Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. История изучения и таксономический обзор секции rhizirideum 11
1.1. История изучения таксономического состава секции Rhizirideum 11
1.2. Обзор близкородственных таксонов A. senescens s.l 23
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1. Материалы 28
2.2. Методы 29
2.2.1. Молекулярно-генетические методы систематики растений 30
2.2.2. Методика составления карт ареалов 36
2.2.3. Методы in vitro культуры 36
2.2.4. Методика популяционного анализа 38
Глава 3. Систематика секции rhizirideum. 42
3.1. Диагностические признаки видов секции Rhizirideum и их таксономическая значимость 42
3.2. Конспект секции Rhizirideum 50
3.3. Критический обзор видов секции Rhizirideum 61
3.4. Ключ для определения представителей секции Rhizirideum, произрастающих на территории России 67
Глава 4. Географический анализ и экологические особенности видов секции rhizirideum . 71
4.1. Экологические особенности видов секции Rhizirideum 71
4.2. Построение карт ареалов видов секции с помощью геоинформационных систем и их описание 76
4.3. Географический анализ секции Rhizirideum по флористическим областям 80
4.4. Географический анализ секции Rhizirideum по типам ареалов 84
Глава 5. Филогения секции rhizirideum 89
5.1. Молекулярно-филогенетический анализ секции Rhizirideum 89
5.2. Гипотезы о происхождении видов секции Rhizirideum 100
Глава 6. Сохранение генофонда секции rhizirideum 105
6.1. Использование и полезные свойства видов секции Rhizirideum 108
6.2. Сохранение ex situ 111
6.2.1. Сохранение в ботанических коллекциях 111
6.2.2. Сохранение в культуре in vitro 115
6.3. Сохранение in situ 121
6.3.1. Анализ внутрипопуляционной изменчивости Allium nutans L. на территории Русского Алтая 121
6.3.2. Анализ флористических списков заповедников 127
6.3.3. Редкие и исчезающие виды секции Rhizirideum 130
Выводы 135
Список литературы 137
Приложение
- Обзор близкородственных таксонов A. senescens s.l
- Молекулярно-генетические методы систематики растений
- Ключ для определения представителей секции Rhizirideum, произрастающих на территории России
- Построение карт ареалов видов секции с помощью геоинформационных систем и их описание
Обзор близкородственных таксонов A. senescens s.l
Объем секции Rhizirideum трактуется по-разному не только из-за перемещения видов в другие секции, но и из-за наличия в секции сложных полиплоидных комплексов (Фризен, 1987, 1988). Одним из таких полиплоидных комплексов является сложный в таксономическом отношении A. senescens s.I. Вид имеет широкий ареал — от Европы до Дальнего Востока. В разных частях ареала расы вида описывались под разными названиями. На запутанную синонимику вида также влияют разные ботанические школы, так как разные авторы понимают объем этого вида по-разному. Группа близкородственных таксонов A. senescens s.I. включает следующие виды и подвиды: A. austrosibiricum, A. burjaticum, А. lusitanicum Lam., A. senescens ssp. senescens, A. senescens ssp. glaucam, A. spirale, A. spurium G. Don f. (Введенский, 1935; Фризен, 1987, 1988). А.И. Введенский (1935) во «Флоре СССР» делил A. senescens s.I. на 4 расы: - европейскую, к которой, по его мнению, относятся названия А. montanum и A. fallax, с узкими 2-4 мм, прямыми листьями, с обоюдоострым (не крылатым) стеблем и обычно с продолговато-ланцетными, слегка оттянутыми внутренними листочками околоцветника; - алтайско-саянскую, более коренастую, с короткими, обычно равными половине стебля листьями и обычно с яйцевидными розово- фиолетовыми листочками околоцветника; - забайкальскую, типичную A. senescens, к которой, по его мнению, относится и название A. baicalense, более мощную, с широкими 5-10 мм шириной, серповидно-отогнутыми короткими листьями, часто с узкокрылыми вверху стеблями, обычно с продолговато-ланцетными листочками околоцветника; - дальневосточную, к которой, видимо, относятся таксоны A. spirale и A. glaucum, с длинными, приблизительно равными стеблю, свернутыми в пологую спираль листьями, со стеблем обычно вверху узкокрылатым и с яйцевидными листочками околоцветника.
