Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы по теме диссертационной работы .
Глава 1.1. Типы стволовых клеток и источники их выделения.
1.1.1. Основные характеристики стволовых клеток. 12
Концепция существования стволовых клеток. 12
Способность к дифференцировке. 14
Трансдифференцировка. 17
1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки. 17
История открытия эмбриональных стволовых клеток. 17
Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток . 20
1.1.3. Фетальные стволовые клетки. 24
Источники феталъных стволовых клеток. 24
Фетальные пренатальные стволовые клетки. 26
Фетальные перинатальные стволовые клетки. 27
1.1.4. Региональные стволовые клетки. 34
Мезенхимальные стволовые клетки. 35
Нейроналъные стволовые клетки. 38
Гемопоэтические стволовые клетки. 40
Клетки-предшественники эндотелия. 43
Индуцированные плюрипотентные клетки. о
Глава 1.2. Области применения клеточной терапии.
1.2.1. Перспективы медицинского применения клеточных до материалов мезенхимального происхождения.
Лечение заболеваний опорно-двигательного аппарата. 49
Применение КМ мезенхимального происхождения в неврологии.
Применения КМ мезенхимального происхождения при восстановлении повреждений сердца и лечения сердечно- сосудистых заболеваний. Использование КМ мезенхимального происхождения для лечения заболеваний печени.
Иммуномодулирующие свойства клеточных материалов мезенхимального происхождения .
Применение клеточных материалов мезенхимального происхождения в эстетической медицине, а также для лечения заболеваний кожи.
1.2.2. Современное состояние законодательной базы в области производства, стандартизации и применения клеточных материалов.
Отсутствие понятия «клеточный материал» в базовых законах Российской Федерации, регулируюгцих производство клеточных материалов.
Создание законодательной базы в области производства, „ стандартизации и применения клеточных материалов.
Международные нормы правового регламентирования ,п
деятельности в области клеточных технологий.
Часть II. Материалы и методы исследований.
Глава III. Методы культивирования клеток.
II. 1.1. Получение первичных культур мезенхимальных клеток. 64
Выделение фибробластов из кожи человека. 64
Выделение кератиноцитов из кожи человека. 64
Выделение мезенхимальных клеток из костного мозга человека.
Выделение мезенхимальных клеток из плаценты человека. 65
Выделение мезенхимальных клеток из пуповины человека .
II 1.2. Культивирование первичных клеточных культур , мезенхимального происхождения in vitro.
Пассирование мезенхимальных клеток. 66
Долговременная криоконсервация клеток. 66
Определение концентрации клеток в камере Горяева. 66
II. 1.3. Дифференцировка клеток мезенхимального происхождения in vitro.
Остеогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ,.„ клеток человека.
Хондрогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ,„ клеток человека.
Адипогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ,„ клеток человека.
Глава II.2. Биохимические и цитологические методы .
II.2.1. Биохимические методы. 69
Окраска исключающим витальным красителем трипановым синим.
Индикация дегидрогеназной активности с помощью калориметрического МТТ-теста.
Индикация фосфата кальция методом окрашивания . по Ван Коссу.
Индикация коллагена методом окрашивания толуидиновым синим.
Индикация липидов методом окраски масляным красным. 72
II.2.2. Цитогенетические методы. 72
Получение препаратов для цитогенетического анализа . 72
Анализ хромосомного состава клеток.
II.2.3. Иммуноцитохимические методы. 73
Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и „
внутриклеточных маркёров.
Иммуноцитохимическая детекция маркёров клеточной „.
дифференцировки.
Проточная цитофлуориметрия. 75 Часть III. Результаты и обсуждение.
Глава III.1 . Оптимизация технологии получения и культивирования клеточных материалов мезенхимального происхождения .
111.1.1. Оптимизация-технологии получения клеточных „,
материалов мезенхимального происхождения.
Особенности выделения фибробластов кожи человека. 16
Особенности выделения мезенхималъных стволовых клеток й» из костного мозга человека.
Особенности выделения мезенхималъных стволовых клеток ос из плаценты человека.
Особенности выделения мезенхималъных стволовых клеток из пуповины человека.
