Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе 13
1.1. Атеросклероз как иммунное воспаление 13
1.1.1.Клеточно-молекулярные механизмы начальной стадии атерогенеза с позиций иммунного воспаления 14
1.1.2. Медиаторы воспаления и адгезия лейкоцитов на эндотелии 16
1.1.3. Взаимоотношения макрофагов и лимфоцитов в атеросклеротических поражениях артерий 18
1.1.4. Цитокины и факторы роста, регулирующие кинетику клеток в сосудистой стенке 20
1.2. Апоптоз и его роль в атерогенезе 22
1.2.1. Физиология и патофизиология апоптоза 23
1.2.2. Морфология и идентификация апоптоза 26
1.2.3. Роль апоптоза в развитии сердечно-сосудистой патологии 28
1.2.4. Модифицированные липопротеиды как фактор, вызывающий апоптоз при атерогенезе 30
1.2.5. Иммунное воспаление как фактор, вызывающий апоптоз при атерогенезе 33
1.3. Пролиферация клеток стенки артерий при атерогенезе 39
1.3.1. Особенности пролиферации клеток стенки аорты кроликов при экспериментальном атеросклерозе 40
1.3.2. Пролиферация клеток интимы артерий при атеросклерозе у человека 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Общая характеристика использованного материала 44
2.2. Методы, использованные для исследования атеросклеротических поражений артерий 45
2.3. Анализ цитотоксического эффекта липопротеидов низкой плотности 48
Глава 3. Результаты собственных исследований 51
3.1. Морфологический анализ цитотоксического эффекта липопротеидов низкой плотности и иммунных комплексов, включающих последние, в опытах in vitro 51
3.2. Морфологический анализ апоптоза клеток при атерогенезе у человека 69
3.3. Особенности пролиферации клеток при атерогенезе 86
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 110
Выводы 127
Список литературы 128
- Апоптоз и его роль в атерогенезе
- Пролиферация клеток стенки артерий при атерогенезе
- Методы, использованные для исследования атеросклеротических поражений артерий
- Морфологический анализ апоптоза клеток при атерогенезе у человека
Введение к работе
Актуальность темы. В последнее десятилетие представления об атеросклерозе существенно трансформировались. Использование высоких технологий позволило проводить на клеточно-молекулярном уровне изучение процессов, происходящих в стенке артерий как органе-мишени, в котором реализуются проявления атеросклероза.
Среди огромного количества литературы по различным аспектам этиологии и патогенеза атеросклероза только в последнее время появились фундаментальные работы, в которых формирование атеросклеротических поражений артерий обсуждается с позиций развития иммунного воспаления [Hansson G. К., 1996; Libby Р., 2002; Xu Q., 2002; Климов А. Н. и др., 2003; Нагорнев В. А., Восканьянц А. Н., 2004]. В то же время именно с этих позиций, вероятно, можно построить единую концепцию патогенеза атеросклероза, оценивающую должным образом роль как модифицированных липопротеидов низкой плотности (мЛПНП) и облигатных паразитов (Chlamydia pneumoniae, Cytomegalovirus), так и клеток сосудистой стенки в становлении и развитии атеросклеротических поражений артерий.
Центральным положением в возможной роли иммунитета в атерогенезе является определение природы антигенов и характера клеточных взаимодействий. В настоящее время обсуждается несколько ключевых положений, объясняющих начало развития иммунного воспаления при атерогенезе. К ним относятся: 1) образование мЛПНП, приобретающих аутоиммунные свойства [ Klimov A. N., 1991; Denisenko A. D. et al., 1996, 1999]; 2) иммунный ответ на мЛПНП и формирование аутоиммунного комплекса in situ в стенке артерий [Klimov А. N. и др., 1985; Климов А. Н., Денисенко А. Д., 1988; Денисенко А. Д., 1991; Климов А. Н., Нагорнев В. А., 1999]; 3) иммунный ответ на облигатных паразитов (антигены вирусной и липидной природы), проникающих в стенку артерий [Mahony J. В., Coombes В. К., 2001; Нагорнев В. А. и др., 2002; Лобзин Ю. В., Рудакова А. В., 2003]; 4) иммунный ответ на антигены сосудистого происхождения, образующиеся в процессе разрушения атеросклеротических бляшек [Hansson G. К., 1996; Нагорнев В. А. и др., 2001]; 5) выделение факторов, сопровождающих развитие иммунного воспаления в стенке артерий и вызывающих повреждение эндотелия на фоне образования мЛПНП: комплементарный комплекс (С5Ь-9), иммунорегуляторный сигнал (CD40-CD40L),
7 пентраксины (С-реактивнй белок, сывороточный амилоид Р), белки теплового шока (HSP60/65) [Назаров П. Г. и др., 1994; Stemme S., Hansson G. К., 1994; Mach F. et al., 1998; Нагорнев В. А., Кетлинский С. A., 1999; Xu Q., 2002].
Некоторые из перечисленных антигенов, вероятно, выполняют протекторную функцию, тогда как другие могут играть ведущую роль в начальной фазе процесса, в первую очередь это мЛПНП. Присутствие в стенке артерий в зоне формирования атеросклеротических поражений большого числа активированных негранулярных лейкоцитов (макрофагов, Т-лимфоцитов), экспрессирующих белки гистосовместимости II класса, провоспалительные цитокины, хемоаттрактанты, стрессорные белки позволило рассматривать атеросклеротическую бляшку как стойкий очаг иммунного воспаления с саморегуляцией [Wick G., Xu Q., 1999; Hansson G. К., 2001; Климов A. H. и др., 2003].
Начальное звено аутоиммунных реакций, протекающих в организме и сосудистой стенке при атеросклерозе, прежде всего связано с образованием мЛПНП под влиянием различных факторов. Эта проблема довольно широко и подробно изучена в отделе биохимии НИИЭМ РАМН под руководством А. Н. Климова [Klimov A. N., 1985, 1991; Denisenko A. D. et al., 1985; Klimov А. N. et al., 1987; Денисенко А. Д., 1991]. В частности установлено, что концентрация аутоиммунных комплексов липопротеид-антитело в плазме больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в 10 раз выше, чем у здоровых лиц, а в стенке артерий намного выше, чем в крови [Климов А. Н. и др., 2003]. Иммунные комплексы мЛПНП-антитело связываются с макрофагами на 49% активнее и эфиров холестерина в них в 60 раз больше, чем в клетках, инкубированных со свободными ЛПНП, что приводит к быстрой трансформации макрофагов в пенистые клетки и их разрушению [Klimov A. N., 1985; Денисенко А. Д. и др., 1985].