Однако нерезкая морфологическая очерченность этих рас, наличие громоздкой и запутанной синонимики, отсутствие в большинстве случаев указаний о точном происхождении описываемого вида не дают возможности считать их самостоятельными единицами (Введенский, 1935). Н.В. Фризен (1987, 1988) на основе изучения морфологических, хорологических и кариологических признаков выделил 5 географических рас внутри сибирского A. senescens s.l., которые более-менее соответствуют расам А.И. Введенского: - алтайско-тувинская, которая почти равнозначна алтайско-саянской расе А.И. Введенского, коренастая, с несколькими луковицами на ползучем корневище, образующем дернину; листья короткие, обычно равные половине стебля, узкие, линейные, не превышают по ширине толщину стебля; листочки околоцветника яйцевидные; 2п=16; распространена на Юго-Восточном Алтае, в Туве и в Северо-Западной Монголии; обитает по каменистым степям; среднесибирско-монгольская, представляющая собой более крупные растения, с листьями, по ширине равными толщине стебля или немного шире его, более-менее сизыми по оттенку; с листочками околоцветника продолговато-ланцетными; распространена на Алтае (редко), в Красноярском крае, Восточной и Центральной Туве, в Монголии и Бурятии; обитает на сухих лугах, в степях, на степных каменистых склонах; 2п=32; - забайкальская раса, представляющая собой мощные растения с широкими, 6-10 мм шириной, серповидно отогнутыми листьями, с узкокрылатым в верхней части стеблем и яйцевидно-эллиптическими листочками околоцветника; 2п=32, 40, 48; распространена в Иркутской области (побережье оз. Байкал), Бурятии, Читинской и на западе Амурской обл., в Восточной Монголии и Маньчжурии; обитает на степных каменистых и щебнистых склонах; - даурская раса, объединяющая высокие, но очень тонкие растения, с горизонтальным корневищем до 4 мм толщиной и с 1-2 тонкими изогнутыми луковицами; со стеблем до 40 см высотой, круглым, в сечении ребристым; листья узкие, не достигают середины стебля; зонтик полушаровидный, с косо вверх направленными, нередко окрашенными цветоножками; околоцветник розово-фиолетовый, с продолговатыми внутренними и лодочковидными наружными листочками околоцветника; 2п=32; распространена в Читинской обл., юго-восточной части Бурятии, Восточной Монголии, Маньчжурии и в западной части Амурской обл.; обитает в степях, на остепненных лугах и среди кустарников; - бурятская раса, представляющая собой более мелкие растения, с узкими листьями, почти равными по длине стеблю, с ползучим корневищем, со скученными по нескольку (3-10) луковицами; околоцветник бледно-розовый, с более темной жилкой; листочки околоцветника широкояйцевидные, островатые; 2п = 32; распространена в Юго-Восточной Туве, в Бурятии и Монголии (бассейн Селенги); обитает на степных каменистых склона, в остепненных сосновых лесах, на песке.
