Содержание к диссертации
Введение
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Распределение (TTAGGG)n повторов в хромосомах разных видов позвоночных.
2.2 Теломеры млекопитающих: структура и функции .
2.3. Внутрихромосомная локализация (TTAGGG)n повторов.
2.4. Классификация внутрихромосомных (TTAGGG)n сайтов и внутрихромосомных (TTAGGG)n повторов.
2.5. Структура и нестабильность внутрихромосомных (TTAGGG)n последовательностей в клетках китайского хомячка.
2.6. Гипотезы происхождения внутрихромосомных (TTAGGG)n повторов.
2.7. Нестабильность внутрихромосомных (TTAGGG)n повторов.
2.8. Строение теломерных белков TRF1 и TRF2.
2.9. Функции теломерных белков TRF1 и TRF2.
2.10. Строение и функция белка танкираза 1, участвующего в регулировании функции теломер.
2.11. Белок Ки и его роль в защите теломер от слияния хромосомных концов.
2.12. Теломеро-связывающий комплекс, выделенный из спермы человека.
3. Материалы и методы
3.1. Линии клеток, использованные в работе.
3.2. Ревертазно-транскрипционная полимеразная цепная реакция (РТ-ПЦР) и клонирование ПЦР-фрагмента в плазмидные вектора .
3.3. Трансформация бактериальных штаммов.
3.4. Выделение плазмидной ДНК, определение ориентации встроенного гена TRF1.
3.5. Трансфекция клеток.
3.6. Вестерн - блот - анализ.
3.7. Иммунофлуоресцентный анализ.
3.8. Приготовление метафазных пластинок хромосом.
3.9. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).
3.10. Перераспределение флуоресценции после выжигания лазером (FRAP).
3.11. Обработка клеток вортманнином (WM).
3.12. Микроскопия и анализ изображений.
4. Результаты и обсуждение
4.1. Клонирование человеческого гена TRF1.
4.2. Визуализация белка TRF1-V5 в клетках линий CV-1 и белка GFP-TRF1 в клетках линии А549.
4.3. Визуализация белка GFP-TRF1 в интерфазных ядрах КХ клеточных линий СНО-К1 и V79.
4.4. Локализация белка GFP-TRF1 в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах клеток китайского хомячка.
4.5. Одновременная визуализация белка GFP-TRF1 и двунитевых разрывов в облученных клетках китайского хомячка.
4.6. Диффузионная подвижность белка GFP-TRF1 в живых клетках V79 и ее изменение воздействием вортманнина.
4.7. Обработка клеток V79 вортманнином повышает частоту спонтанных и индуцированных блеомицином хромосомных аберраций.
4.8. Совместная визуализация белка GFP-TRF1 и белка танкиразы 1 в клетках китайского хомячка.
4.9. Экспрессия танкиразы 1 приводит к возрастанию частоты спонтанных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка.
Выводы
- Теломеры млекопитающих: структура и функции
- Ревертазно-транскрипционная полимеразная цепная реакция (РТ-ПЦР) и клонирование ПЦР-фрагмента в плазмидные вектора
- Визуализация белка TRF1-V5 в клетках линий CV-1 и белка GFP-TRF1 в клетках линии А549.
- Совместная визуализация белка GFP-TRF1 и белка танкиразы 1 в клетках китайского хомячка.
