Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 9
11.1. Растительные пектинметилэстеразы 9
II.1.1. Структура клеточной стенки растений 9
П. 1.2. Пектины как компоненты клеточной стенки 11
II. 1.3. Пектинметилэстеразы и их роль в формировании клеточной стенки.14
II. 1.4. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстераз .19
П. 1.5..Взаимодействие пектинметилэстеразы с транспортным белком вируса табачной мозаики 25
П.2. Умолкание генов в растениях 27
П.2.1. Открытие явления РНК- интерференции 27
И.2.2. Роль коротких двухнитевых РНК в процессе умолкания генов 29
П.2.3. Вирус-индуцируемое "умолкание" РНК 30
П.2.4."Умолкание" эндогенной мРНК, связанное с образованием микроРНК
(miPHK) 31
П.2.5. Метилирование в области промотеров и подавление транскрипции. 32
И.2.6. Дайсеры 34
11.2.7. Аргонавты и эффекторный комплекс умолкания генов 40
11.2.8. РНК-зависимая РНК-полимераза растений 42
И.2.9. Системное умолкание генов в растениях 44
11.2.10. Метилирование ДНК и участие РНК -полимеразы 48
11.2.11. Вирусные супрессоры умолкания генов 49
И.2.12. Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов 53
III. Материалы и методы 56
IV. Результаты экспериментов 84
IV. 1. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы табака 84
IV.2. Использование трансгенных по пектинметилэстеразе растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке 85
IV.3. Роль лидерной последовательности пектинметилэстеразы в процессе доставки белка в клеточную стенку 89
IV.4. Пектинметилэстераза подавляет межклеточный и системный транспорт вирусной инфекции 94
IV.5. Экспрессия чужеродных генов в растении сопровождается повышенной активностью пектинметилэстеразы 99
IV.6. Транскрипционная активность гена пектинметилэстеразы возрастает при стрессовых воздействиях, вызванных механическим повреждением листа или фотоиндукцией 103
IV.7. Эффект "синергизма" при совместной агроинфильтрации кДНК генов проПМЭ и р19 TBSV с различными вирусными векторами 106
IV.8. Специфичность действия р19 при возникновении эффекта "синергизма" 109
IV.9. Влияние проПМЭ на перемещение клеточных белков из ядра в цитоплазму 110
IV. 10. Динамика транскрипционной активности генов ПМЭ и А1у при механической инфильтрации листьев N benthamiana или агроинокуляции р19 113
V. Обсуждение результатов 115
VI. Выводы 119
VII. Список цитируемой литературы
- Пектины как компоненты клеточной стенки
- Роль коротких двухнитевых РНК в процессе умолкания генов
- Использование трансгенных по пектинметилэстеразе растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке
- Транскрипционная активность гена пектинметилэстеразы возрастает при стрессовых воздействиях, вызванных механическим повреждением листа или фотоиндукцией
Введение к работе
В последние годы широкую известность получило явление "умолкания" генов (УГ) или РНК-интерференции, которое представляет собой защитную реакцию клетки и включает в себя механизм нуклеотид-специфической регуляции транскриптома эукариот. РНК-интерференция (РНКи) - это общее название процессов регуляции или подавления экспрессии генов с помощью гомологичных коротких РНК размером 21-25 нт. Цель УГ - поддержание стабильности транскриптома.
