Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
1.1. Способы введения чужеродной ДНК в соматические клетки 19
1.2. Системы "ген-селективная среда, используемые для выделения генетически трансформированных клеток 27
1.3. Особенности процесса генетической трансформации соматических клеток 38
1.4. Гомологичная и незаконная рекомбинация чужеродных молекул ДНК в соматических клетках совместный перенос генов и встраивание в геном 49
1.5. Стабильность и причины утраты трансформантного фенотипа соматических клеток 71
1.6. Экспрессия котрансформированных генов в соматических клетках 85
1.7. Стабильность экспрессии трансформированных генов в соматических клетках 116
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 123
2.1. Культивирование клеток 123
2.2. Трансформация клеток китайского хомячка ТК геном ВПГІ 123
2.3. Анализ стабильности Ж -фенотипа клеток трансформантных клонов 125
2.4. Выделение и анализ субклонов трансформантных клонов 126
2.5. Обработка клеток Мит, ТА и определение устойчивости клеток к ІДит и W 127
2.6. Происхождение плазмид, использованных в работе 128
2.7. Выделение плазмидных ДЖ из клеток 131
2.8. Выделение ДЖ из соматических клеток 133
2.9. Выделение метафазных хромосом и получение ДНК из фракций лизата метафазных клеток 135
2.10.Обработка ДНК рестракционными эндонуклеазами, электрофорез и выделение фрагментов ДНК 136
2.Н.Мечение ДНК с помощью переноса разрывов ДНК полимеразой I из клеток Е. coli или Micro со с- cus luteus и гибридизация ДНК 138
2.12.Трансформация клеток Е.coli SK1592 гес+ низкомолекулярной ДНК из клеток транс формантного клона 2Т30І 141
2.13.Определение активности и изоэлектрическое фокусирование в полиакриламидном гелетимидин киназы 142
2.14 .Статистическая обработка результатов , 144
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВОТДЕНИЕ 146
3.1. Выделение и характеристика клона А238
ТК "-клеток китайского хомячка 146
3.2. Особенности процесса трансформации клеток клона
А238 плазмидными ДНК, содержащими ТК ген ВІГП 148
3.3. Активность ТК в клетках транеформантных клонов 161
3.4. Метод различения соматических клеток, экспрессирующих собственную или
вирусную ТК 166
3.5. Анализ состояния плазмидных последовательностей во фракциях высоко- и низкомолекулярной ДНК клеток трансформантных клонов, и "спасение" экстрахромосомных молекул плазмидных ДНК 170
3.6. Локализация ТК гена ВЇЇГІ в клетках трансформантных клонов 189
3.7. Стабильность ТК -фенотша клеток трансформантных клонов 197
3.8. Наследуемость нестабильности по ТК+-фенотипу и стабилизация ТК+-фенотипа клеток трансформантных клонов 232
3.9. Связь потери Т -фенотипа с изменениями в ДНК 255
3.10.Модель генетической трансформации
соматических клеток 264
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 269
ВЫВОДЫ 272
ЛИТЕРАТУРА 274
ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение к работе
Одной из основных проблем общей генетики, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение, является вопрос о природе фенотипической изменчивости и ее взаимосвязи с генотипиче-ской изменчивостью. Существенную часть наследуемых изменений в популяциях соматических клеток в культуре составляют фенотипиче-ски нестабильные изменения . Дня ряда вариантов соматических клеток (в частности, для клеток, устойчивых к метотрексату) показано, что фенотипическая нестабильность (т.е. высокая частота реверсий и утрата признака при культивировании клеток на среде без селективных агентов) связана с генотипически нестабильными изменениями (см. обзор Глебов, Абрамян, 19846). Причины генотипической нестабильности, и механизмы, посредством которых реализуется нестабильность генетических изменений остаются, однако, неизвестными.
Анализ свойств многих других вариантов соматических клеток также указывает на то, что обнаруживаемая ими генетическая нестабильность является, скорее всего, следствием генотипической нестабильности (Глебов, Абрамян, 1984а; 19846). Одной из основных
Безотносительно к механизмам нестабильности, мы называем наследуемую в ряду клеточных поколений нестабильность по какому-либо признаку генетической нестабильностью. Генетическая нестабильность по какому-либо признаку, обусловленная высокой частотой изменений в последовательности ДНК соответствующего локуса далее называется генотипической нестабильностью. Исходя из этих определений, наследуемую фенотипическую нестабильность следует называть генетической нестабильностью причин возникновения таких вариантов может быть встраивание внутри или. вблизи соответствующих локусов чужеродных для данной области генома фрагментов ДНК. Как известно, существенную часть генома эукариот составляют диспергированные средне-повторяющиеся последовательности ДНК, значительная часть которых, по современным представлениям, способна участвовать в процессах реорганизации генома, либо изменяя свою локализацию (т.е. выступая как МГЭ), либо индуцируя перестройки в прилежащих последовательностях ДНК (Spradling, Eubin, 1981; Ильин, 1982а). Как показали исследования организации МГЭ и особенностей процесса их перемещения, клетки эукариот обладают особыми системами, контролирующими процессы реорганизации генома (см. обзоры: Shapiro, 1982; Shapiro, Cordell, 1982). И хотя в случае млекопитающих о работе таких систем известно крайне мало, пример с генами иммуноглобулинов показывает, что реорганизация генома является результатом действия на специфические последовательности ДНК специфических ферментов (или других, узнающих последовательности ДНК, белков), синтез которых в определенных типах клеток и в определенное время детерминирует характер перестроек ДНК (Tonegawa, 1983). Очевидно, что в клетках млекопитающих, как и в клетках дрозофилы (Ильин, 19826), перемещение МГЭ, в том числе и последовательностей ДНК типа описанных МакКлинток (McCiintock, 1950) контролирующих элементов, непосредственно вовлеченных в процессы перестроек хромосом, находятся под контролем специальных генетических систем. В настоящее время можно утверждать, что основной причиной генетической нестабильности клеток эукариот являются не ошибки или нарушения в работе систем репликации, рекомбинации или репарации ДНК, а процессы реорганизации генома, опосредуемые специфическими белками, и зависящие от особенностей структуры и, возможно, суперструктуры тех или иных участков генома.