Теломеры млекопитающих: структура и функции
Геномная ДНК стремится быть кольцевой. Геномы бактерий, плазмид, бактериофагов и митохондриальная ДНК обычно замкнуты в кольцо. В противоположность всем перечисленным видам хромосом, хромосомы эукариот являются линейными. Важнейшим недостатком линейных хромосом является их связывание со свободными концами ДНК, присутствующими в эукариотических ядрах. Теломеры - это специализированные концевые элементы хромосом, которые устраняют эту проблему и выполняют ряд важных функций. ДНК компонент теломер у позвоночных — это несколько т.п.н. коротких повторяющихся (TTAGGG)n последовательностей, получивших название теломерные повторы (ТП). ТП идентифицированы как наиболее дистальный cis элемент в теломерах хромосом позвоночных. Теломерная теория клеточного старения и бессмертия (Harley, 1991) описывает ТП как элементы, определяющие продолжительность жизни теломеразо негативных соматических клеток. Клеточный кризис индуцируется в процессе размножения первичных клеток, когда ТП становятся короче критической длины 1.5 - 2.0 т.п.н. (Harley, 1991; Counter et al., 1992), в то время как иммортализованные клетки могут обойти такой кризис стабилизацией длины своих теломер (Harley, 1995). ТП служат сайтами связывания для многих белков, которые компенсируют прогрессивное укорачивание теломер в процессе репликации (Blackburn, 1995), защищают концы от разрушения нуклеазами и от концевого слияния теломер (Bougrain and Katinka, 1991; van Steensel et al., 1998). Теломерные белки играют также важную роль в присоединении хромосом к ядерному матриксу (Luderus et al., 1996) и в разделении хромосом в митозе и мейозе (Conrad et al., 1997). Потеря теломер или их нарушение может приводить к старению клетки, ее гибели или геномной нестабильности. К дисфункции теломер могут приводить различные явления. Теломеры могут повреждаться непосредственно токсичными агентами или нарушениями в процессе репарации. Структура теломер может быть нарушена изменением экспрессии или функции некоторых белков, связывающихся с теломерами. Теломеры могут постепенно укорачиваться вследствие процесса ДНК репликации, при котором теряется 50 - 200 п.н. З -однонитевой теломерной ДНК, нереплицирующейся в каждой S-фазе. Таким образом, в отсутствии теломеразы или других механизмов восполняющих теломерную ДНК, пролиферирующие клетки постепенно теряют теломерную ДНК и, в конечном счете, получают критически короткие и нефункционирующие теломеры (Blackburn, 2000). Большинство нормальных клеток млекопитающих отвечают на критически короткие или дисфункционирующие теломеры клеточным старением (Sherr and DePinho, 2000) или индукцией апоптоза (Karlseder et al., 1999).
В настоящее время мало известно о том, как теломеры сигнализируют клетке, какой путь ей предпочесть: старение или апоптоз. Важнейшая функция теломер заключается в обеспечении полноты репликации хромосомных концов, так как обычные полимеразы не могут выполнить эту задачу. Клетки имеют механизм, контролирующий длину теломер и обеспечивающий добавление теломерных повторов к хромосомным концам (Shore, 1997). Эту функцию у многих эукариот выполняет теломераза — обратная транскриптаза, которая добавляет TTAGGG повторы в 3 концы хромосом позвоночных (Greider and Blackburn, 1985). Поддержание теломерных TTAGGG повторов в концах хромосом человека может осуществляться как теломеразой, так и другими, альтернативными, механизмами (Bryan et al., 1997), что является существенным для продолжительной культивации клеток in vitro. Проблема репликации хромосомных концов у человека получила особое внимание из-за возможного значения в проблеме старения и проблеме канцерогенеза (de Lange et al., 1990; Harley et al., 1990; Counter et al., 1994). Теломераза неактивна в большинстве соматических клеток, только в зародышевых клетках она высоко активна in vivo (Wright et al., 1996). Это приводит к двукратному удлинению теломерной ДІЖ в процессе сперматогенеза (de Lange et al., 1990). Удлиненные теломеры переносятся в зиготу в процессе оплодотворения и, начиная с этого момента, служат видоспецифическим нулевым временем длины теломер, которая определяет число последующих клеточных делений (Gineitis et al., 2000). Поскольку теломеры укорачиваются приблизительно на 100 п.н. за деление, то, как только длина теломер становится неприемлемо короткой (1.5-2.0 т.п.н.), деление такой клетки прекращается. Помимо зародышевых клеток теломераза также активна в раковых клетках (Kim et al., 1994; Shay and Bacchetti, 1997). Активность теломеразы в опухолях приводит к преодолению прогрессивной потери теломерных последовательностей и тем самым приводит клетки к безостановочному делению. Если теломераза неактивна в раковых клетках, то рост терминальных концов арестуется, а это ведет к старению или умиранию клеток, так как теломеры становятся короткими (Counter et al., 1992). Таким образом, укорочение теломер рассматривалось как механизм, который подавляет рост опухоли, а активирование теломеразы считалось главным звеном, поддерживающим рост раковых клеток (de Lange et al., 1999). Важным моментом в понимании функции теломер явилось осознание того, что они являются не просто буферной зоной, которая предотвращает потерю важнейших последовательностей, а специализированным комплексом, который позволяет клетке отличать концы ДНК, образовавшиеся в результате повреждений хромосом, и натуральные хромосомные концы. В то время как повреждения хромосом активируют процессы, контролирующие ДНК повреждения и их репарацию, теломеры не детектируются как концы поврежденной ДНК.