У растений одним из факторов УГ является пектинметилэстераза
(ПМЭ), участвующая в процессах биогенеза клеточной стенки (КС), развитии
корневой системы, стебля, роста пыльцевой трубки и созревания плодов при
морфогенезе высших растений. Первичная клеточная стенка растений
содержит целлюлозу, гемицеллюлозу и пектин, состоящий из разветвленных
цепей полигалактуроновой кислоты. ПМЭ деметилирует
полигалактуроновую кислоту с образованием метанола. Геном растительной клетки кодирует несколько изоформ ПМЭ. Фермент синтезируется в виде предшественника, проПМЭ, включаещего ферментативную (зрелую) и лидерную части. Несколько лет назад стало очевидным, что ПМЭ участвует в клеточном контроле вирусной инфекции. Данный фермент взаимодействует с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) in vitro и играет роль в распространении вирусной инфекции по растению. Однако, участие ПМЭ в вирусной инфекции этим не ограничивается. Повышение активности ПМЭ в клеточной стенке сопровождается индукцией умолкания генов ВТМ. Интенсивное разрушение вирусной РНК приводит к увеличению количества специфических коротких siPHK длиной 21 нт. Более того, УГ, вызванное ПМЭ, распространяется и на мРНК трансгенов, что сопровождается подавлением транспорта белка DCL1 в ядро. В конечном итоге это приводит к быстрому накоплению в цитоплазме miPHK. Важная роль DCL1 в жизни растительной клетки подтверждена экспериментально. Этот Dicer принимает
участие не только в синтезе miPHK, но и в контроле уровня синтеза мРНК. pri-miPHK и длинные мРНК (вирусные или клеточные) содержат шпилечные " структуры, которые и служат субстратом для DCL1. Введение в клетку pri-miR171 «оттягивает на себя» DCL1 и резко увеличивает накопление вирусной РНК.
Поскольку ПМЭ располагается на границе клетки, ее можно рассматривать как один из факторов, контролирующих стабильность клеточного транскриптома, который генерирует сигнал "тревоги" о вторжении в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты и индуцирует процесс умолкания генов.
Пектины как компоненты клеточной стенки
Клеточная стенка является важнейшим компонентом растительной клетки. Она образует внешний "скелет" клетки, определяет её форму, обеспечивает адгезию соседних клеток (Iwai et al., 2002; Parre and Geitmann, 2005). Клеточная стенка играет важную роль в межклеточной сигнальной системе, определяет направление роста клетки и участвует в ее дифференцировке (Carpita and Gibeaut, 1993). Растения доллшы защищать себя не только от поедания животными и насекомыми, которых можно отпугнуть шипами, стрекательными клетками, алкалоидами или горьким вкусом, но и от атаки фитопатогенных бактерий, грибов и растительных вирусов. У животных хорошо развита иммунная и лимфатическая системы, включая макрофаги, лейкоциты или антитела, которые могут быть доставлены в пораженные патогенами участки, то у растений такие системы отсутствуют и каждая отдельная клетка должна автономно содержать основной набор защитных механизмов. Клеточная стенка растений является важнейшим элементом защиты против внешних воздействий.
Содержимое растительной клетки ограничено липидной мембраной, за которой следует первичная клеточная стенка, толщиной около 1 мкм. После того, как клетка практически перестает расти и переключается на выполнение опорной функции, начинает формироваться вторичная клеточная стенка, более толстая и жесткая (Varner and Lin, 1989). Дополнительную прочность клеточной стенке придают целлюлозные кристаллические фибриллы, уложенные в несколько параллельных слоев. Они соединяются между собой гемицеллюлозными цепочками, образуя целлюлозный каркас (Engelsen et al., 1996). Схематичное строение клеточной стенки представлено на рисунке 1. На этом рисунке отмечены целлюлозные микрофибриллы, связанные с гемицеллюлозой (ксилоглюканами). Пектины различных классов образуют гелеобразный матрикс, а структурные белки придают дополнительную жесткость целлюлозному каркасу (Marga et al, 2005). Щеточки на схеме показывают сложные разветвленные цепи пектиновых молекул, которые могут исполнять роль рецепторов. Точками обозначены ионы Са , которые связывают параллельные линейные участки пектиновых цепей, таким образом уплотняя гель.