Кроме того в настоящее время Chlamydia pneumoniae (ХЛП) также рассматривается как фактор риска развития атеросклероза на фоне образования мЛПНП и даже как одно из условий появления мЛПНП в стенке артерий. Установлено, что при титре антител к ХЛП в крови, равном 1:256 - 1:512, риск обострения ИБС и развития острого инфаркта миокарда весьма высок [Лобзин Ю. В., Рудакова А. В., 2003]. Полученные в лаборатории атеросклероза им. Н. Н. Аничкова НИИЭМ РАМН в последние годы данные позволили рассматривать ХЛП как один из ведущих этиологических факторов развития атеросклероза. Хламидии в зоне атеросклеротических поражений артерий были обнаружены в 70% исследованных случаев [Нагорнев В. А. и др., 2004].
Таким образом, появление в стенке артерий мЛПНП и облигатных паразитов рассматривается как начальное звено аутоиммунных реакций, характеризующих развитие иммунного воспаления in situ.
Как мЛПНП, так и облигатные паразиты активируют клетки гематогенного происхождения (моноциты/макрофаги, лимфоциты), мигрирующие в интиму артерий, и клетки местного происхождения (эндотелиоциты, звездчатые и гладкомышечные клетки), запуская каскад реакций, поддерживающих очаг воспаления в стенке артерий.
Другим важным фактором, позволившим рассматривать атерогенез, как проявление иммунного воспаления явились данные, показывающие, что, наряду с моноцитами/макрофагами, в сосудистую стенку мигрируют в большом количестве Т-лимфоциты. Анализ атеросклеротических поражений аорты людей молодого и пожилого возраста показал, что в зоне начальных поражений независимо от возраста Т-лимфоциты преобладают над макрофагами [Xu Q., et al., 1990], а в атеросклеротических бляшках составляют около 20% от общей клеточной популяции. Из Т-лимфоцитарной популяции 70% представлено CD4+ клетками, большинство из которых экспрессируют МНС HLA-DR антиген, рецептор интерлейкина-2 (IL-2R) и интегрины [Hansson G. К., 1996]. Миграция Т-клеток в атеросклеротические поражения различной степени выраженности, их пролиферация in situ и экспрессия цитокинов рассматриваются как иммунный ответ на мЛПНП.
Присутствие Т-клеток и моноцитпроисходящих макрофагов в атеросклеротических бляшках делает возможным презентацию антигенов и иммунную активацию клеток сосудистой стенки, а в присутствии В-клеток, также и образование иммунных комплексов непосредственно в очагах атерогенеза [Климов А. Н., Нагорнев В. А., 1996].
Из провоспалительных цитокинов в стенке артерий в наибольшем количестве определяются IL-ip и фактор некроза опухоли-ос (TNF-a) [Libby et al., 1988;Clinton S. et al., 1992; Tipping P. G., Hancock W., 1993]. Причем экспрессия макрофагами TNF-a наблюдается уже на стадии адгезии и миграции клеток в субэндотелиальный слой интимы; выделена даже популяция макрофагов, экспрессирующих TNF-a и не участвующих в скевенджер захвате мЛПНП [Nagornev V. A., Malseva S. V., 1996].
Сходство клеточной популяции атеросклеротических поражений с клеточным составом тканей, в которых развивается иммунное воспаление, дает основание предположить, что атерогенез является хронической воспалительной реакцией,
9 подобной реакции гиперчувствительности замедленного типа с саморегуляцией [HanssonG. К., 1993].
При изучении различных аспектов иммунного воспаления при атерогенезе. остаются открытыми вопросы: 1. о цитотоксическом эффекте мЛПНП, т. е. захват макрофагами липопротеидов сопровождается только образованием пенистых клеток или мЛПНП могут вызывать апоптоз и/или некроз клеток сосудистой стенки; 2. о происхождении макрофагов, включающихся в реакции иммунного воспаления, т.е. возможности их пролиферации в стенке артерий. Поэтому комплексное изучение апоптоза и пролиферации клеток стенки артерий может существенно расширить представления о механизмах, поддерживающих иммунное воспаление при атерогенезе.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение цитотоксического эффекта мЛПНП и иммунных комплексов мЛПНП-антитело в опытах in vitro, а также исследование особенностей гибели клеток и их пролиферации в стенке артерий человека на фоне развития иммунного воспаления при атерогенезе.
Исходя из цели, определены задачи:
В опытах in vitro, используя нативные ЛПНП, различной степени модификации ЛПНП и иммунные комплексы, включающие последние в качестве антигена, провести количественный анализ гибели клеток по типу апоптоза и некроза.
В динамике формирования атеросклеротических поражений артерий у человека осуществить анализ апоптоза клеток.
При атерогенезе у человека провести количественный и качественный анализ пролиферирующих клеток
Основные положения, выносимые на защиту.
Перекисно-модифицированные липопротеиды низкой плотности (мЛПНП), и иммунные комплексы, включающие последние, не только способствуют образованию пенистых клеток, но и вызывают массивный апоптоз макрофагов в опытах in vitro. Антитело (IgG) иммунного комплекса также оказывает цитотоксический эффект на макрофаги.
Минимально модифицированные ЛПНП (ммЛПНП) и иммунные комплексы, включающие последние, вызывают как апоптоз, так и некроз клеток в зависимости от степени модификации. Чем менее выражена модификация ЛПНП, тем меньше выражен цитотоксический эффект липопротеидов для макрофагов.
При атерогенезе у человека наблюдается апоптоз эндотелиоцитов, мононуклеарных клеток и ГМК на всех стадиях формирования атеросклеротических поражений, причем апоптозу подвергаются клетки, не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли. С апоптотическими тельцами контактируют преимущественно макрофаги не трансформирующиеся в пенистые клетки. В то же время наблюдали разрушение макрофагов, фагоцитирующих апоптозные тельца.