Ревертазно-транскрипционная полимеразная цепная реакция (РТ-ПЦР) и клонирование ПЦР-фрагмента в плазмидные вектора
РТ-ГЩР проводили с использованием РТ-ПЦР набора (Titan-Oneube-Kit «Boehringer», Германия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. В реакции использовали тотальную мРНК лимфобластоидной клеточной линии человека 2139 («IARC», Франция); Реакцию проводили на амплификаторах PCR Sprint («Habaid Limited», Великобритания). Условия реакции: реакцию проводили в 50 мкл смеси, которая содержала: 1 мкг мРНК, ЮОнг каждого праймера, 2мМ дАТФ, 2мМ дЦТФ, 2мМ дГТФ, 2мМ дТТФ, 1.5 мМ MgCl2, , їх ПЦР буферный раствор, 8 ед AMV-RT, 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы («Boehringer», Германия). Условия проведения реакции: РТ: +42С - 1 час ; ПЦР: первый цикл: 94С - 5 мин, 52С - 1 мин, 72С - 1.5 мин; 34 цикла: 94С - 1 мин, 52С -2 мин, 72С - 2 мин; последний цикл 72С - 7 мин. Для получения кДНК фрагмента человеческого гена TRF1 использованы следующие две пары олигонуклеотидов: 1)TRF1-1 - CAAGCTTTAACATGGGGGAGGATG; Tl-F - GTCTTCGCTGTCTGAGGAAATC («BioTeZ, Berlin-Buch», Германия). кДНК фрагмент, амплифицированный данными праймерами содержал полную кодирующую последовательность человеческого гена TRF1 за исключением С-концевого стоп-кодона, который был включен в рекомбинантную плазмиду из кодирующей последовательности V5 эпитопа экспрессионного вектора pcDNA3.1/V5-HisOPO «Invitrogen». Клонированием данного фрагмента получена рекомбинантная плазмида TRF1-C-V5, кодирующая полноразмерный человеческий белок TRF1 слитый с V5 эпитопом. 2) T1-N1 - GGGGAGGATGTTTCCTCAG; T1-N2 - GCACAAACCCTCATTAATTGATGGTC («BioTeZ, Berlin-Buch», Германия). кДНК фрагмент, амплифицированный данными праймерами использован для получения рекомбинантной плазмиды GFP-NRF1. Этот фрагмент кДНК имел С-концевой стоп-кодон, но не содержал N-концевого ATG-кодона гена TRF1, который был заменен в рекомбинантной плазмиде кодирующей последовательностью гена зеленого флуоресцентного белка — green fluorescent protein (GFP) экспрессионного вектора pcDNA3.1/NT-GFP-ТОРО «Invitrogen». Полученная плазмида GFP-NRF1 содержала последовательность, кодирующую полноразмерный человеческий белок TRF1 слитый с белком GFP. Клонирование кДНК - фрагмента человеческого гена TRF1 в плазмидные вектора: Для клонирования использовали экспрессионные вектора: pcDNA3.1/V5-His-ТОРО, pcDNA3.1/NT-GFPOPO («Invitrogen»; США). Исходно линеаризованные вектора pcDNA3.1/V5-HisOPO, pcDNA3.1/NT-GFPOPO, содержащие одиночный выступающий 3 остаток дезокситимидина (Т), лигировали с продуктами RT-ПЦР-реакции, содержащими кДНК фрагмент человеческого гена TRF1, имеющими одиночный выступающий 3 остаток дезоксиаденозина (А).
Условия реакции: К 4 мкл РТ-ПЦР продукта, содержащего 100 нг кДНК добавляли 1 мкл «активированного» вектора, который содержал топоизомеразу I, мягко перемешивали и инкубировали при КТ в течение 5 минут (22 - 25). Через 5 мин останавливали реакцию добавлением 1 мкл раствора: 0.3М NaCl, 0.06М MgCl. Полученными в результате лигирования плазмидами сразу трансформировали бактериальный штамм E.coli JM109. 3.3. Трансформация бактериальных штаммов. Бактериальный штамм E.coli JM109 трансформировали сконструированнми плазмидами TRF1-C-V5 и GFP-NRF1 по следующей методике: Приготовление компетентных клеток: из отдельной колонии выращивали ночную затравку в 5 мл среды LB на качалке при 37, 1 мл ночной затравки помещали в 100 мл среды LB и выращивали культуру до плотности А550 = 0.5-0.6, затем охлаждали в ледяной бане до 0С, 30 минут, центрифугировали при 3000 об/мин при 0С, 20 минут, удаляли среду, к клеткам добавляли 50 мл ОЛМ СаСЬ при 0С, инкубировали при 0С 45 мин, повторно центрифугировали. К клеткам добавляли 1мл ОЛМ СаСЬ и инкубировали при 0С 2 часа. Введение плазмидной ДНК в клетки: 20 нг плазмидной ДНК добавляли к 200 мкл компетентных клеток, инкубировали при 0С 30 минут, помещали в 42С на 1,5 минуты, инкубировали при 0С 10 минут, переносили в 1 мл LB (37С) и выращивали в течение 1 часа при мягком шейкировании при 37С. Высевали клетки из расчета 0.3-0.5 мл на чашку диаметром 90 мм на селективный агар с ампицилином (100мкг/мл). 