III. 1.2. Изучение особенностей морфологии клеток мезенхимального происхождения в процессе культивирования in vitro.
Морфологическая гетерогенность вследствие наличия исходной примеси клеток других тканей.
Морфологическая гетерогенность вследствие наличия фибробластоподобных клеток мезенхимального происхождения различной степени зрелости.
Глава ІII.2. Оптимизация методов контроля качества клеточных материалов мезенхимального происхождения .
2.1. Подтверждение мезенхимальной природы выделенных клеток.
Определение фенотипа выделенных клеток. 101
Подтверждение мулътипотентности выделенных клеток путём остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировки.
2.2. Применение МТТ-метода для определения изменений дегидрагеназнои активности в процессе пассирования клеточных культур.
Необходимость экспериментальной верификации зависимости уровня измеряемого сигнала от количества жизнеспособных клеток в МТТ-методе.
Экспериментальное изучение зависимости уровня измеряемого сигнала от количества жизнеспособных 123
клеток в МТТ-методе. Исследование МТТ-продуктивности клеточных культур в зависимости от пассажа.
III.2.3. Разработка методики кариотипирования при малом количестве митозов.
Обоснование кариотипирования при малом количестве митозов.
Оптимизация методики кариотипирования при малом количестве митозов для монослойной клеточной культуры без открепления её от подложки.
Анализ стабильности кариотипа в процессе пассирования клеточной культуры.
III.2.4. Паспортизация клеточных материалов мезенхимального происхождения.
Общая структура паспорта клеточного материала. 140
Исключение инфекционных агентов в клеточном материале.
Формы паспортов клеточных материалов мезенхимального происхожден ия.
Глава III.3. Оптимизация методов хранения и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения .
III.3.1. Криоконсервация клеточных материалов. 147
Подбор среды для криоконсервации клеточных материалов. 147
152 155 155
176
Оптимизации процесса подготовки и накопления клеточных материалов после криоконсервации.
III.3.2. Транспортировка клеточных материалов. 155
Подбор среды и температурного режима транспортировки клеточных материалов.
Подбор контейнера для транспортировки клеточных материалов.
Выводы. 180
Список научных публикаций по теме диссертации. 181
Список использованной литературы. 187
Список использованных сокращений
- Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток
- Иммуномодулирующие свойства клеточных материалов мезенхимального происхождения
- Выделение мезенхимальных клеток из пуповины человека
- Получение препаратов для цитогенетического анализа
Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток
В наибольшей степени удовлетворяет определению СК зигота, которая даёт начало всем клеточным типам организма и обладает абсолютной тотипотентностью (рис. 1, табл. 1).
Ещё один тип СК, имеющих практически неограниченные возможности к дифференцировке - это эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из внутренней клеточной массы бластоцисты. Плюрипотентные клетки дифференцируются в мультипотентные клетки трёх зародышевых лепестков (рис. 1): эктодермы (клетки эпителия, меланоциты, нервная ткань) мезодермы (клетки крови, дермы, соединительной, мышечной и костной ткани) и эндодермы (желудочно-кишечный тракт и органы внутренней секреции).
Клетки, обладающие плюрипотентными свойствами, могут дифференцироваться в ткани взрослого организма- всех трёх типов зародышевых; лепестков. Мультипотёнтные стволовые клетки дают начало : всем дифференцированным клеткаш ткани данного вида. В некоторых... ; случаях, клетки могут дифференцироваться» только по одному пути, в таких случаях говорится об- их унипотентности. Кроме того, в настоящее время много внимания уделяется индуцированным стволовым клеткам, клеткам; чья плюрипотентность инициирована искусственным путём (табл. 1, рис. 3).
Трансдифференцировка. В:; классической эмбриологии тотипотентная СК становится унипотентной; пройдя І ряд успешных генетически детерминированных превращений; Унипотентные ЄК дифференцируются в пределах своего зародышевого листка (рис. Г, табл. 1). До недавнего времени считалось, что ряд дифференцировок, через.который.проходит клетка, строго предопределён в рамках одного зародышевого листка; из которого она берёт своё начало.