Наиболее высокий уровень пролиферации происходит в макроскопически неизмененных участках атеросклеротически пораженных артерий. В липидных пятнах и липидных атеросклеротических бляшках происходит увеличение мононуклеарных клеток (макрофагов и лимфоцитов) по сравнению с «относительной нормой» более чем в 2 раза и превышает количество гладкомышечных клеток в 3 раза. В фиброзных атеросклеротических бляшках процентное соотношение между мононуклеарными и гладкомышечными клетками примерно одинаковое
В липидных пятнах пролиферативная активность мононуклеарных клеток выше, чем гладкомышечных клеток. В липидных и фиброзных атеросклеротических бляшках индекс пролиферации клеток остается высоким, и в зависимости от строения бляшки преобладает пролиферация либо мононуклеарных, либо гладкомышечных клеток; вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток.
Научная новизна. Комплексное цитохимическое и ультраструктурное исследование особенностей взаимодействия атерогенных липопротеидов с макрофагами и кинетики клеток стенки артерий при атерогенезе у человека позволило получить ряд новых данных, направленных на выяснение роли иммунного воспаления в патогенезе атеросклероза.
В настоящей работе впервые: - показано, что сильно модифицированные ЛПНП и иммунные комплексы, включающие последние, при их инкубации с макрофагами вызывают апоптоз клеток; чем меньше выражена модификация ЛПНП, тем в меньшем объеме проявляется их цитотоксический эффект на макрофаги;
- установлено, что при атерогенезе наблюдается апоптоз эндотелиоцитов,
мононуклеарных клеток и ГМК на всех стадиях процесса: наибольшее количество
апоптозных телец отмечено в краевых отделах липидных бляшек и вокруг атеромы;
- показано, что апоптозу подвергаются преимущественно клетки не содержащие в
цитоплазме липидные вакуоли;
- осуществлен количественный иммуногистохимический анализ популяции
пролиферирующих клеток, составляющих основу атеросклеротических поражений
артерий;
- установлено, что наиболее высокий уровень пролиферации (45% всех
присутствующих клеток) наблюдается в макроскопически неизмененных сегментах
артерий («относительная норма»);
- в липидных пятнах число мононуклеарных клеток в 2,5 раза выше, чем в
макроскопически неизмененных сегментах артерий и составляет в среднем 73%» от
всех присутствующих клеток - 57% клеток дают положительную PCNA-реакцию.;
установлено, что вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток - при отсутствии положительной PCNA-реакции в ГМК;
- показано, что в липидных и фиброзных атеросклеротических бляшках
пролиферация ГМК возрастает по сравнению с липидными пятнами;
- установлено, что в фиброзных бляшках процент мононуклеарных клеток по
отношению к общему количеству клеток снижается, по сравнению с последними в
липидных пятнах, но индекс их пролиферации остается на том же уровне.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа имеет теоретическое значение для расшифровки механизмов развития иммунного воспаления при атерогенезе. Полученные данные показали, что модифицированные липопротеиды низкой плотности и иммунные комплексы, включающие их, откладываясь в стенке артерий, не только вызывают образование пенистых клеток, но и оказывают цитотоксический эффект, сопровождающийся апоптозом и некрозом клеток. В работе впервые показана интенсивная пролиферация мононуклеарных клеток на всех стадиях атерогенеза, что указывает на источник образования пула клеток, включающихся в иммуновоспалительные реакции и не трансформирующихся в пенистые клетки.
Результаты данной работы могут быть использованы при изучении патогенеза атеросклероза и учитываться при разработке новых подходов к лечению этого заболевания, направленных на регуляцию кинетики клеток стенки артерий.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ в центральных журналах, рекомендованных ВАК. Материалы диссертации доложены на заседании Президиума РАМН (Москва, 2000), на Международной конференции «Актуальные проблемы ангионеврологии. Мультифокальный атеросклероз, церебральная ишемия, инсульт» (Петрозаводск, 2002), на Международной конференции молодых ученых «Вчени Майбутнього» (Одесса, 2002), на Пленарном заседании Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ой (75 ) сессии Общего собрания РАМН (Москва, 2003), на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2003). Работа поддержана грантами РФФИ 00-04- 48487, 03-04-49484
Апоптоз и его роль в атерогенезе
J. Е. Kerr et al. в 1972 году ввели термин «апоптоз» для морфологически выделяемой особой формы клеточной смерти. Эта концепция клеточной гибели вызвала возрастающий интерес у цитологов и патологов. Апоптоз часто описывают как «программируемую клеточную смерть» поскольку этот процесс контролируется механизмами, присущими клеткам. В терминологии тканевой кинетики апоптоз занял важное место [Haunstetter A., Izumo S., 1998]. Он проявляется в двух стадиях: начальной-инициирующей и финальной-поздней стадии, характеризующейся фрагментацией ДНК, нарушением ядерной морфологии (конденсация хроматина и ядерная фрагментация), нарушением локализации органелл и клеточной фрагментацией без экстрацеллюлярного выхода цитозольных макромолекул [Earnshaw W. С, 1995]. Интенсивно протекающая апоптотическая клеточная смерть может быть причиной органной недостаточности или органной атрофии. С другой стороны, может отражать развитие аутоиммунного воспаления, вирусную персистенцию и другие патологические состояния, включая атеросклероз и ишемическую болезнь сердца.