3.4. Выделение плазмидной ДНК, определение ориентации встроенного гена TRF1. Плазмидная ДНК была выделена из лизатов E.coli с использованием набора фирмы QUIAGEN. Правильную ориентацию встроенного гена TRF1 в плазмиде TRF1-C-V5 определяли методом рестриктазного анализа. Плазмидную ДНК TRF1-C-V5 расщепляли рестриктазой Xhol при 37С в течение часа и анализировали в 0.9% агарозном геле. Плазмиду, содержащую кодирующую последовательность человеческого гена TRF1, слитого с V5 эпитопом в ориентации от З -конца к 5 -концу кодирующей последовательности использовали для трансфекции клеток линии CV-1. Плазмиду, содержащую ген TRF1 в обратной ориентации использовали для трансфекции клеток линии CV-1, как контроль. Ориентацию гена TRF1 в плазмиде GFP-NRF1 определяли с помощью ПЦР, используя в качестве праймера олигонуклеотид 5 - TAGAAGGCACAGTCGAGG - 3 (pcDNA3.1/BGH, «Invitrogen»). Наличие кодирующей ДНК последовательности человеческого гена TRF1 в рекомбинантных плазмидах TRF1-C-V5 и GFP-NRF1 подтвердили сиквенированием. 3.5. Трансфекции клеток. Трансфекцию клеток линий CV-1, А549 плазмидой TRF1-C-V5 проводили стандартным методом кальций-фосфатной преципитации (van der Eb, A.J. and Graham, F.L., 1980) с небольшими модификациями. Кальций-фосфатные преципитаты, содержащие 6-12 мкг плазмидной ДНК (в расчете на чашку диаметром 60 мм), добавляли к клеткам, предварительно удалив ростовую среду. Через 40 мин инкубации в атмосфере СОг к клеткам добавляли ростовую среду с 2% фетальной сыворотки, и продолжали инкубацию в течение 16 часов, затем среду заменяли на свежую, содержащую 10% фетальной сыворотки и инкубировали в атмосфере СОг в течение 48 — 72 часов. Трансфекцию клеток линий СНО-К1, V79-4 плазмидой GFP-NRF1 проводили с использованием Trans-Fast реагента («Promega», США). Клетки высевали накануне с таким расчетом, чтобы плотность монослоя культуры на следующий день составляла 80%. Для линии V79 это составляло: 3,2x10 клеток - на ячейку размером 2 см х 1 см Chamber-slide («Lapek», США); ЗхЮ5- на чашку диаметром 35 мм; 5,5х105— на чашку диаметром 60 мм.
Приготовление смеси ДНК с Trans-Fast реагентом: из расчета на одну ячейку размером 2 см х 1 см: в пробирку помещали 200 мкл среды (RPMI или DMEM-полной с сывороткой и антибиотиками, нагретой до +37С), добавляли 1 мкг ДНК, 3 мкл Trans-Fast реагента, мягко перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре (КТ) на 15 минут; из расчета на чашку диаметром 35 мм в пробирку помещали 800 мкл среды, добавляли 3-4 мкг ДНК, 9-12 мкл Trans-Fast реагента. Через 15 мин удаляли среду с клеток, добавляли к клеткам смесь ДНК с Trans-Fast - реагентом и помещали в СОг инкубатор на 1 час. Через 1 час добавляли к клеткам полную среду и инкубировали необходимое время (24 - 72 час). Стабильные клоны клеток линии СНО-К1, экспрессирующие белок GFP- TRF1, были отобраны выращиванием на ростовой среде, содержащей 800 мг/мл G-418. Через несколько дней после временной трансфекции клетки СНО-К1 помещали в среду, содержащую G-418 и выращивали в этой среде в течение 1 -2 недель до образования отдельных клонов. Экспрессию GFP в выросших клонах анализировали методом прямой микроскопии живых клеток. Клоны, содержащие зеленый флуоресцентный сигнал (GFP), отбирали и использовали для дальнейшей работы. 3.6. Вестерн - блот — анализ. После трансфекции плазмидой TRF1-C-V5 клетки CV-1, выращенные на чашках Петри инкубировали в ростовой среде 72 час, промывали PBS и добавляли лизирующий буфер: 2% SDS, 12% глицерин, 0.25 М Трис НС1 рН 6.8. Клеточный лизат собирали с помощью резинового шпателя, помещали в микроцентрифужные пробирки, добавляли раствор ЇМ дитиотритола (ДТТ) до конечной концентрации 0.1 М, прогревали при 95С — 12 мин. Полученные образцы тотальных клеточных белков наносили в 12% полиакриламидный гель. Электрофорез проводили в 1х Трис-глициновом буфере: 25 мМ Трис, 250 мМ глицин, 0.1% SDS. Перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану («Hoefer», США) производили электрофоретическим методом в течение 1.5 ч при 4С, при напряжении 0.5 V/см С использованием буферного раствора: 12 мМ Трис НС1, 95 мМ глицин, 20% метанол. После переноса мембрану инкубировали 1 ч в блокирующем буфере: ЮмМ Трис НС1, 150мМ NaCl, 0.05% Tween-20, 5% обезжиренное молоко, рН 8.0, промывали PBS/0.1%Tween-20 3 раза по 10 мин, при КТ и инкубировали с антителами. Все антитела разводили в 0.5% растворе блокирующего реагента («Roche», Германия)/ PBS/0.02%Tween-20.