Исследования последнего десятилетия показывают, что мультипотёнтные ЄК в определённых условиях способны дифференцироваться, в клетки и других зародышевых листков. Например, показано, что МСК костного мозга, производного мезенхимы способны дифференцироваться в нейрональные клетки или гепатоцитьг эктодермального происхождения [Snykers-07]. Такой процесс называется; трансдифференцировкой. Неограниченные возможности .трансдифференцировкиї помогли исследователям получить такие клетки, которые трудно получить, нормальным путём дифференцировки: из. их .; настоящих клеток-предшественниц [Snykers-07, Wong-06].
История открытия эмбриональных стволовых клеток. Изучение ЭСК началось с исследований мышиных тератокарцином — опухолей, которые возникают в гонадах некоторых инбредных линий мышей. Тератокарцинома состоит из бессистемно перемешанного массива различных соматических тканей. Классические работы по исследованию этих опухолей показали, что они происходят из терминальных клеток, мышей, и породили концепцию СК, которые дают начало всем» типам тканей, образующих тератокарциному [Kleinsmith-64]. Были получены химерные мыши, путём введения в мышиную бластоцисту клеток эмбриональной карциномы, что позволило получить экспериментальную модель развития организма млекопитающего [Martin-80]. Из тератокарцином были изолированы культуры клеток, что открыло возможность изучения свойств этих клеток in vitro. Однако модели in vitro на основе клеточных линий, полученных из эмбриональной карциономы, имели свои ограничения, т.к. клетки имели изменённый кариотип, а их способности к дифференцировке в различные ткани были ограничены. Позднее выяснилось, что тератокарцинома может образовываться после имплантации бластоцисты в эктопическую область, что позволило сделать вывод о том, что плюрипотентные клетки берут своё начало непосредственно из бластоцисты [Evans-81, Martin-81]. В результате были получены диплоидные линии клеток, которые могли образовывать все ткани взрослого организма, включая терминальные клетки. Тератокарциномы могут также образовываться из примордиальных терминальных клеток у некоторых линий мышей либо спонтанно, либо при имплантации в эктопическую область. Полученные терминальные клетки демонстрировали очень похожие свойства с ЭСК [Matsui-92]. Были также получены линии клеток из спонтанно возникающих, тератокарцином тестикул человека, которые были продифференцированы в различные типы тканей [Andrews-84]. Впоследствии, такие клеточные линии были продифференцированы в ткани всех трёх типов зародышевых лепестков [Рега-89]. Анализ свойств клеточных линий, полученных из человеческих тератокарцином, показал, что они имеют анеуплоидный кариотип, часто имеют ограничения по дифференцировке в соматические ткани взрослого
Иммуномодулирующие свойства клеточных материалов мезенхимального происхождения
Определение фенотипа выделенных клеток проводили с целью подтверждения мезенхимальной природы полученных клеточных культур с помощью иммуноцитохимических методов и проточной цитофлуориметрии.
Первичные клеточные культуры, полученные из всех источников (кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека), были отрицательными по экспрессии поверхностных белков-маркёров гемопоэтических стволовых клеток: CD 34 (рис. 45) и HLA-DR (рис. 46), которые не экспрессируются на поверхности МСК человека [Dominici-06].
Вместе с тем, был обнаружена экспрессия молекул клеточной адгезии: CD 44 (рис. 47), CD 54 (рис. 48), CD 90 (рис. 49), CD 105 и CD 106 (рис. 50), играющих важную роль в процессе миграции и хоуминга, что характерно для клеток мезенхимального ряда. Стойкая экспрессия этих маркеров МСК человека согласуется с данными других исследовательских групп [Goodwin-01, Gronthos-01, Simmons-91].
CD 44 был первым обнаруженным относительно специфическим маркером, экспрессирующимся на недифференцированных МСК человека [Miyake-90]. Его уровень падает по мере дифференцировки клеток. В комплекс белков CD 44 помимо молекулы адгезии, входит также белок pgpl, являющийся одним из белков-транспортеров, обеспечивающих мультилекарственную устойчивость клеток. Известно, что значительное количество таких молекул, позволяющих поддерживать внутриклеточный гомеостаз и высокий уровень пролиферации даже в неблагоприятных условиях, выявляется на стволовых и прогениторных клетках. справа: гистограмма распределения интенсивности флуоресцеции; изотипическии контроль обозначен чёрным, CD 54-ассоциированная флуоресценция - красным цветом. Проведённые нами исследования первичных культур ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины человека выявили незначительные различия в уровне экспрессии CD 44: ФБТ кожи экспрессировали CD 44 несколько больше, чем остальные типы клеток.