Апоптоз может быть отдифференцирован от других форм клеточной смерти, которая встречается в ответ на токсины, физические стимулы, ишемию, трансформацию макрофагов в пенистые клетки и т. д. Эта форма клеточной смерти была обозначена как «случайная клеточная смерть» ("accidental cell death") [Majno G., Joris I., 1995]., хотя данный термин широко не используется. В противоположность апоптозу « случайная клеточная смерть» не включает «суицидные» механизмы и не является энергозависимой (митохондриальной). Эта специфическая форма «случайной клеточной смерти» описывается как «некроз» или «онкоз» ("oncosis") Первичный некроз характеризуется клеточным набуханием, повреждением органелл, разрывом плазматической мембраны и финальным клеточным лизисом с выходом цитозоля в экстрацеллюлярное пространство. Апоптоз связан с активацией каспаз (caspases), расщеплением каспаз-связанных белков и фрагментацией внутриядерных белков. Хотя некоторые особенности апоптоза уже были описаны [Nagata S., 1997; Nicholson D. W.; Thornberry N. A., 1997; Reed J. C, 1997] постоянно происходит прогресс в этой области знаний и в научной литературе появляются новые данные описания механизмов апоптоза и прежде всего направленные на раскрытие и выяснение молекулярных механизмов регуляции клеточной гибели. Ключевым феноменом апоптотической клеточной смерти является определение класса аспартат-специфических протеаз. К настоящему времени выделено 10 протеаз, которые могут быть идентифицированы [Nicholson D. W., Thornberry N. А.,
Согласно новой классификации все аспартат-специфические протеазы объединены термином каспазы [Alnemri Е. S. et al., 1996]. Группа внутриклеточных протеаз, названных caspases (Cytosolic Aspartate - Specific cycteine Proteases), ответственна за превращение клеток в апоптотические тельца в процессе апоптоза [Alnemri Е. S. et al., 1996; Nicholson D. W., Thornberry N. A., 1997]. Каспазы представляют инактивированные проэнзимы, которые активируются в процессе протеолитического расщепления. Данные последних лет показали, что активация каспаз может быть связана или с гибелью рецепторного комплекса на цитоплазматической мембране, или происходит путем нарушения целостности митохондрий. В настоящее время, как отмечено выше, описаны 10 каспаз, из которых каспазы 8, 9, 3 занимают центральное место в апоптотическом пути. Активация каспазы 8 происходит в ответ на воздействие экстрацеллюлярных апоптоз-индуцирующих лигандов и является активатором комплекса процессов, связанных с внутриклеточной гибелью структур, ответственных за экспрессию многих клеточных рецепторов. Каспаза 9 активирует внутриклеточный распад в ответ на факторы или сигналы, которые являются триггерами выхода цитохрома с из митохондрий [Lui X. et al., 1996], и выступает в комплексе с апоптотическим протеаз-активирующим фактором (APAF-1) и экстрамитохондриальным цитохромом с [Li P. et al., 1997]. Каспаза 3 выступает в комплексе с каспазами 8 и 9, реализуя окончательную передачу сигнала к распаду клетки. Процесс апоптоза (программируемая клеточная смерть) регулируется сигналами генерируемыми в тот момент, когда цитокины связываются с их рецепторами. Один из хорошо изученных путей для инициации апоптоза включает экстрацеллюлярные белки смерти (TNF-a, FasL, TRAIL, Apo-3L) и их специфические рецепторы [Suda Т. et al., 1993; Zheng I et al., 1995; Pitti R. M. et al., 1996]. Сейчас известно 5 специфических рецепторов к белкам смерти (рецепторов смерти): это Fas(Apo-1CD95), TNFR1, DR3(TRAMP, Аро-3, Wsl-1), DR4(TRAL-R1), DR5(TRAL-R2) [Loetscher H. et al., 1990; Itoh N. et al, 1991; Pan G. et al., 1997]. Сигнальная передача через рецептор происходит в различных местах белков, которые не являются частью или фрагментом других сигнальных путей. После связывания их с собственными лигандами рецепторы смерти образуют свой специфический комплекс. Например, TNF-a (лиганд) образует комплекс с рецептором 1 (TNFR1), а рецептор смерти 3 (DR3) - это TNFR-ассоциированный домен белка TRADD, тогда как Fas и DR4 взаимодействуют с Fas-ассоциированным доменом белка FADD [Haunstetter А., IzumoS., 1998]. Индукция апоптоза через лиганды FasL и TNF-a в основном связана с активацией каспаз [Longthorne V. L., Williams G. Т., 1997]. Апоптоз развивается через расщепление витальных внутриклеточных белков. Недавно приведены сведения о важной роли митохондрий в индукции апоптотической клеточной смерти [Liu X. et al., 1996]. В норме супрессивный сигнал (Всіх, и ВсЬ) выступает как регулятор функционирования митохондриальных ионных и/или водных каналов. Ослабление супрессивного сигнала, когда антиапоптотические цитокины становятся недоступными клетке, приводит к нарушению функции каналов, обеспечивающих прохождение ионов через внутреннюю митохондриальную мембрану и недостатку сохранения объема митохондрий.
Ингибирование Bel-активности сопровождается изменением митохондриальной мембранной проницаемости, приводящей к выходу цитохрома с в цитозоль. В последнее время возросло количество данных, показывающих, что основной функцией ВсЬ является главным образом регуляция белковой транслокации из митохондриального внутримембранного пространства в цитозоль [Kluck R. М. et al., 1997]. Выход цитохрома с в цитоплазматическое пространство является определяющим для запуска механизма активации каспазы. В цитозоле цитохром с связывается с протеином APAF-1 (апоптотический протеаза-активирующий фактор), который также связывает каспазу 9 и dATP. Связавшийся цитохром с является триггером активации каспазы 9, которая затем запускает апоптоз путем активации других каспаз. Механизм для выхода цитохрома с из митохондрий заключается в следующем. Нарушение нормальной функции митохондриальных каналов является причиной набухания митохондрий, их разрыва и выхода цитохрома с. Внутренняя митохондриальная мембрана имеет большую поверхностную зону, чем наружная мембрана. Набухший матрикс растягивает внутреннюю мембрану, что является причиной разрыва наружной мембраны и высвобождения цитохрома с из внутримембранного пространства. Этот механизм описан многими авторами. Подавление активности каспаз не предохраняет наружную митохондриальную мембрану от разрыва, показывая, что разрушение мембраны не зависит от активности каспаз, а обусловлено нарушением функции митохондриальных каналов. В дополнение к реализации цитохрома с в литературе обсуждается альтернативный механизм, включающий реализацию других митохондриальных
Пролиферация клеток стенки артерий при атерогенезе
Как отмечено выше, апоптотическая клеточная смерть положительно коррелирует с их репликацией. Например, среди пролиферирующих ГМК было отмечено больше апоптотических клеток, чем среди не пролиферирующих [Bennett М. R. et al., 1998]. Несмотря на то, что вопросам пролиферации клеток сосудистой стенки при атерогенезе на протяжении многих лет уделялось большое внимание, в литературе имеются лишь отрывочные сведения о процессах репликации клеток при атеросклерозе у человека. Это объясняется тем, что до последнего времени отсутствовали объективные методы оценки степени пролиферации при атерогенезе у человека. Более детально этот процесс был изучен на примере аорты кроликов в динамике развития экспериментального атеросклероза или в опытах in vitro с использованием культуры макрофагов или ГМК. Возможность использования в экспериментальных условиях 3Н-тимидина позволила применять методы гисто- и электронно-микроскопической радиоавтографии с количественным анализом меченных клеток [Нагорнев В. А., Бабушкина Т. Г., 1987]. При морфологическом изучении атерогенеза у человека только в случаях использования «свежего» материала (материал срочных вскрытий и/или биоптаты артерий, полученные во время реконструктивных операций) при проведении электронно-микроскопических исследований можно было отметить присутствие пролиферирующих клеток. Однако это не позволяло провести в динамике количественную оценку числа и степени пролиферации тех или иных клеток стенки артерий. Лишь только после того, как была разработана технология получения моноклональных антител против пролиферирующих клеток, стало возможным изучение вопросов репликации клеток в очагах атерогенеза на «человеческом материале».