Визуализация белка TRF1-V5 в клетках линий CV-1 и белка GFP-TRF1 в клетках линии А549.
Клетки линии CV-1 трансформировали плазмидой TRF1-C-V5, которая содержала последовательность, кодирующую полноразмерный человеческий белок TRF1 слитый с V5 эпитопом. Трансфецированные клетки проанализировали с помощью Вестерн-блота. Для трансфекции использовали плазмиды, содержащие кДНК в двух ориентациях. Белок ожидаемого размера мы визуализировали только в клетках, трансфецированных плазмидой, несущей ген TRF1 слитый с V5 эпитопом в правильной ориентации (рис. 9, дорожка 2), которую мы назвали TRF1-C-V5 и не визуализировался в клетках, трансфецированных плазмидой, несущей ген TRF1 в обратной ориентации (рис. 9, дорожка 1), которую мы использовали, как контроль. С помощью первичных антител против V5- эпитопа («Invitrogen»), методом иммунофлуоресценции мы проанализировали клетки CV-1, трансфецированные плазмидой TRF1-C-V5. В интерфазных ядрах данных клеток видны множественные фокусы с V5 (рис. 9 В). Клетки человеческой линии А549, трансфецированные плазмидой GFP-NRF1, также содержали множественные зеленые фокусы белка GFP в интерфазных ядрах, напоминающие фокусы, которые мы наблюдали в клетках CV-1. Исходя из того факта, что наличие полной кодирующей последовательности гена TRF1 в плазмидах TRF1-C-V5 и GFP-NRF1 подтверждено сиквенированием, и что белок TRF1 исходно был идентифицирован, как теломерный белок человека (Chong et al., 1995), мы считаем, что детектированные нами фокусы, наблюдаемые в ядрах трансфецированных клеток CV-1 и А549, представляют теломеры, содержащие связанные с ними рекомбинантные белки. Модальное число хромосом в культивируемых клетках CV-1 равно 60, соответственно, число теломер равно 120. Нами детектировано меньшее число фокусов в интерфазных ядрах трансфецированных клеток (рис. 9 В). Возможно, клетки CV-1 имеют часть теломер слишком коротких, чтобы накапливать существенные количества В клетках КХ линий СНО-К1 и V79, временно трансфецированных плазмидой GFP-NRF1, картина распределения белка GFPRF1 в интерфазных ядрах сильно отличалась от картины, наблюдаемой в клетках CV-1 и А549 (рис. 10). Были детектированы крупные образования, содержащие «зеленый» флуоресцентный белок (GFP) (Krutilina et al., 2001), число которых было равно (14 ± 3). Такие образования мы наблюдали, как в фиксированных формальдегидом клетках (рис. 10), так и в живых клетках (рис. 11) (Krutilina et al., 2003). Число хромосом в культивируемых клетках КХ равно 21 Число наблюдаемых нами фокусов явно не соответствовало числу теломер в хромосомах КХ (42).