Трем из вышеуказанных рас Н.В. Фризен присваивает видовой ранг: A.anstrosibiricum (алтайско-тувинская раса), A.burjaticum (бурятская раса), A.dauricum (даурская). Типичным A.senescens s.str. автор считает забайкальскую расу, распространенную в Иркутской области (побережье оз. Байкал), Бурятии, Читинской и на западе Амурской обл., в Восточной Монголии и Маньчжурии. Среднесибирско-монгольскую расу Н.В. Фризен выделил в подвид A. senescens subsp. glaucum, так как существуют переходные формы между ним и типовым подвидом, особенно в зоне их совместного произрастания. A. senescens ssp. glaucum отличается от типового подвида узкими сизыми (сизо-зелеными) листьями, луковицами удлиненными конически-цилиндрическими, широкояйцевидными листочками околоцветника (Фризен, 1987). В.А. Черемушкина (2004) вслед за И.А. Губановым (1996) признает A. glaucum Schrad. как вид и относит к этому виду растения из настоящих степей и их вариантов, остепненных суходольных и долинных лугов. Однако морфологические признаки, по которым она определяет этот вид, недостаточно четкие. В основу разделения растений широко распространенного A. senescens из Восточной Сибири на 2 группы она положила фитоценотическую приуроченность: первая произрастает в горных луговых степях Восточного Забайкалья и Иркутской области, вторая же - растения различных типов настоящих степей и остепненных лугов, лугов в долинах рек от Якутии до Алтая, менее крупные, с узкими цилиндрическими, часто окрашенными луковицами и придаточными корнями. Непонятно, какой вид она имеет в виду, так как в Якутии не произрастает ни A. senescens ssp. senescens, ни A. senescens ssp. glaucum Неполнота изложения информации не позволяет нам определить, каким материалом она оперировала. Поэтому мы не можем принять ее таксономические данные для нашего исследования. Они требуют дополнительной ревизии.
Молекулярно-генетические методы систематики растений
Работа проводилась в 2007/2008гг. в лаборатории Ботанического сада Оснабрюкского Университета под руководством профессора Н. Фризена (г.Оснабрюк, Германия). Выделение ДНК. ДІЖ была выделена с помощью NucleoSpin Plant kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany) в соответствии с инструкцией производителя (www.macherey-nagel.com). В основе работы набора лежит технология гель-силикатных фильтров (мембран), которые встроены в специальные пробирки-колонки. Около 100 мг свежего листового материала помещали в 1,5 мл пробирку, добавляли 450 мкл буфера С-1 и измельчали до однородной массы в течение не более 30 секунд. В случае измельчения гербарного материала брали около 20 мг сухих листьев, добавляли кварцевый песок и 600 мкл лизирующего буфера. Полученную смесь экстрагировали на водяной бане при температуре 60С в течение 30 мин., затем центрифугировали при 11000 g в течение 5 мин. Около 300 мкл надосадочной жидкости каждой пробы переносили в чистые пробирки. В каждую пробирку добавляли 300 мкл буфера С-4 и 200 мкл этанола. Смесь перемешивали, инвертируя пробирки вручную 2-4 раза. Каждый образец помещали в 2 мл NucleoSpin Plant колонку и центрифугировали в течение 1 мин. на скорости 11000 g. Затем добавляли в колонки 400 мкл буфера CW и центрифугировали в течение 1 мин. на скорости 11000 g, добавляли 700 мкл буфера С-5 и центрифугировали в течение 1 мин. на скорости 11000 g, снова добавляли 200 мкл буфера С-5 в эти же колонки и центрифугировали их в течение 2 мин. на скорости 11000 g. В новые 1,5 мл пробирки помещали другие NucleoSpin Plant колонки, в которые добавляли пробы и по 100 мкл промывочного буфера СЕ, предварительно нагретого на водяной бане до 70С, оставляли при комнатной температуре на 5 мин., затем центрифугировали в течение 1 мин. на скорости 11000 g для вымывания ДНК. Полученную ДНК хранили в холодильной камере.
Метод изучения последовательностей фрагментов ДНК состоит из ряда последовательных шагов: амплификация определенного фрагмента ДНК у включенных в анализ образцов; очистка амплификата от остатков праймеров, нуклеотидов и т.д.; секвенирование фрагментов ДНК (терминирующая реакция); электрофорез полученных в результате терминирующей реакции фрагментов и считывание последовательностей; выравнивание всех полученных последовательностей ДНК (alignment); филогенетический анализ (Фризен, 2007). ПНР проводили в 30 мкл реакционной смеси, включающей 5 нг ДНК, 3 мкл 10х буфера (Boehnnger, Mannheim, Germany), 0,8 мМ каждого из dNTPs, по 0.4 мкМ каждого праймера (прямого и обратного) и 1 единицу Taq-полимеразы (Boehnnger, Mannheim, Germany), на термоциклере РТС-100 Peltier (Biozyme Diagnostik GmbH).