В настоящее время наиболее широко используются два метода иммуногистохимического изучения пролиферирующих клеток на секционном материале. Причем оба метода допускают возможность проведения исследования на парафинзаключенных тканях после формальдегидной фиксации. Первый метод -использование моноклональных антител против ядерного антигена пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen - PCNA). Некоторым недостатком данного метода является то, что максимум положительной реакции приходится на S-фазу клеточного цикла. Второй метод - использование моноклональных антител против ядерного антигена, экспрессируемого пролиферирующими клетками (Ki-67 Antigen). Эти антитела обнаруживают клетки, находящиеся на всех стадиях клеточного цикла (Gj, S, М и G2 фазах). Однако и этот метод имеет свои недостатки - это нестабильность положительной окраски препаратов. А. В. Упоров [1998], изучавший пролиферацию клеток рака молочной железы с использованием трех маркеров, отмечает, что специфичность использования антител против ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) для анализа клеточной пролиферации очевидна. Это объясняется длительным периодом полу-жизни белка PCNA, составляющим около 20 ч., что позволяет анализировать клетки даже уже вышедшие из Gi фазы.
Гисторадиоавтографическое исследование аорты кроликов с применением 3Н-тимидиновой метки ядер (вводили Н-тимидин пятикратно в течение суток) показало, что включение 3Н-тимидина в моноциты возможно даже на стадии фиксации клеток на эндотелиальной поверхности, при отсутствии липидных отложений в интиме, т . е. на самых ранних стадиях атерогенеза [Нагорнев В. А., Бабушкина Т. Г., 1987]. Однако далеко не все моноциты в процессе адгезии на эндотелии включают Н-тимидин в ядра - лишь в единичных клетках авторы наблюдали данный процесс. Через 2-3 недели экспериментальной гиперхолестеринемии более отчетливо выступал процесс включения в макрофаги 3Н-тимидина с формированием локусов пролиферации, включающих 3Н-тимидин. Причем на этом сроке эксперимента, включение 3Н-тимидина авторы отмечали не только в ядра макрофагов, но и в эндотелиальные клетки и ГМК, мигрирующие из средней оболочки в интиму. По мере образования атеросклеротических бляшек количество мононуклеарных клеток, включающих 3Н-тимидин, не уменьшалось, но их локализация приходилась на более глубокие слои сосудистой стенки. Поскольку гисторадиоавтография не позволяла дифференцировать мононуклеарные клетки, включающие 3Н-тимидин, Нагорнев В. А. и Бабушкина Т. Г. использовали метод электронно-микроскопической радиоавтографии (применяли фотоэмульсию Ilford L-4). Анализ электронограмм показал, что на ранних и прогрессирующих стадиях атерогенеза основной процент клеток, включающих 3Н-тимидин, относится к макрофагам, хотя можно наблюдать и пролиферирующие ГМК. Для обосновании положения, что при экспериментальном атеросклерозе в стенке аорты преимущественно пролиферируют макрофаги, не трансформирующиеся в пенистые клетки и включающиеся в реакции иммунного воспаления, авторы поставили опыты с «отставленной» меткой (кроликам после 4-х недельного содержания на атерогенном рационе семикратно в течение 36 ч. вводили 3Н тимидин, далее животных содержали на холестериновом рационе еще 4 недели, а затем проводили гисторадиоавтографическое исследование). Результаты работы показали, что 3Н-тимидин включают макрофаги, не трансформирующиеся в пенистые клетки. Макрофаги - высоко детерминированные клетки и, чтобы вызвать их деление, нужны какие-то особые условия или факторы.