Целлюлозные фибриллы могут скользить друг относительно друга при растяжении стенки, так как соединение между ними не жесткое. (Brummell and Harpster, 2001). Они располагаются в геле, образованном высокогидратированным олигосахаридным матриксом, состоящим в основном из пектина, который препятствует слипанию целлюлозных фибрилл (Thakur et al., 1997). Пектиновый гель также регулирует проницаемость клеточной стенки (Dourado et al, 2004; Nergard et al, 2005), a структурные белки необходимы для дополнительной жесткости целлюлозного каркаса (Roberts et al., 1985). Известно, что, несмотря на свою жесткость, клеточная стенка обладает достаточной пористостью. Размер пор составляет 4 нм, и через них могут проходить различные молекулы и белки с молекулярной массой до 60 кДа (Anisimov et al, 1998).
Первичная клеточная стенка состоит, относительно собственного сухого веса, из 25% целлюлозы, 25% гемицеллюлозы, 35% пектина (с вариациями +/- 10%) и содержит от 1 до 8% структурных белков (Keller and Lamb, 1989). Содержание воды в ней составляет 78-80% (Fry, 1994). Во вторичной клеточной стенке содержание целлюлозы несколько выше, чем в первичной.
Пектины - это гетерологичная группа полимеров, которые состоят из кислых Сахаров, таких как галактуроновая кислота и нейтральных Сахаров -рамнозы, галактозы и арабинозы. На рис. 2 изображена химическая формула пектина, который имеет линейные участки, состоящие из остатков полигалактуроновых кислот, связанных а-1— 4 связью, и разветвленные области, в которых к основной полигалактуроновой цепи присоединены боковые цепи, состоящие из различных Сахаров. Основными сахарами боковых цепей являются арабинаны и арабиногалактаны, которые имеют общее название рамнозил.
Роль коротких двухнитевых РНК в процессе умолкания генов
При попадании геномной вирусной РНК в клетку синтезируется вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (RNA-dependent RNA-polymerase, RdRp), которая формирует репликативную двуцепочечную РНК. Эта РНК служит субстратом для РНКазы III, которая нарезает РНК-дуплекс (отсюда название dicer, что означает нарезать кубиками) на фрагменты 19-24 пн. На следующем этапе одна из цепей siPHK (эффекторная цепь) входит в ИРКУГ или RNA-induced silencing complex (RISC), где происходит ее комплементарное спаривание с вирусной РНК-мишенью. Вторая цепь (ее называют «пассажирской цепью» и обозначают как siPHK ) удаляется из ИРКУГ (Molnar et al, 2005) и разрушается. Специфический белок Argonaute (Ago), основной, а, может быть, и единственный белковый компонент ИРКУГ, вносит разрыв в РНК-мишень (рис. 18) и, таким образом, начинает разрушение вирусной РНК. До недавнего времени считалось, что вирусная репликативная форма - РНК-дуплекс, образовавшийся при копировании однонитевого вирусного генома с помощью вирусной RdRp, является основным источником siPHK. Тем более удивителен тот факт, что только 20% siPHK образуются из РНК-дуплекса, а остальные 80% - из «шпилечных» участков геномной однонитевой РНК томбусвируса (Molnar et al, 2005). Недавно эти данные перепроверили и показали, что при инфекции томбусвируса 97,6% специфических siPHK происходит из геномной РНК, а при потивирусной инфекции только 50% siPHK соответствует вирусному геному (Но et al, 2006). Это свидетельствует о существовании многочисленных механизмов образования коротких РНК. Именно поэтому транскрипты ДНК-содержащих вирусов растений также могут служить мишенью для УГ.
Для этого механизма характерно подавление трансляции клеточных мРНК после комплементарного спаривания с miPHK (Krishnamurthy et al, 2003), которое может приводить к последующему разрушению мРНК-мишени. Предшественники miPHK формируются из клеточных нетранслируемых транскриптов длиной 120-150 нт. Подобно siPHK, miPHK являются короткими дцРНК длиной 21-24 пн, образующимися из предшественника prec-miPHK с помощью дайсера и его активности, как РНКазы III (рис.20). Впервые этот класс коротких РНК был описан в животных клетках Caenorhabditis elegans (Waring and Kenyon, 1990).