Прямое секвенирование продуктов амплификации может быть заблокировано наличием в растворе большого количества неиспользованных в ходе ПЦР нуклеотидов и олигонуклеотидных праймеров, поэтому необходимо удалить эти ингредиенты. Продукты ПЦР очищались с помощью NucleoSpin Extract II kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany) в соответствие с инструкцией производителя (www.macherey-nagel.com). Секвенирование амплифицированных фрагментов (проведение терминирующих реакций). Для проведения терминирующих реакций использовали набор ABI BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Для секвенирования ITS фрагментов использовали те же праймеры, что и для амплификации. Реакционная смесь включала 2-6 мкл очищенных продуктов ПЦР, 1 мкл праймера, 2 мкл BigDye (смесь dNTPs с флуоресцентной меткой) и 1-5 мкл дистиллированной воды - до конечного объема 10 мкл. Объем ДНК и воды варьировал в зависимости от концентрации продуктов ПЦР. Терминирующие реакции проводили на термоциклере РТС-100 Peltier (Biozyme Diagnostik GmbH) с использованием программы секвенирования После окончания работы термоциклера продукты реакции очищали переосаждением в этаноле в присутствии 125 мМ ацетата натрия, затем промывали 70% этанолом. Нуклеотидные последовательности полученных образцов считывали на ABI 377 автоматическом гелевом ДНК секвенаторе (Applied Biosystems) на кафедре ботаники Оснабрюкского университета (Германия). Электрофорез в агарозных гелях. Электрофорез в агарозных гелях использовали для проведения RAPD-анализа и для контроля концентрации ДНК. Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 1% (при контроле концентрации ДНК) и 1,6% (при проведении RAPD-анализа) агарозном геле в 1х буфере ТВЕ (90 мМ Трис-борат и 2 мМ ЭДТА). Для нанесения проб на гель использовали 6х Orange Loading Dye буфер, содержащий глицерин и краситель. Пробы разгоняли в геле при напряжении 5 V/ см. После проведения электрофореза гели окрашивали раствором бромистого этидия (на 1 л брали 50 мкл матричного раствора концентрации 50 мг/мл). Визуализацию фрагментов проводили в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Biometra ТІ 2. Для определения размеров фрагментов использовали маркер молекулярного веса GeneRulerDNA Ladder Mix (100-10000 bp). Для просмотра и уточнения нуклеотидных последовательностей использовалась программа CromasLite. Выравнивание последовательностей осуществлялось с помощью программы Clustal 1.81 .msw, затем вручную. Филогенетический анализ. Выровненные последовательности анализировались в целом ряде программ. Филогенетический анализ проводили методом максимальной парсимонии (Maximum Parsimony) с использованием программы PAUP версия 4.0Ь 10 (Swoford, 2002). Данный метод анализирует каждый признак, чтобы найти среди множества филограмм одну, для которой необходимое число изменений признака в процессе предполагаемой «эволюции» будет минимальным. Стратегию поиска оптимальной топологии дерева (Heuristics search) проводили по методу простого деления-восстановления ветвей и со 100 случайно добавленными последовательностями, и TBR (tree bisection and recormection) процедурой. Статистическую поддержку ветвей в 50%
Ключ для определения представителей секции Rhizirideum, произрастающих на территории России
Околоцветник от беловатого до желтеющего 2. + Околоцветник от бледно-розового до пурпурного 5. 2 (1). Листья линейные, плоские, желобчатые, до 4 мм шириной. Околоцветник беловатый A. denudation. + Листья полуцилиндрические или нитевидные, желобчатые, до 3-х мм шириной. Околоцветник желтый 3. 3 (2). Цветоножки в 2 - 3 (4) раза длиннее околоцветника A. flavescens. + Цветоножки менее чем в 1,5-2 раза длиннее околоцветника или равны ему 4. 4 (3). Цветоножки в 1,5 раза длиннее околоцветника. Околоцветник желтый, без видимой жилки, длина листочков околоцветника 5-6 мм. Зонтик полушаровидный, рыхлый A. stellerianum. + Цветоножки меньше либо равны околоцветнику.