Значительные различия среди полученных культур выявлены по уровню экспрессии CD 54, в состав которого входит молекула межклеточной адгезии (1САМ), являющаяся лигандом для (32-интегринов. Известно, что уровень экспрессии CD 54 повышается у клеток, дифференцирующихся в костную и хрящевую ткани [Diaz-Romero-05, Tanaka-95]. Высокий уровень экспрессии CD 54 был выявлен нами в первичных культурах МСК из пуповины человека. Однако в культуре встречались крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на фоновом уровне. Средний уровень экспрессии CD 54 был выявлен в культуре МСК из костного мозга и плаценты. ФБТ кожи практически не экспрессировали этот маркёр. Можно предположить, что высокий уровень экспрессии CD 54 определяет способность клеток образовывать плотные структуры, что согласуется с результатами направленной дифференцировки в хрящевую и костную ткань первичных культур ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины (см. далее).
Первичные клеточные культуры, полученные из всех источников (кожи, костного мозга, плаценты и пуповины), обладали одинаково высоким уровнем экспрессии CD 90, или Thy-І, относящегося к семейству иммуноглобулиноподобных рецепторов - ещё одного антигена, широко используемым для фенотипирования клеток мезенхимального происхождения. Впервые белок был описан как возможный маркер остеобластоподобных клеток [Chen XD-99]. Позднее было установлено, что CD 90 экспрессируется в процессе пролиферации клеток, но экспрессия его падает при добавлении в среду индукторов остеогенеза и имеет обратную корреляцию с возрастанием уровня синтеза остеонектина и коллагена I типа [Wiesmann-06].
Экспрессия CD 105 (слева) и CD 106 (справа) МСК из костного мозга человека: красная флуоресценция - CD 105 (слева) и CD 106 (справа); синяя флуоресценция - ядра, окрашенные DAPI. Увеличение 630.
Все полученные культуры не различались по уровню экспрессии CD 105 (эндоглин), являющегося рецептором TGF-p, связывание с которым запускает каскад реакций, изменяющих морфологию и адгезивные свойства клеток. Уровень экспрессии CD 105 был средним во всех исследованных клеточных культурах мезенхимального происхождения.
Высокий уровень экспрессии CD 106, принимающего участие в процессах адгезии, хемотаксиса и передачи межклеточных сигналов, что необходимо для выполнения МСК их функций, наблюдался у всех полученных первичных культур мезенхимального происхождения.
Уровень экспрессии белков МНС I класса в культуре клеток — важный показатель, который необходимо учитывать при оценке пригодности клеток для трансплантации и эффективности терапевтического применения КМ. Самый высокий уровень экспрессии классических белков МНС I класса, HLA-ABC, наблюдали в культуре ФБТ кожи, средний - МСК из костного мозга, низкий - МСК из плаценты и пуповины (рис. 51). При этом, первичные культуры МСК из плаценты и пуповины были неоднородны: в них встречались мелкие клетки со средним уровнем экспрессии HLA-ABC, а также крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на фоновом уровне. Это подтверждалось и данными проточной цитофлуориметрии.
Основная масса клеток плаценты и пуповины приходилась на средний или низкий уровень экспрессии HLA-ABC. Полученные результаты обосновывают возможность применения МСК плаценты и пуповины для аллогенных трансплантаций в связи с предполагаемым низким уровнем иммунного ответа организма на введение этих клеток. Значительный уровень экспрессии белков МНС I класса ФБТ кожи и МСК из костного мозга ограничивает их применение для аллогенных, но оставляет возможность для аутологичных трансплантаций.
Все первичные культуры клеток из различных источников (кожи, костного мозга, плаценты и пуповины) были исследованы на экспрессию цитоплазматических белков виментина и нестина. Проведенный сравнительный анализ показал как сходство, так и существенные различия между ними. Клетки всех полученных культур экспрессировали виментин (рис. 52) - белок цитоплазматического скелета клеток, что является характерным для клеток мезенхимального ряда.