В клетках КХ происходит очень интенсивная потеря теломерных последовательностей в процессе иммортализации и культивирования клеток in vitro, поэтому они становятся настолько короткими (менее 1 т.п.н.) (Slijepcevic and Hande, 1999), что не детектируются методом иммунофлуоресценции. Известно, что общее количество внутренних (TTAGGG)n блоков в геноме китайского хомячка равно 18 (Slijepcevic et al., 1996). Число наблюдаемых нами образований было близким к этому числу (14± 3). Мы предположили, что в клетках КХ накопление белка GFPRF1 происходило не на теломерах, а на внутрихромосомных сайтах, содержащих (TTAGGG)n повторы. 4.4. Локализация белка GFPRF1 в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах клеток китайского хомячка. Чтобы подтвердить, что белок GFPRF1, действительно, связывается с внутрихромосомными (TTAGGG)n последовательностями (ВТП), мы выполнили FISH с зондом, содержащим теломерные повторы (TTAGGG)n человека «Vysis» на фиксированных формальдегидом клетках линии СНО-К1, временно трансфецированных плазмидой GFP-NRF1 (Krutilina et al., 2001). FISH сигнал был визуализирован с помощью вторичных антител, конъюгированных с родамином. Наши результаты показали, что GFP сигналы (рис. 12 слева) полностью колокализуются с сигналом FISH с (TTAGGG)n (рис. 12 справа), что очень хорошо видно на совмещенном слайде (рис. 12 средний) в одних и тех же ядрах. Данный результат подтверждает наше предположение, что белок GFPRF1 в интерфазных ядрах клеток КХ СНО-К1 взаимодействует с внутренними блоками (TTAGGG)n последовательностей хромосом. Чтобы подтвердить наличие внутрихромосомных сайтов локализации (TTAGGG)n последовательностей в хромосомах клеток линий СНО-К1 и V79, мы выполнили FISH с (TTAGGG)n зондом на метафазных пластинках, которые были приготовлены по стандартной методике с метанол - уксусной фиксацией. (TTAGGG)n зонд преимущественно связывался с внутренними не-теломерными сайтами хромосом в клетках обеих линий СНО-К1 и V79, а не с теломерами, большинство которых в иммортализованных линиях КХ СНО-К1 и V79 короче 1 т.п.н. и поэтому не детектировалась FISH анализом, что совпадает с литературными данными (Slijepcevic and Bryant, 1995). Местом локализации ВТП были предпочтительно перицентромерные области хромосом (рис. 13), что согласуется с литературными данными (Slijepcevic et al., 1996). Количество ВТП, детектированных в клетках КХ линии V79 было равно (14 ± 3), что близко к литературным данным (Slijepcevic et al., 1996). Локализация белка GFPRF1 в ВТП метафазных хромосом была показана нами на клетках СНО-К1. Были проанализированы стабильные клоны, отобранные на ростовой среде, содержащей G-418, накапливающие рекомбинантный белок GFPRF1 (рис. 14). Как видно на (рис. 14) белок FISH на стандартных метафазных пластинках был выполнен с использованием зонда, содержащего теломерные повторы «Vysis», конъюгированного с ДИГ. Сигнал был визуализирован с помощью овечьих антител против ДИГ, конъюгированных с FITC. FISH сигналы преимущественно локализованы на внутренних сайтах хромосом. Рис. 14. Локализация белка GFPRF1 на метафазных хромосомах клеток СНО-К1. Проанализированы стабильные клоны, трансформированные плазмидой GFP-NRF1. Клоны отобраны на ростовой среде, содержащей G-418. Контрастное окрашивание ДНК осуществлялось с помощью DAPI. Белок GFPRF1 локализован во внутрихромосомных сайтах. GFPRF1 локализован во внутрихромосомных сайтах метафазных хромосом клеток СНО-К1. На основании полученных результатов можно утверждать, что белок GFPRF1 взаимодействует с ВТП клеток КХ и локализуется преимущественно в перицентромерных областях хромосом. Эти данные совпадают с данными полученными другими авторами для белка TRF2 (Smogorzhevska et al., 2000), второго сиквенс-специфически взаимодействующего с (TTAGGG)n последовательностью белка. Оба белка TRF1 и TRF2 могут рассматриваться, как общие сенсоры повторов (TTAGGG)n повсеместно: в теломерах, в интерстициальных участках хромосом, в экстрахромосомных элементах.
Одновременная визуализация белка GFPRF1 и двунитевых разрывов в облученных клетках китайского хомячка. Белок Ки взаимодействует с белком TRF1 (Hsu et al., 2000), и, благодаря этому взаимодействию, белок Ки привлекается в теломеры и связывается с ними. Как известно, белок Ки, связывается с концами внутренних двунитевых разрывов ДНК и после этого может инициировать процесс НВК, подавляя при этом возможность инициации ГР. Можно предположить, что основной функцией белка TRF1, связывающегося с ВТП, является подавление ГР между ВТП. Чтобы проверить это предположение, мы проанализировали (Крутилина и др., 2003), не происходит ли перемещение белка GFPRF1 в сайты случайных ДР, индуцированных ИР. ДР были визуализированы с использованием специальных антител против гистона Н2АХ, фосфорилированного по серину в положении 139, обозначаемого как у-Н2АХ. Как известно у-Н2АХ является маркером ДР (Rogakou et al., 1999). Клетки V79, трансфецированные GFPRF1, через 48 час облучали ИР (дозой 2 Гр.), фиксировали спустя 1, 3 и 6 час, обрабатывали антителами против у-Н2АХ и анализировали колокализацию GPP - сигнала и у-Н2АХ. Мы обнаружили незначительное перекрывание между фокусами GFPRF1 и Y-H2AX в клетках, фиксированных через 1 час после облучения ИР (рис. 15), равно как и в клетках, фиксированных через 3 и 6 часов после облучения. Эти наблюдения позволяют предположить отсутствие очевидного перемещения белка GFPRF1 в сайты, содержащие случайные ДР. Следовательно, хотя белок Ки может быть привлечен в теломеры с помощью белка TRF1 (Hsu et al., 2000), белок TRF1 не привлекается в сайты случайных ДР с помощью белка Ки.
