцистронными единицами, а гены для пируваткиназы и трансальдолазы размещаются в разных участках генома. Таким образом, gap гены и окружающие их последовательности экстенсивно перестраивались в геномах A. v. и Synechocystis, двух цианобактериях, способных к гетеротрофному росту.
Предшествующие исследования цианобактериальных GAPDH, изучавшихся при использовании различных видов Anabaena, приводили к выводу, что фермент существует в единственной "амфиболической" форме с двойной косубстратной специфичностью для NADP и для NAD (Hood, Carr, 1967; 1969; Papen et al., 1986). Это утверждение позже было обновлено также для GAPDH Synechocystis РСС 6803 (Valverde et al., 1995; 1997). Эти авторы клонировали gap2 ген путем функциональной комплементации gap" мутантов Е. соИ и не смогли найти свидетельств существования дополнительных форм GAPDH в экстрактах из клеток дикого типа Synechocystis РСС 6803. Приводимые нами генетические и биохимические данные не согласуются с этими наблюдениями. Наши данные показывают, что оба гена gapl и gap2 экспрессируются и существенны для углеродного метаболизма в Synechocystis.
Структурные и филогенетические взаимосвязи между GAPDH генами из протеобактерий и цианобактерий с одной стороны и фотосинтетическими эукариотами с другой, поднимают интересные вопросы относительно метаболических ролей цианобактериальных ферментов Gapl и Gap2, которые, в отличие от эукариотических GapC и GapAB, не отделены мембранами органелл in situ. Как видно из рисунка 24 (С и D), оба фермента отличаются по их косубстратной специфичности, что находится в соответствии со свойствами их аминокислотных последовательностей, в особенности консерватизм аминокислоты пролина-188 в Gapl, но не в Gap2, указывающей на NAD-специфичность первого фермента и двойную косубстратную специфичность для NAD и NADP в случае второго фермента, соответственно (Clermont et al.,1993). Фенотипы полученных нами мутантов демонстрируют тот факт, что фотосинтез в Synechocystis зависит от фермента Gap2 (Таблица 12, строка 2). NAD-специфичный фермент Gapl не может выполнить эту функцию (Таблица 12, строка 3), вероятно вследствие того, что не может использовать NADPH, образуемый в результате световых реакций фотосинтеза, что может привести к быстрому фотоингибированию и фотохимической деструкции фотосинтетического аппарата (Barber, 1995; Barber, Andersson 1992).
Из представленных результатов ясно, что Gap2 Synechocystis функционирует в цикле Кальвина так же, как функционирует его гомолог GapAB в хлоропластах высших растений. Однако, Gap2 более активен с NAD, чем с NADP, в то время как GapAB функционирует исключительно с NADP in vivo, хотя он имеет некоторую остаточную NAD активность in vitro (Cerff 1978). Более важно то, что в противоположность GapAB, фермент Gap2 работает также вне цикла Кальвина в течение гетеротрофного роста на органических кислотах, таких как цитрат, малат, ацетат и пируват. Наши данные указывают на то, что в условиях нефотосинтетического роста (слабая освещенность) существуют два потока углерода, идущие в противоположных направлениях: гликолиз с одной стороны и биосинтез Сахаров из органических кислот (глюконеогенез, рисунок 25) с другой стороны, и требующие активности двух различных ферментов, кодируемых генами gapl и gap2, соответственно.