Генетически нестабильные мутации, если они являются результатом встраивания МГЭ или других подобных последовательностей ДНК, отражают процессы реорганизации генома эукариот, и могут быть полезным инструментом для их анализа. Таким образом, один из возможных подходов к выявлению последовательностей ДНК, участвующих в реорганизации генома эукариот, и изучению механизмов генотипической нестабильности заключается в исследовании природы генетически нестабильных изменений. Другой возможный и более общий, на наш взгляд, подход может основываться на использовании молекулярных зондов - фрагментов ДНК известной структуры, переносимых и встраиваемых в геном эукариот в процессе генетической трансформации соматических клеток. Таким путем можно, по-видимому, выявить участки хромосом, подверженных перестройкам в разной степени, и приступить к изучению особенностей структуры и организации таких участков генома. Этот подход представляется тем более перспективным, что одной из особенностей генетически трансформированных клеток: является нестабильность по признакам, детерминированным чужеродной ДНК, а это - по соображениям, указанным выше, может быть результатом генотипической нестабильности клеток;
Однако, несмотря на интенсивные исследования и важные результаты, полученные с помощью метода генетической трансформации соматических клеток, многие вопросы, касающиеся механизмов репликации, встраивания в геном и экспрессии чужеродной генетической информации, а также иных структурных и функциональных взаимодействий экзогенной ДНК с геномом клеток-реципиентов, остаются невыясненными. В частности, не решены вопросы не только о природе фенотипической нестабильности генетически трансформированных клеток, но даже и о том является ли она наследуемой, т.е. генетической нестабильностью, поскольку полученные в ряде работ данные противоречат друг другу. В этих условиях особое значение приобретает сравнение параметров генетической трансформации для линий клеток-реципиентов независимого происхождения, которое может помочь выявить как общие, присущие всем соматическим клеткам, так и частные, свойственные только данной линии клеток, закономерности. Поскольку нестабильность трансформантного фенотипа (т.е. признака, обусловленного экспрессией чужеродной генетической информации) является характерной особенностью генетически трансформированных соматических клеток, очевидно, что без выяснения причин такой нестабильности невозможно и понимание механизмов генетической трансформации клеток. Исследование причин и механизмов нестабильности трансформантного фенотипа клеток позволит, с другой стороны, оценить перспективы использования метода генетической трансформации для изучения процессов реорганизации генома эукариот и систем, контролирующих такие процессы.
Целью работы было выяснение особенностей процесса генетической трансформации клеток китайского хомячка и изучение природы нестабильности трансформантного фенотипа клеток. Для этого следовало:
I. Выделить клон дефектных по Ж клеток: китайского хомячка, трансформировать клетки плазмидными ДНК, содержащими Ж ген ВПГТ, и выделить клоны клеток с Ж "-фенотипом.
2. Доказать транс формантную природу выделенных клонов Ж -клеток, для чего изучить свойства экспрессируемой в них ТК.
3. Изучить зависимость частоты трансформации и эффективности трансформации ТК""-клеток китайского хомячка от количества плазмидной ДНК, содержащей Ш ген ВПГІ, и от количества эукари-отной ДНК-носителя. Установить, влияют ли на частоту и эффективность трансформации изменения в составе смеси трансформирующих ДНК и в структуре плазмидных ДНК.
4. Проанализировать состояние и изучить локализацию плазмидных последовательностей ДНК, содержащих ТК ген ВІГІ, в клетках трансформантных клонов.
5. Изучить стабильность НС -фенотипа клеток трансформантных клонов. Выяснить, влияют ли на этот признак изменения в структуре и составе смеси трансформирующих ДНК, и как сказывается на стабильности трансформантного фенотипа обработка клеток опухолевым промотором ЧШ,
6. В случае, если клетки трансформантных клонов будут нестабильны по Ш+-фенотипу, определить, является ли свойство нестабильности клеток по трансформантному фенотипу наследуемым в ряду клеточных поколений признаком, и изучить детерминацию признака "скорость потери -фенотипа".
7. Исследовать возможность и закономерности процесса стабилизации ТК -фенотипа клеток трансформантных клонов.
Похожие диссертации на Изучение фенотипической нестабильности генетически трансформированных клеток китайского хомячка