Совместная визуализация белка GFP-TRF1 и белка танкиразы 1 в клетках китайского хомячка.
Известно, что белок TRF1 элиминируется из теломер в человеческих клетках, если эти клетки были трансфецированы плазмидой, кодирующей поли-АДФ-рибозилирующий фермент танкиразу 1 (TANK1). Такое элиминирование индуцируется ингибированием ДНК-связывающей активности белка TRF1 после его специфического поли-АДФ-рибозилирования TANK1 (Smith et al., 1998). Мы подтвердили (Крутилина и др., 2003) экспрессию TANK1 во временно трансфецированных клетках V79 с помощью моноклональных антител против FLAG (рис. 18). При совместной визуализации белков GFPRF1 и TANK1 в интерфазных ядрах клеток V79, мы обнаружили негативную корреляцию между накоплением белка TANK1 и белка GFPRF1 в фокусах локализации GFPRF1 (рис. 18). Мы обнаружили, что в клетках, трансфецированных GFPRF1 и TANK1 флуоресценция «зеленого» белка GFP, значительно уменьшается (Крутилина и др., 2003). С помощью специализированной программы QS мы сравнили уровни флуоресценции «зеленого» белка GFP, связанного с ВТП, в 100 клетках, трансфецированных только GFPRF1, ив 100 клетках, совместно трансфецированных GFPRF1 и TANK1. Оказалось, что уровень флуоресценции «зеленого» белка в клетках, совместно трансфецированных GFPRF1 и TANK1, в 4 раза ниже, чем в клетках, трансфецированных только GFPRF1. Как видно из диаграммы, приведенной на (рис. 19) все клетки, экспрессирующие TANK1 имеют уровень флуоресценции только в интервале от 0 до 20 условных единиц флуоресценции (абсолютные величины, полученные денситометрией флуоресценции, преобразованы в шкалу от 0 до 100). Это значительно ниже уровня флуоресценции, наблюдаемого в клетках V79, трансфецированных только GFPRF1. Различия в уровне флуоресценции GFP в клетках V79 хорошо видны на (рис. 20). Следовательно, белок GFPRF1 элиминируется из ВТП при совместной экспрессии с TANKl, что совпадает с литературными данными (Smith and de Lange, 2000). 4.9. Экспрессия танкиразы 1 приводит к возрастанию частоты спонтанных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка. Мы показали, что GFPRF1 элиминируется из ВТП клеток КХ V79 при совместной экспрессии с TANK1 (Крутилина и др., 2003). При анализе интерфазных ядер клеток V79, экспрессирующих GFPRF1 и TANK1 мы обнаружили негативную корреляцию между экспрессией TANK1 и GFPRF1 в фокусах локализации GFPRF1, что подтверждает, что TANK1 подавляет связывание TRF1 с ВТП (рис. 18, 19).