Что касается нестина, являющегося маркером незрелых и прогениторных клеток, то его не экспрессировали ФБТ кожи и МСК из костного мозга. Однако, значительная часть популяции МСК из плаценты и пуповины нестин экспрессировала (рис. 53).
Полученные данные суммированы в табл. 6. Таким образом, было показано, что фенотипы первичных клеточных культур мезенхимального происхождения, полученных из различных источников (кожи, костного мозга, плаценты и пуповины) следует учитывать при выборе КМ для медицинского использования. В частности, высокий уровень экспрессии HLA-ABC и высокий уровень экспрессии белков, характерных для дифференцированных клеток, делает ФБТ кожи непригодными для аллогенных трансплантаций. МСК из костного мозга также экспрессируют HLA-ABC на высоком уровне, что тоже делает их пригодными только для аутологичных трансплантаций, однако большое количество белков-маркёров, характерных для стволовых и прогениторных клеток, а также отсутствие белков, характерных для дифференцированных клеток, делает их терапевтически значимыми при подборе трансплантируемого клеточного материала. МСК из плаценты и пуповины экспрессировали маркёры МСК при низком уровне, экспрессии МНС I класса, что делает их пригодными для использования в качестве донорского КМ при трансплантациях.
Выделение мезенхимальных клеток из пуповины человека
Формы паспортов клеточных материалов мезенхимального происхождения - ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины — представлены на рис. 78-81.
Паспорта КМ содержат все четыре перечисленных выше информационных блока, заключение о возможности медицинского применения: Паспорт скрепляется подписью ответственного исполнителя и печатью организации.
На протяжении нескольких последних лет заинтересованные специалисты ставят проблему регламентации производственных стандартов в сфере медицинских клеточных технологий. Проведенная работа по стандартизации технологии производства КМ является предпосылкой для разработки нормативной базы, регламентирующей безопасное использование культур клеток в доклинических и клинических испытаниях.
Жизнеспособность различных пассажей культур мезенхимальных стволовых клеток после криоконсервации изучали в стандартной криоконсервационной среде: FBS («Gibco», США) с 10 % ДМСО («ПанЭко», РФ) [Белоус-87, Дузу-80].
ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека получали по стандартной методике и пассировали в 75 см" пластиковых флаконах («Greiner», США) (см. П. 1.1). После выделения (0 пассаж) и после каждого пассажа (с 1-го по VI-ой) по 1 млн. жизнеспособных клеток в 1 мл криоконсервационной среды помещали в 1.8 мл криопробирки («Greiner», США), замораживали в программном замораживателе MrFroster («Greiner», США) и хранили в сосудах Дьюара с жидким азотом (- 196 С) в течение 60 сут.. Затем образцы размораживали на водяной бане (37 С) и рассевали в 75 см" пластиковых флаконах («Greiner», США). Через 12 ч клетки снимали с пластика смесью трипсина и версена (см. 11.1.1) и проводили пятикратный подсчёт жизнеспособности клеток в камере Горяева с трипановым синим.
Выбор срока хранения образцов клеточных культур в условиях криоконсервации, 60 сут., связан с тем, что стандартная процедура мезотерапии повторяется с интервалом в 2 мес, т.е. именно через этот срок приходится размораживать клетки для приготовления КМ в практической деятельности. Поэтому проверка жизнеспособности клеток через 60 сут. криоконсервации имела не только теоретическое, но и очевидное практическое значение.
Непосредственно после выделения (0 пассаж) клетки обычно не закладывают на долговременное хранение, во-первых, вследствие их немногочисленности, во-вторых, — в силу недостаточной гомогенности клеточной культуры. Поздние пассажи, старше IV, также стараются не консервировать. Однако в данном разделе работы была поставлена цель установить основной тренд зависимости жизнеспособности от номера пассажа, поэтому и нулевой пассаж, и V-VI пассажи были включены в эксперимент по криоконсервации.
Зависимость жизнеспособности после размораживания от номера пассажа для всех исследованных клеточных культур имеет постепенно (с учётом статистических погрешностей — монотонно) убывающий характер. Для ФБТ кожи человека на первых шести пассажах снижение жизнеспособности наименьшее: примерно с 95 % до 89 %. Различия между пассажами достоверны для 0-1 и II—VI пассажей; кроме того, достоверно отличаются от остальных наиболее поздние (V—VI) пассажи (табл. 8).