Точная комбинация факторов, которые стимулируют моноциты/макрофаги к делению в атеросклеротических поражениях артерий, до сих пор не определена. Ряд данных показывает, что некоторые медиаторы воспаления и в первую очередь макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) может играть ведущую роль в этом процессе. M-CSF относится к факторам дифференцировки и пролиферации макрофагов, поддерживая их функциональную жизнеспособность в атероматозном ядре [Tedgui A., Bernard С, 1994]. Е. Filonzi et al. [1993] показали, что ГМК, стимулированные IL-1, TNF-a , IFN-y, увеличивают экспрессию M-CSF и GM-CSF в атеросклеротических бляшках и, таким образом, включаются в воспалительные реакции. Не только ГМК, но и эндотелиальные клетки продуцируют M-CSF [Clinton S. et аі., 1991]. Гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) также вносит вклад в пролиферацию мононуклеарных клеток [Clinton S., Libby P., 1992]. Возможно, что активация и дифференцировка макрофагов происходят уже при их контакте с активированным эндотелием при участии эндотелиального M-CSF. Подтверждением являются данные, полученные R. Gerrity et аі. [1995]. Авторы показали, что моноцитарная пролиферация стимулируется в процессе адгезии моноцитов на эндотелии как «эндотелий-клеточно-специфический контактзависящий механизм» и что в таких условиях макрофаги интимы пролиферируют в 4 раза быстрее, чем моноциты крови. Таким образом, полученные данные позволяют с определенной уверенностью говорить о возможности пролиферации моноцитов/макрофагов в очагах атерогенеза. Вероятно, именно с этим обстоятельством связано большое число макрофагов, присутствующих в очагах атерогенеза. По данным Q. Xu et al. [1990], в нормальной интиме аорты человека (возраст 16-30 лет) число макрофагов составляет 0,6±1,0 %, в транзиторной зоне (место перехода нормальной интимы в липидное пятно) -20,5±б,8%, в липидных пятнах - 39,4±5,1%; в нормальной интиме (после 60 лет) -4,2±3,6%, в транзиторной зоне - 18,8±3,25%, в липидном пятне - 28,8±5,2%, в бляшке - 21,7±3,8%. Однако остается неясным, почему одни моноциты, мигрирующие в интиму, включают Н-тимидин в ядра, тогда как другие клетки сразу же трансформируются в пенистые клетки и не участвуют в делении. V. Nagornev, S. Maltseva [1996] выделяют особый тип макрофагов моноцитарного происхождения, которые не участвуют в скевенджер захвате ЛПНП, а, пролиферируя в поверхностных отделах липидных пятен или бляшек, включаются в реакции иммунного воспаления.
Такой же точки зрения придерживаются В. А. Нагорнев и соавт. [2001]. Авторы считают, что к этой популяции макрофагов относятся клетки, которые в процессе миграции в интиму в первую очередь контактируют с Т-лимфоцитами. «Не исключено, что в макрофагах, пролиферирующих in situ в интиме и контактирующих с антигенами, Т-клетками или активированными макрофагами, в первую очередь происходит экспрессия генов, ответственных за синтез медиаторов воспаления, чем и объясняется "пассивное" отношение таких макрофагов к мЛПНП и липидам, локализованным в бляшках» [Нагорнев В. А. и др., 2001].Кроме того активированные макрофаги, как и ГМК, секретируют тромбоцитарный фактор роста (PDGF) с ауто- и паракринной регуляцией, который также вызывает пролиферацию клеток. На нарушения биологического равновесия и гомеостаза в сосудистой стенке ГМК отвечают фенотипической модуляцией и пролиферацией. I. Ikeda et al. [1994] выясняли роль ЛПНП рецептора в пролиферации ГМК. С этой целью сравнивали пролиферацию культуры сосудистых ГМК от кроликов линии Ватанабэ (WHHL), у которых имеется недостаток рецепторов к ЛПНП, и пролиферацию ГМК, выделенных из сосудистой стенки нормальных кроликов. В опытах in vitro в ответ на стимуляцию PDGF пролиферация ГМК, выделенных от кроликов WHHL, была значительно ниже по сравнению с пролиферацией клеток, выделенных от нормальных животных. Интерлейкин-1 оказывает двойной эффект на мезенхимные клетки. Во-первых, является митогеном для ГМК [Libby P. et al., 1988], а во-вторых, стимулирует экспрессию PDGF в ГМК [Raines Е. М. et al., 1989]. Гладкомышечные клетки в атеросклеротических бляшках и сами интенсивно экспрессируют IL-1. Интерлейкин
Методы, использованные для исследования атеросклеротических поражений артерий
Для изучения апоптоза использовали иммуноцитохимический метод apoTACS»XL In Situ Apoptosis Detection Kit фирмы "R&D Systems" (Англия); номер по каталогу: ТА200 (DAB Kit на ЗО проб). Апоптоз характеризуется рядом внутриклеточных изменений, таких как, кондесация хроматина, фрагментация ДНК и мембранная деструкция. Определение фрагментации ДНК - это широко распространенный метод анализа апоптоза: деструкция ДНК может быть выявлена методом гибридизации in situ с помощью включения метки с З ОН конца, используя дезоксинуклеотидилтрансферазу ( 3 ends с TdT) с последующим обнаружением меченых клеток (связывание BrdU определяется анти-BrdU антителами). Такой метод исследования часто называется "TUNEL". Этот кит высокочувствителен для обнаружения апоптотических клеток и широко используется в зарубежных лабораториях, занимающихся проблемой апоптоза. Он дает возможность выявлять апоптоз как в клеточных препаратах, так и в срезах формальдегид фиксированных тканей с заливкой в парафин, позволяя гистологически локализовать апоптотические клетки. ApoTACS сочетает в себе преимущества наборов TACS TdT плюс высоко чувствительную систему детекции, основанную на включении меченных нуклеотидов с З ОН конца. В состав набора входят все необходимые для данной цели реагенты. Учитывая, что состав набора рассчитан только на 30 проб, в работе были использованы 3 набора. Постановка метода 1. Обработка предметных стекол адгезивным раствором (NCL-BOND - Novocastra lab. «Англия») для лучшего прикрепления среза 2. Фиксация материала в 3,7% растворе формальдегида на фосфатном буфере (PBS) 3. Промывка депарафинизированных срезов в PBS 4. Обработка срезов протеиназой К (Proteinase К solution)
Для иммуногистохимического анализа пролиферирующих клеток в стенке артерии при атерогенезе использовали два метода: 1. Моноклональные мышиные антитела против ядерного антигена пролиферирующих клеток [Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)], Clone:PC 10 ("DAKO"), меченные пероксидазой хрена (HRP). Данные антитела реагируют с эпитопами ядерных антигенов в пролиферирующих клетках. Максимальная экспрессия PCNA происходит в клетках, находящихся в S-фазе. Использовали «кит», позволяющий применять фиксированные парафинизированные ткани. 2. Моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к Ki-67 антигену (Кі 67 Antigen), Clon:Ki-67. ( DAKO") серии M 7187, меченные пероксидазой хрена (HRP). Данный иммуногистохимический метод также позволяет использовать фиксированные и парафин-заключенные ткани. Ki-67 ядерный белок экспрессируется в пролиферирующих клетках, находящихся в Gj, S, G2 и М фазах клеточного цикла. Сопоставление двух вышеперечисленных методов показало, что применение PCNA-метода выявляет большее число меченных клеток, чем Кі-67-метод. Использование моноклональных антител Кі-67 не всегда дает стабильный положительный результат. Это подтверждается и работами других авторов. Например, А. В. Упоров (1998) при сравнительном изучении пролиферации клеток рака молочной железы с использованием трех маркеров пролиферации, отмечает что специфичность PCNA для объективной оценки клеточной пролиферации очевидна, что объясняется длинным периодом полу-жизни белка PCNA в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла.