Первое исследование этого механизма было проведено на трансгенных растениях, транскрибирующих вироидную кДНК. Повышенный уровень транскрипции приводит к запуску механизма метилирования соответствующего гена. В последующем было показано, что метилирование трансгенной Т-ДНК и транскрипционного промотера осуществляется при участии специфических siPHK и модифицированного гистона (Schiebel et al., 1998; Zilberman et al, 2003). Полагают, что умолкание РНК на уровне хроматина - это защита клеточного генома от транспозонов.
Недавно был описан новый класс эндогенных siRNA у растений, получивших название транс-действующих коротких интерферирующих РНК (trans-acting siRNA, ta-siRNA) (Allen et al, 2005). Ta-siRNA образуются при участии микроРНК, функционально сходны с ними и также способны регулировать экспрессию генов. Образование транс-действующих коротких РНК происходит из первичного транскрипта, содержащего поли-(А) последовательность (рис.21). Например, у Arabidopsis thaliana расщепление транскрипта гена TIRl/F-box, индуцируется микроРНК miR173, при этом образуются два фрагмента, которые защищаются от деградации белком SGS3 и РНК-зависимой РНК-полимеразой RDR6 и достраиваются до двухцепочечных молекул. Далее такая молекула нарезается на короткие интерферирующие РНК размером 21нт при помощи белка DCL4 и, возможно, DCL1, и воздействует на ген-мишень.
У растений рода Arabidopsis обнаружены 5 локусов, кодирующих ta-siRNA. Их функция заключается в регуляции некоторых ауксин-подобных факторов, а так же ряда еще не идентифицированных генов. (Yoshikawa, et al, 2005).
Использование трансгенных по пектинметилэстеразе растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке
Ранее, в нашей лаборатории с помощью RT-PCR был клонирован 3 концевой фрагмент гена пектинметилэстеразы (ПМЭ), нуклеотидная последовательность которого соответствовала зрелой части белка (Dorokhov et al, 1999). Мы выделили и секвенировали 12 клонов из библиотеки кДНК цветов табака Nicotiana tabacum. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что все они принадлежат к мультигенному семейству растительной ПМЭ (Micheli, 2001; Marcovic and Janecek, 2004). Ген ПМЭ кодирует профермент, который состоит из двух частей: ферментативной части, в которой находится активный центр и сигнальной (пре-про) последовательности, который, согласно программе SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), заканчивается сайтом процессинга (разрезания). На N-конце проПМЭ находится гидрофобный участок размером 24 а/к (предположительно трансмембранный домен (ТМД)). Слева от ТМД находятся отрицательно заряженные аминокислоты. После ТМД располагаются положительно заряженные аминокислоты. Из компьютерного анализа (SOSUI) следует, что белок должен встраиваться в мембраны по так называемому второму типу, т.е. N-конец аминокислотной цепи находится снаружи, а С-конец внутри мембранных везикул. Секреторный путь и внутриклеточный транспорт растительных белков в клеточную стенку или в вакуоли проходит через эндоплазматический ретикулум (ЭПР) и аппарат Гольджи (Vitale and Denecke, 1999). Заякоривание белков в мембранах ЭПР зависит от наличия N-концевой лидерной (сигнальной) последовательности (Walter and Johnson, 1994). Данная последовательность играет важную роль в топогенезе белков за счет их ориентации в мембранах (Goder and Spiess, 2003; Hartmann et al, 1989). IV.2. Использование трансгенных по ПМЭ растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке
Для изучения внутриклеточного транспорта нами были созданы трансгенные растения N.tabacum var. Samsun NN содержащие ген проПМЭ (полноразмерный, непроцессированный) слитый с зеленым флуоресцирующим белком (ЗФБ) (на N и С конце) и зрелый (без лидерной последовательности) ПМЭ, слитый с ЗФБ (рис. ЗОА). С помощью флуоресцентного микроскопа в эпидермальных клетках трансгенных растений проПМЭ:ЗФБ и ЗФБ:проПМЭ было показано наличие свечения ЗФБ на периферии клетки (рис. ЗОБ). Напротив, в случае трансгенных Табаков, экспрессирующих зрелый ПМЭ, это свечение отсутствовало.