Околоцветник желтый, с малозаметной жилкой, иногда розовеющий, длина листочков околоцветника 3-4 мм. Зонтик полушаровидый, густой, почти головчатый A. tuvinicum. 5 (1). Листья узколинейные, плоские, 2-15 мм шириной 6. + Листья желобчатые, полуцилиндрические, нитевидные, до 2 мм шириной 15. 6 (5). Тычинки немного или на !Л короче околоцветника. Листочки околоцветника ланцетовидные, на верхушке заостренные, края верхушки завернуты внутрь A. angulosum. + Тычинки выдаются из околоцветника. Листочки околоцветника иной формы 7. 7 (6). Тычинки внутреннего круга с каждой стороны при основании с двумя (иногда 1) острыми зубчиками A. nutans. + Тычинки внутреннего круга при основании цельные 8. 8 (7). Тычинки внутреннего круга цельные, шиловидные, не шире наружных. Цветоножки короче либо равны околоцветнику. Зонтик головчатый A. tytthocephalum. + Тычинки внутреннего круга в 1,5-2 раза шире наружных. Цветоножки длиннее околоцветника. Зонтик иной формы 9. 9 (8). Стрелка с двумя крыльями, часто по ширине равными стрелке. Тычинки из дельтовидного основания шиловидные. Листочки околоцветника розовато-пурпурные, широко-яйцевидные, с тонкой малозаметной жилкой A. spirale. + Стрелка обоюдоострая, ребристая, часто с узкими крыльями. Тычинки из расширенного или из продолговатого основания шиловидные. Листочки околоцветника розовые или розовато-фиолетовые от эллиптических до широко-яйцевидных 10. 10 (9). Луковиц 1-2 яйцевидно-конические или яйцевидно- цилиндрические. Не образуют дерновинку 11. + Луковиц больше 2-х удлиненные конические или конически- цилиндрические. Образуют дернинку 13. 11 (10). Листья плоские линейные 5-10 (12) мм шириной, корневище до 1 см толщиной. Стрелка округлая в сечении, в верхней части сплюснутая, часто с двумя узкими крыльями. Зонтик почти всегда шаровидный, густой A. senescens subsp. senescens. + Листья до 4 мм шириной, корневище до 4 мм толщиной.
Стрелка тонкая, круглая в сечении, ребристая. Зонтик чаще полушаровидный, рыхлый.... 12. 12 (11). Листьев 6-8, не длиннее половины стрелки. Цветоножки косо вверх направленные, в 2-4 раза длиннее околоцветника. Листочки околоцветника треугольно-яйцевидные A. spurium. + Листьев 5-6, длиннее половины стрелки. Цветоножки равные, в 1,5-2 раза длиннее околоцветника. Листочки околоцветника яйцевидные A. lusitanicum. 13 (10). Луковицы конические. Оболочки луковиц пленчатые фиолетовые, более-менее цельные. Стрелка цилиндрическая, ребристая, с двумя заметными ребрами по бокам. Листья 2-3 мм шириной, почти равны по длине стрелке A. burjaticum. + Луковицы конически-цилиндрические. Оболочки пленчатые беловато- серые, неокрашенные. Стрелка цилиндрическая, иногда с чуть заметными ребрами. Листья до 6 мм шириной, равны или немного длиннее половины стрелки 14. 14 (13). Луковиц несколько мелких, изогнутых, образующих дернинку. Листья 1-2 мм шириной, не шире стрелки, не длиннее половины стрелки. Цветоножки в 1,5-2 раза длиннее околоцветника A. austrosibiricum. + Луковиц по 2-4, удлиненных. Листья 3-5 (6) мм шириной, сизые (сизо-зеленые), немного шире стрелки, длиннее половины стрелки. Цветоножки в 3-5 раз длиннее околоцветника.... . senescens ssp. glaucum.