Результаты определения жизнеспособности различных пассажей ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека после криоконсервации в течение 60 сут. в жидком азоте (-196 С).
Номер пассажа ФБТ кожи МСК из пуповины МСК из костного мозга номер повтора подсчета жизнеспособных клеток М±а номер повтора подсчёта жизнеспособных клеток М±а номер повтора подсчёта жизнеспособных клеток
Номер пассажа Рисунок 82. Зависимость жизнеспособности различных пассажей ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека после криоконсервации в течение 60 сут. в жидком азоте (- 196 С).
Достоверность различий (параметр р в t-тесте Стьюдента) жизнеспособности различных пассажей ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека после криоконсервации в течение 60 сут. в жидком азоте (- 196 С).
Падение жизнеспособности после:размораживания в зависимости от пассажа.. более выражено для MGK из пуповины человека: примерно с 94 % до. 79 %.. При этом; снижение жизнеспособности достоверно для; всех пар пассажей;за исключением: разницы между IV и V пассажами (табл; 8); Наконец, наибольшая зависимость жизнеспособности после размораживания от пассажа отмечена для МСК\из» костного мозга человека: примерно с 95 % до 29% (всемежпассажные различия достоверны-см. табл. 8):. Таким образом, номер пассажа, клеточной культуры необходимо. обязательно .учитывать при её; размораживании . при подготовке КМ. При этом, следует иметь в виду, что эксперимент, описанный в данном. разделе работы, описывает лишь общий. тренд: и нуждается в статистической? верификации, в рамках стандартных технологических цепочек, с использованием первичных клеточных культур, полученных из биопсийного материала более широкой выборки пациентов (см. далее):;
Оптимизации процесса подготовки и накопления клеточных; материалов после криоконсервации заключалась в накоплении статистических данных о жизнеспособности после размораживания клеточных культур мезенхимального происхождения на различных пассажах. Основанием для; сбора таких статистических данных были модельные эксперименты (см. предыдущий раздел работы), демонстрирующие постепенное снижение жизнеспособности с ростом номера; пассажа. Однако для практического учёта; такой; зависимости в процессе, технологической, деятельности по накоплению КМ; результаты; модельных экспериментов отражают общий тренд, но не позволяют воспользоваться числовыми значениями, для оценки которых необходимы более крупные выборки (а не один пациент) и стандартные технологические условия, имеющие место в процессе производства КМ.
Получение препаратов для цитогенетического анализа
Важнейшим выводом является отсутствие достоверных статистических различий в;, значениях жизнеспособности после размораживания для различных возрастов: На первый взгляд, это противоречит интуитивно? понятному тезису о том, что с возрастом І качественные показатели: кожи падают (и именно по этой причине пациенты прибегали к коррекционным процедурам). Однако следует иметь в виду, что понятие «качественные показатели кожи» комплексное, и характеризует состояние не столько ФБТ кожи, но состояние целых клеточных слоев: эпидермиса; формируемого в основном кератиноцитами а также клетками-Лангерганса, меланоцитами, лимфоцитами и клетками Маркеля [Lumpkin-05]; дермы, в которой.т ФБТ и являются одной из: основных клеточных фракций наряду с эндотелиоцитами; выстилающими кровеносные и лимфатические сосуды [Кузнецов-02]; гиподермы-, клеточный состав которой- представлен, главным образом, адипоцитами [Kershaw-04, Liu-05]. Кроме того, функциональные свойства ФБТ в контексте поддержания высоких «качественных показателей кожи» существенно определяются их способностью продуцировать ростовые факторы [Atfi-2010, Ghacon-2010;; Sahoo-2010, Wang-2010] и важные структурно-биохимические компоненты; кожи: коллаген, эластин, гликопротеины и протеингликаны [ЄтрайерТІ, Altman-2010j Sandberg-76, Woolfson-2010]. Все эти показатели с возрастом, разумеется, снижаются, но они никак не коррелируют со способностью ФБТ кожи выживать после криоконсервации.