Рис. 30. Накопление и распределение полноразмерной и зрелой форм ПМЭ, слитых с ЗФБ в листьях трансгенных растений N.tabacum var. Samsun NN.
(А). Схемы бинарных векторов для получения трансгенных растений. (Б). Флуоресцентная микроскопия эпидермальных клеток трансгенных растений, экспрессирующих проПМЭ.ЗФБ, ПМЭ.ЗФБ и ЗФБ.проПМЭ. Снимки сделаны на лазерном конфокальном микроскопе с фильтрами (470/40 LP495 525/50), пропускающими флуоресценцию ЗФБ Длина линейки равна 20мкм. Эти данные подтверждаются и в экспериментах по бомбардменту листьев Nicotiana benthamiana микрочастицами золота с ДНК соответствующих конструкций. В случае использования плазмиды проПМЭ:ЗФБ флуоресценция наблюдалась на периферии клеток, при этом в ядре она не обнаруживалась (рис 31).
Лазерная конфокальная микроскопия эпидермальных клеток N.benthamiana после бомбардмента конструкциями, экспрессирующими проПМЭ.ЗФБ (А) и ПМЭ: ЗФБ (Б). Длина линейки 10 и 5 мкм соответственно. Для лучшего понимания внутриклеточного распределения ПМЭ мы провели Вестерн блот анализ нескольких клеточных фракций из трансгенных растений проПМЭ:ЗФБ, ЗФБ:проПМЭ и растений, содержащих Т-ДНК исходного вектора. Детекцию проводили с помощью антител к ЗФБ, зрелой части ПМЭ и к лидерной части ПМЭ (пре-проПМЭ) (рис. 32А). Результаты иммуноблота с использованием антител к ЗФБ показывают наличие белков 90кДа и бОкДа во фракциях PI (lOOOxg) и РЗО (30,000xg). Зона в 90кДа соответствует белку проПМЭ, слитому с ЗФБ. Зона белка размером бОкДа совпадает с молекулярной массой зрелого белка ПМЭ:ЗФБ (33+27кДа) без процессированной в предполагаемом сайте (RRLL-QSS) пре-про последовательности в 25кДа. Во фракции, обогащенной клеточными стенками (КС), для проПМЭ:ЗФБ основным является белок с молекулярной массой бОкДа, что соответствует зрелой форме ПМЭ:ЗФБ. С другой стороны, иммуноблот двух линий трансгенных растений ЗФБ:проПМЭ выявил также одну полосу в 43кДа, которая меньше, чем зона ЗФБ:пре проПМЭ с предполагаемой молекулярной массой (27+25кДа). Возможно, это связано с активацией внутреннего сайта разрезания в сигнальной части ПМЭ (рис. 32Б). Результаты Вестерн блот анализа с использованием антител к лидерной части ПМЭ, показали для обоих видов трансгенных растений (проПМЭ:ЗФБ и ЗФБгпроПМЭ) диффузные области, которые, по-видимому, соответствуют продуктам деградации лидерной части ПМЭ (рис. 32В). Использование антител к зрелой части ПМЭ позволило выявить двойную полосу размером 34кДа, соответствующую зрелой форме ПМЭ (рис. 32Г). Такие полосы, скорее всего, представляют собой изоформы одного и того же белка, как было показано в нашей работе (Dorokhov et ah, 1999).
Транскрипционная активность гена пектинметилэстеразы возрастает при стрессовых воздействиях, вызванных механическим повреждением листа или фотоиндукцией
Несколько лет назад стало очевидным, что ПМЭ участвует в клеточном контроле вирусной инфекции (Dorokhov et al., 1999; Chen, et al, 2000; Chen and Citovsky, 2003). Оказалось, что фермент взаимодействует с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) и играет роль в распространении вирусной инфекции по растению. Однако участие ПМЭ в вирусной инфекции этим не ограничивается. Повышение активности ПМЭ в клеточной стенке сопровождается индукцией умолкания РНК ВТМ (Dorokhov, et ah, 2006).