Чтобы проверить, как будет влиять на стабильность хромосом удаление эндогенного белка TRF1 с ВТП, мы провели серию экспериментов с клетками V79, временно трансфецированными TANKl (Krutilina et al., 2003). Мы обнаружили значительное увеличение частоты ХА в клетках V79, трансфецированных TANK1, независимо от того, были ли клетки облучены ИР или нет (табл. 2). В клетках V79, трансфецированных TANK1, значительно увеличилось число таких аберраций, как дицентрики и трирадиалы и их соотношение было таким же, как при обработке контрольных клеток V79 ИР. Среди аберраций в клетках, трансфецированных TANK1, были найдены разрывы хромосом, локализованные в ВТП (рис. 21 В), и слияния хромосомных концов (рис. 21 А). Для детекции ВТП мы использовали FISH с (TTAGGG)n зондом, как описано в материалах и методах. Известно, что ВТП являются «горячими» точками хромосомных нарушений, как спонтанных, так и индуцированных, однако возможный механизм частых хромосомных повреждений в участках, содержащих внутренние (TTAGGG)n последовательности, пока неясен (Bertoni et al., 1996; Slijepcevie et al., 1996). Было показано, что сайт-специфическое Метафазные пластинки были приготовлены через 2 дня после трансфекции клеток плазмидами pTetFLNLS и pUHR 15-1. Для детекции ВТП выполнен FISH с (TTAGGG)n зондом, конъюгированным с ДИГ, как описано в материалах и методах. Хромосомы окрашены бромистым этидием. Метафазы, содержащие хромосомные нарушения помечены ( ). A. Показана метафазная пластинка, содержащая слияния хромосомных концов. B. Показана метафазная пластинка, содержащая разрывы хромосом во внутрихромосомных сайтах. встраивание (TTAGGG)n последовательности размером 800 т.п.н. в интрон гена ЮС индуцирует 30-кратное повышение генных перестроек, и во все перестройки вовлечены указанные (TTAGGG)n последовательности. (Kilburn et al., 2001). Нестабильность (TTAGGG)n повторов является также очевидной из исследования, в котором было найдено, что человеческие и мышиные клетки Ataxia telangiectasia ATM {-1-) содержат (TTAGGG)n повторы в виде экстра-хромосомных образований (Hande et al., 2001). Можно предположить, что разрывы и вырезания (TTAGGG)n последовательностей возможны в отсутствии белка TRF1, фосфорилированного ATM. Клетки позвоночных животных имеют уникальные видоспецифические наборы хромосом, и каждая хромосома содержит одну линейную молекулу ДНК, ограниченную специфическими повторяющимися последовательностями, называющимися теломерами. Теломеры млекопитающих составлены из большого числа тандемных (TTAGGG)n повторов. Теломеры являются единственными «легально дозволенными» концами ДНК в клетке, потому что нарушение непрерывности этой молекулы, то есть появление в ней двунитевого разрыва, почти всегда приводит к образованию ацентрического хромосомного фрагмента, который теряется при митозе. Основным следствием нерепарированных ДР является клеточная гибель. В частности, гибель клеток после воздействия ионизирующей радиации преимущественно связана с нерепарированными ДР, а также с хромосомными перестройками, возникающими при их неправильной репарации. В клетках, однако, имеются эффективные системы распознавания и репарации внутренних ДР, а также системы поддержания стабильности теломерных концов ДНК. У позвоночных животных идентифицировано два основных механизма репарации ДР: путем прямого негомологического воссоединения концов ДНК и путем гомологической рекомбинации. Для репарации путем ГР необходима вторая неповрежденная копия двунитевой ДНК, содержащая участок с нуклеотидной последовательностью гомологичной к поврежденному участку. Главная опасность такой репарации ДР в клетках позвоночных состоит в том, что их геномы содержат большое число повторов, по которым возможны «неправильные» гомологические взаимодействия, приводящие к ХП за счет неравной гомологической рекомбинации (НГР). Если учесть наличие в клетках высших эукариот большого числа повторов, то довольно высока вероятность одномоментного образования нескольких разрывов по гомологичным повторам, например при воздействии ИР, и как следствие — возможность НГР между повторами, локализованными на разных хромосомах, что ведет к ХП.
Однако клетка, по-видимому, имеет специальные механизмы, которые позволяют ей избегать рекомбинации между повторами. Существует ряд гипотез о возможном механизме подавления рекомбинации между повторами, в частности за счет дивергенции нуклеотидных последовательностей, предложенной М. Радманом (Radman, 1991), или гипотезы о функции ПАРП-1, приводящей к подавлению НГР (Lindahl et al, 1995). Для подавления ГР между повторами может быть достаточно создания особой локальной структуры хроматина, обеспечивающей надежную изоляцию концов ДНК при образовании ДР. В свете всего изложенного особый интерес привлекают теломеры и их способность защищать длинные тандемные (TTAGGG)n повторы от НГР. Осуществляется это благодаря сборке на таких повторах сложных белковых комплексов, контролирующих теломеразу и препятствующих слиянию теломер за счет ГР (Blackburn Е.Н., 2001). Основными белками теломерных комплексов у млекопитающих являются белки TRF1 и TRF2 (Broccoli et al., 1997). Оба эти белка участвуют в образовании Т-петли: TRF1 способен индуцировать изгиб удвоенных (TTAGGG)n повторов в составе двунитевой ДНК (Bianchi et al., 1997), что облегчает складывание теломеры, а также способен индуцировать латеральное спаривание теломерных последовательностей in vitro (Griffith et al., 1998), что позволяет белку TRF2 способствовать инвазии однонитевого теломерного конца в двунитевой участок теломеры и спаривание его с гомологичными последовательностями, благодаря чему этот участок оказывается спрятанным внутрь теломерного комплекса (Griffith et al., 1999) и поэтому не может атаковывать гомологичные мишени на других хромосомах.