Зная, что независимо от возраста пациента значение жизнеспособности ФБТ кожи после размораживания будет на II—III пассаже в диапазоне 88-90 %, можно подбирать оптимальное количество клеток как для криоконсервации, так и для извлечения из криоконсервации для наращивания КМ.
Получение КМ для медицинского применения возможно лишь в сертифицированных Центрах. Для их функционирования необходим квалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование. Создание таких Центров при каждом клиническом отделении невозможно. Поэтому неизбежно встаёт проблема транспортировки КМ, оказывающей наиболее неоднозначное воздействие на состояние клеток, так как при этом на них влияет множество факторов различной природы.
Подбор среды и температурного режима транспортировки клеточных материалов имеет принципиальное значение для стандартизации КМ.
Использование в качестве транспортировочной среды физиологического раствора (ФР), разрешённого для медицинского применения, представляется наиболее естественным решением. Поэтому на первом этапе мы поставили задачу изучить жизнеспособность клеточного материала с течением времени при различных температурных условиях именно в ФР.
ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека, были получены по стандартным методикам (см. ТТ. 1.1). После достижения клеточными культурами 80 %-ой конфлюэнтности, клетки снимали с подложки с помощью трипсина / версена, подсчитывали количество жизнеспособных клеток в камере Горяева с трипановым синим (см. II. 1.1), осаждали мягким центрифугированием и переводили в ФР (ОАО «Красфарма», Россия) до общей концентрации 100 тыс. кл / мл.
Каждую из полученных клеточных суспензий (ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга) в ФР разделялась на 3 равные порции (маркированные как «А», «В» и «С») по 12 мл в одинаковые изопропиленовые пробирки 15 мл («Greiner», США). Порция А помещалась в холодильник на + 4 С. Порция В оставалась при комнатной температуре (+ 22 С) в лаборатории. Порция С передавалась курьеру, который осуществлял их транспортировку в пластмассовом контейнере при обычных условиях г. Москвы (ноябрь месяц) с использованием общественного транспорта.
Через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 ч после разделения клеток на порции, каждую пробирку аккуратно встряхивали с целью достижения равномерности концентраций клеточных суспензий, отбирали по 500 мкл для 5-тикратного подсчёта жизнеспособности клеточного материала в камере Горяева с трипановым синим. Порция С, транспортируемая курьером по г. Москве, предварительно доставлялась к назначенному времени в лабораторию с целью осуществления необходимых манипуляций в стерильных условиях.
Сохранение стандартного (не. менее 80 %) уровня: жизнеспособности КМ в; процессе б-тичасовой транспортировки при? + 4 Є достаточное для доставки КМ на небольшие расстояния (например, в пределах г. Москвы и ближайшего Подмосковья); Однако; для; более: длительной транспортировки необходим: подбор другой транспортной среды, с большим/ жизнесохраняющим потенциалом.
Следующей;попыткой оптимизации транспортной среды для КМ было; изучение жизнесохраняющей способности ФР с 0:45 %-ой глюкозой (ОАО «Красфарма», Россия); а; также, ФР с 0;45 %-ой глюкозой: и 0:80 %-ым: раствором аминокислот Репасолт-Нео («ХемофармА.Д.»; Сербия), используемым для парентерального питания. Выбор- этих, химических составов) транспортной среды обусловлен» тем, что; с одной стороны, соответствующие препараты: разрешены? для? медицинского применения, а с другой стороны, глюкоза шаминокислоты: входят в состав:ростовых сред для культивирования клеток in vitro. При этом; конечное содержание глюкозы (0.45 %) соответствует, а содержание аминокислот - приближено к таковому в DMEMJ а именно (раствор vs DMEM): Е-аргинин 0Ю86 vs. 0.084 г/л; Е-валин 0.08:1 vs. 0.094т/л; Е-изолейцин 0:083vs..0.105 г/л; Е-лейцин 0.105 vs.O:105; г/л; Е-лизин 0.055vs, 0:146 г/л; Е-метиониш0Ю09 Ч . 0:030 т/л; L-серин; 0.018 vs. 0;042 г/л; Е-треонин 0:035 vs. 0.095 г/л;. Е-триптофан 0.006 vs. 0;016 г/л; Е-фенилаланин 0.007 vs. 0:066 г/л.