Поэтому основной раздел работы с количественным анализом пролиферирующих клеток был выполнен с использованием моноклональных антител против PCNA. При постановке иммуногистохимической реакции была использована система визуализации EPOS ("DAKO"), «проявку» антигена осуществляли хромогеном 3,3 диаминобензидином (ДАБ), докраску ядер не пролиферирующих клеток осуществляли метиловым зеленым. В работе также был использован метод электронной микроскопии для изучения особенностей клеточной архитектоники атеросклеротических поражений различной степени выраженности. Основной задачей этого раздела работы было выявление клеток, находящихся в отдельных стадиях апоптоза с учетом особенностей клеточного повреждения. Для электронной микроскопии использовали только биоптатный материал. Извлеченные сегменты артерий промывали в среде 199 и помещали в 2% раствор глютаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) при комнатной температуре. Подготовку материала для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) осуществляли по методике, разработанной в лаборатории атеросклероза им. Н. Н. Аничкова (Нагорнев В. А. и др., 1982), которая с учетом специфики изучаемого материала (плотная ткань с эластическим и соединительнотканным каркасом) несколько отличается от стандартной методики. Кроме того проводили окраску срезов гематоксилин-эозином При морфометрическом исследовании в каждом случае подсчету подвергали 100 клеток при X 500 в микроскопе "Opton", не используя морфометрическую сетку, численность изучаемых клеточных форм выражали в процентах. Отдельно подсчитывали количество пролиферирующих клеток в интиме макроскопически неизмененных сегментов артерий, липидных пятнах, липидных бляшках (краевой и центральный отделы - отдельно), липидно-фиброзных бляшках. Значимость различий между изучаемыми выборками определяли с помощью t-критерия Стьюдента. С учетом того, что после иммуногистохимической окраски можно выявить два пула клеток: веретенообразновытянутые, среди которых преобладают ГМК, и округлой формы, среди которых присутствуют как макрофаги, так и лимфоциты, эти клетки были обозначены как мононуклеарные.
Для нас наибольший интерес представляли именно мононуклеары, поскольку данные клетки в первую очередь являются отражением клеточных реакций, характеризующих развитие иммунного воспаления. В опытах in vitro в культуре перитонеальных макрофагов изучали цитопатогенный эффект ЛПНП с разными условиями модификации. Было проведено 6 серий экспериментов . ЛПНП (d= 1.025-1.05 5 г/мл) выделяли из донорской крови с помощью последовательного ультрацентрифугирования. Перекисную модификацию ЛПНП проводили путем инкубации в течение 18 ч при 37 С в присутствии C11SO4 для получения мЛПНП в концентрации 10 мкМ и минимально модифицированных ЛПНП (ммЛПНП) в концентрации 1 мкМ. Аутоантитела к мЛПНП выделяли из сыворотки крови больных ИБС с помощью аффинной хроматографии на колонке с CNBr-сефарозой 4BCL, к которой были пришиты модифицированные МДА ЛПНП человека. Основным классом иммуноглобулинов в выделенных аутоантителах был IgG. Иммунные комплексы ЛПНП-антитело (молярное отношение 4:1) готовили добавлением к ммЛПНП аффинно выделенных аутоантител. Перитонеальные макрофаги получали от беспородных белых мышей-самцов по методике разработанной в отделе биохимии. Клетки культивировали в чашках Петри на покровных стеклах в среде Игла, содержащей 5 мг/мл белков сыворотки крови человека, лишенной липопротеидов, с добавлением 50 мкг/мл нЛПНП, мЛПНП и ммЛПНП, свободных, в комплексе с аутоантителами или с добавлением свободных аутоантител (15 мкг/мл). Цитотоксический эффект ЛПНП оценивали визуально, после обработки клеток белком Annexin-V в комбинации с Propidium iodide. Применяли "Apoptest-FITC Kit" ("Dako", Дания). Метод основан на способности связывания Annexin-V с фосфатидилсерином, который в клетках, гибнущих по типу апоптоза, локализуется на поверхности клеточной мембраны. Локализация фосфатидилсерина на поверхности мембраны клеток наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза и до
Морфологический анализ апоптоза клеток при атерогенезе у человека
Продолжая исследования по выяснению роли апоптоза в атерогенезе и опираясь на данные, полученные в опытах in vitro, было осуществлено ультраструктурное и иммуногистохимическое изучение возможности и особенностей апоптоза клеток стенки артерий с различными проявлениями атеросклероза у человека. При ультраструктурном анализе липидных пятен и атеросклеротических бляшек можно было выделить общие закономерности, связанные с трансформацией макрофагов и отчасти ГМК в пенистые клетки. Эта особенность атерогенеза известна давно и рассматривается как один из ключевых моментов формирования бляшек. В то же время нами было обращено внимание на то, что не все макрофаги в липидных пятнах и бляшках трансформируются в пенистые клетки, хотя и находятся среди последних, или в зоне атероматозного распада. В цитоплазме таких клеток , не содержащих липиды, или с локализацией отдельных липидных вакуолей, в первую очередь отмечали дистрофические изменения митохондрий (рис. 8 а, б). Эти изменения проявлялись в исчезновении крист и просветлении матрикса без гипертрофии неизмененных митохондрий (рис. 8 а).
Еще в большей степени данный процесс происходил в макрофагах, содержащих в цитоплазме лишь единичные липидные вакуоли. В таких клетках, наряду с исчезновением крист и просветлением матрикса, отмечали разрушение наружной мембраны митохондрий и распада последних (рис. 8 б). Параллельно в этих же клетках наблюдали конденсацию ядерного хроматина и частичное разрушение ядерной оболочки (рис. 9 а, б). В то время как в пенистых клетках, цитоплазма которых была полностью заполнена липидными вакуолями (рис. 10 а), структура ядра оставалась не измененной, вплоть до полного разрушения (распада) клеток (рис. 10 б). В различных отделах липидных пятен и атеросклеротических бляшек среди пенистых клеток и особенно в зоне атероматозных масс можно было наблюдать апоптоз клеток (с образованием апоптозных телец) как макрофагального, так и гладкомышечного происхождения (рис. 11 а, б).