В наших экспериментах по изучению влияния ПМЭ на распространение вирусной инфекции по флоэме (дальний транспорт), было показано, что в растении, трансгенном по проПМЭ, вирусная инфекция распространяется с большой задержкой по времени в сравнении с исходными растениями. В растениях векторного контроля, содержащих только Т-ДНК вектора pBinl9, также наблюдалась некоторая задержка дальнего транспорта. Мы показали (рис. 38), что трансформация вектором pBinl9 также приводила к повышению активности ПМЭ, и это, возможно, объясняет заметную задержку дальнего транспорта ВТМ.
На основании полученых данных мы заключили, что ПМЭ как фактор антивирусной устойчивости подавляет и дальний транспорт ВТМ.
Эти результаты и выводы входят в противоречие с данными и выводами, приведенными в работе Chen et al, (2000). В этой работе подавление активности фермента в табаке, трансгенном по кДНК ПМЭ в антисмысловой ориентации (асПМЭ), приводило к подавлению системного транспорта ВТМ (рис. 50).
На основании этих данных Chen и Citovsky сделали вывод о том, что ПМЭ необходим для транспорта ВТМ, что не согласуется с нашими данными. Среди возможных причин этого противоречия мы обратили внимание на то, что американские коллеги для получения трансгенных по асПМЭ растений использовали бинарный вектор, содержащий 5 -нетранслируемую область (69 нт) генома ВТМ, что, возможно, вызвало РНК-интерференцию, направленную против экзогенного ВТМ. По-видимому, в использованных трансгенных растениях была блокирована не только экспрессия ПМЭ, но и репродукция вируса. Несмотря на упомянутые разногласия относительно роли ПМЭ в дальнем транспорте, наши результаты согласуются с представлением о ПМЭ как факторе умолкания генов.
В настоящее время многие придерживаются гипотезы о том, что функция УГ заключается в поддержании стабильности клеточного транскриптома. В последние годы стал ясен истинный маштаб и значение данного явления. Только небольшая часть транскриптома используется клеткой для синтеза белков, а его основная часть — это некодирующие и нетранслируемые РІЖ (нтРНК) (Lander et al., 2001). Огромная масса нтРНК, в основном с неизвестной функцией, получила название «темная материя» (Yamada et al., 2003). Значительная часть нтРНК существует и разрушается в ядре и не поступает в цитоплазму (Bickel and Morris, 2006). Считается, что это последнее обстоятельство очень важно, поскольку нтРНК не использует систему ядерного транспорта. С другой стороны, клетка не может обеспечить как длительный синтез мРНК, так и безостановочное накопление белков, поскольку это приведет к истощению, прежде всего, систем контроля качества белка. По-видимому, блокирование УГ, как механизма поддержания целостности транскриптома, может привести, в конечном итоге, к клеточной смерти.
Растение было первым объектом, на котором явление УГ было открыто, да и сам термин «сайленсинг» или УГ был сформулирован генетиками растений и фитовирусологами.
Растения должны защищать себя от атаки фитопатогенных бактерий, грибов и растительных вирусов. Если у животных хорошо развита иммунная система в виде макрофагов, лейкоцитов или антител, которые могут быть доставлены в пораженные патогенами участки, то у растений каждая отдельная клетка должна автономно содержать весь набор защитных механизмов. Возможно, гуморальный и клеточный иммунитет с использованием соответствующих рецепторов, а также механизм УГ являются основными способами поддержания единства клеточного транскриптома млекопитающих. Считается, что именно из-за отсутствия иммунной системы механизмы УГ у растений столь многообразны, а количество белковых факторов и разновидностей коротких РНК столь велико. Растения - неподвижные организмы, поэтому клеточная стенка является важнейшим элементом защиты против внешних воздействий.