Отсутствие в клетках, подверженных апоптозу, экстрацеллюлярных липидных масс, характерных для а - в клетке отсутствуют липиды. но отмечается конденсация ядерного хроматина, просветление матрикса и исчезновение крист в митохондриях (указано стрелками); б - в макрофаге, содержащем в цитоплазме отельные липидные вакуоли (ЛВ), наблюдаются глубокие дистрофические изменения митохондрий с частичным или полным разрушением последних (указано стрелками), а также конденсация ядерного хроматина распадающихся пенистых клеток (на рис. 11 а указаны звездочками), позволяет говорить о том, что апоптозу подвержены клетки, которые не трансформируются в пенистые клетки, т. е. макрофаги и ГМК с дистрофическими изменениями митохондрий и конденсацией ядерного хроматина. В липидных пятнах и бляшках (вокруг атероматозного ядра) можно было наблюдать контакт макрофагов и даже пенистых клеток с апоптотическими клетками (рис. 10 а, 13 б), но в основном все же с последними контактируют макрофаги не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли (рис. 12 а, б). На рис. 13 а представлен фрагмент глубокого отдела атеросклеротической бляшки с атероматозными массами: рядом с ГМК в состоянии апоптоза локализован макрофаг, не содержащий в цитоплазме липидных вакуолей. Тесный контакт пенистых клеток и клеток в апоптозе(рис. 13 б) не исключает возможности («попытки») макрофагами, содержащими липиды, также фагоцитировать и апоптотические клетки. Фагоцитоз макрофагами апоптотических телец, вероятно, не всегда приводит к очищению ткани и в отдельных случаях может сопровождаться разрушением клетки (рис. 14 а, б), вероятно, при захвате большого числа апоптотических тел. На рис. 14 б представлен один из вариантов такого процесса: контакт макрофага с разрушающейся клеткой, в цитоплазме которой находятся апоптотические тела. В отличие от клеток, разрушающихся по типу апоптоза, в пенистых клетках, как отмечено выше, не наблюдается конденсация ядерного хроматина и не столь отчетливо выражены дистрофические изменения митохондрий, несмотря на скопление в цитоплазме большого количества липидов (рис. 15 а, б).
Такие клетки подвергаются некрозу с разрушением плазматической (макрофаги) или базальной (ГМК) мембраны клетки с выходом в экстрацеллюлярное пространство липидов (рис. 16 а, б), составляющих основу формирующейся атеромы. На рис. 17 представлены пенистые клетки, цитоплазма которых заполнена липидными вакуолями, но в то же время в этих клетках отсутствуют признаки апоптоза. На том же рисунке видны фрагменты двух апоптотических клеток в которых отсутствуют липидные вакуоли, наблюдается уплотнение цитоплазмы и образование апоптозных телец. Таким образом, апоптозу преимущественно подвергаются клетки, в цитоплазме которых отсутствуют липидные включения или последние представлены в незначительном количестве. На стр. 46 при подведении итогов экспериментальных исследований уже было высказано предположение, что апоптозу подвергаютсяпреимущественно клетки, не трансформирующиеся в пенистые, но в то же время в опытах in vitro с использованием сильно модифицированных ЛПНП было отмечена 100% гибель клеток по типу апоптоза (таблица 1, 2). Хотя в опытах с использованием ммЛПНП было выявлено только 10% - 42% апоптотических клеток. Это отличие данных электронной микроскопии атеросклеротических поражений артерий от результатов опытов in vitro указывает на то, что апоптоз клеток зависит от степени модификации ЛПНП, которая в атеросклеротических бляшках, отлична от того, что мы имеем в опытах in vitro. Также, и опыты in vitro подтверждают такое предположение, если анализировать таблицы 1, 2, 4, 5, 6, то видно, что разница в условиях модификации ЛПНП находит отражение в степени цитотоксического воздействия последних на клетки Данные электронной микроскопии по выявлению клеток, разрушающихся по типу апоптоза, нашли подтверждение и при иммуноцитохимическом исследовании атеросклеротических поражений артерий с использованием TUNEL-метода. Апоптотические клетки (TUNEL-позитивные) выявляли в различных отделах липидных пятен и атеросклеротических бляшек. В отличие от электронной микроскопии, использование иммуногистохимического метода, хотя и чувствительного, не позволяет определить природу апоптотической клетки (кроме эндотелия). Поэтому можно говорить только о присутствии TUNEL- позитивных клеток в тех или иных отделах атеросклеротически пораженной артерии. В липидных пятнах и бляшках прежде всего можно было наблюдать апоптоз отдельных эндотелиоцитов (рис. 18 а).
Однако TUNEL-позитивные эндотелиоциты выявляются редко. Вероятно, это связано с тем, что эндотелиоциты, как клетки барьерной ткани, при гибели слущиваются (смываются в ток крови). В большем количестве апоптотические клетки выявляются в поверхностных (рис. 18 б) и глубоких отделах атеросклеротических бляшек (рис. 19 а, б) и в меньшем количестве в липидных пятнах. В липидных пятнах отдельные апоптотические клетки локализованы в субэндотелиальном слое и в центральных отделах в окружении пенистых клеток. В краевых отделах липидных пятен на границе с неизмененной интимой апоптотические клетки практически не выявляли. В липидных атеросклеротических бляшках апоптотические клетки обнаруживали как вокруг атеромы, так и среди (в окружении) пенистых клеток. Клетки, содержащие в цитоплазме липидные вакуоли и трансформирующиеся в пенистые клетки, не давали TUNEL-позитивной окраски. Отдельные апоптотические клетки были также локализованы под атеромами на границе со средней оболочкой (рис. 20 а). Основная концентрация апоптотических клеток наблюдалась в краевых отделах бляшек, причем, TUNEL-позитивная реакция преимущественно отмечалась в ГМК (рис 20 б).