Построение карт ареалов видов секции с помощью геоинформационных систем и их описание
Обобщение информации обо всех местах нахождения вида дает представление об области его распространения, или ареале. Ареал - это часть земной поверхности (или акватории), в пределах которой встречается данный таксон (независимо от ранга) (Толмачев, 1974). Правильное представление об ареале вида получается лишь при нанесении его на карту. Только картографическое отображение ареала делает его доступным для изучения и сравнения ареалов различных растений. В настоящее время накоплен большой фактический материал по географическому распространению растений, как в пределах отдельных регионов, так и всей планеты. В большинстве случаев эта информация обобщена в крупных изданиях - "Флорах", в которых географическое распределение видов представлено в виде перечня различных флористических, а чаще природно-административных районов, в пределах которых данный вид встречается. Более подробная информация о конкретных местах нахождения видов содержится в конспектах флор, в работах посвященных изучению локальных (конкретных) флор, геоботанических описаниях, экспедиционных отчетах, а также в монографических обработках конкретных таксонов. Очень часто публикации увязываются с картографической обработкой данных. Материальной основой для многих разработок по географии растений, помимо наблюдений в полевых условиях, служат гербарные коллекции.
Существует три основных метода графического изображения ареалов: точечный, сеточный и контурный методы (Толмачев, 1974). Для повышения информативности карт ареалов. целесообразно сочетание нескольких графических методов, например, точечного и контурного, а также использование различных штриховок и цветов.
Компьютерные технологии позволяют упростить техническую сторону построения и изображения ареалов, а также создание взаимосвязанных карт ареалов одного вида различными методами. Благодаря использованию геоинформационных систем (GIS) появилась возможность сравнивать разные по форме ареалы; разрабатывать объективные способы выделения типов ареалов. С помощью компьютерных методов можно совмещать большое количество ареалов таксонов различного ранга, что позволяет выявить центры родового, видового, внутривидового разнообразия.
С помощью ГИС-технологий нами были построены электронные карты ареалов практически всех видов секции (приложение 3). Для видов, известных нам лишь по литературным данным, указаны конкретные местонахождения. Несомненно, что построенные электронные карты облегчат анализ распространения видов изучаемой секции, как в пределах России, так и на Земном шаре в целом.
A. angulosum. Вид распространен на территории Европы, на Урале и в западной части Северной Азии (Западная, Средняя Сибирь, Казахстан). Границей распространения на восток является р. Енисей, на северо-запад -Франция и Италия. Самая восточная точка, указанная по опубликованным данным «Определителя растений Тувинской АССР» (1984), сомнительна, возможно, занос, и не включена наим в итоговый ареал. Для флоры Мурманской обл. и республики Карелия вид указывается как заносное растение (Раменская, 1982). На этой территории встречается редко и известен исключительно из вторичных местообитаний, кроме того, первые находки на территории Карелии были сделаны в военное время, связи с чем, вид отнесен к адвентивной фракции флоры Карелии (Кравченко, 2007). Вид указан для флоры Крыма, окрестностей Феодосии, где, вероятно, уже исчез из-за хозяйственного освоения территории. Ближайшее от Крыма местонахождение - по р. Днепр в Херсонской обл. (Серегин, 2004). Также считается заносным в республике Коми и на юге Псковской обл. (Серегин, 2005), и по нашему мнению, в Ленинградской обл. A. austrosibiricum. Вид имеет дизъюнктивный ареал. Основная часть ареала расположена на территории Алтая, Западного Саяна, Тувинского нагорья. Также вид произрастает в Казахстанском и Монгольском Алтае. A. azutavicum. Эндемичный вид, распространение которого ограничено Казахстанским Алтаем (горы Южного, Западного Алтая, Калбинского нагорья). A. burjaticum. Вид распространен в Прибайкалье, Забайкалье и на юге Монголии. A. chiwui. Эндемичный вид, произрастающий в Китае, в провинции Хэбэй. A. czelghauricum. Эндемичный вид, распространенный в СВ Турции. A. denudatum. Вид распространен на территории Кавказа, заходит в Крым и северо-восточную Турцию. Во флоре Украины и Крыма (Определитель высших растений Крыма, 1972; Мякушко, 1987) вид указан для окр. Судака, где встречается редко, поэтому это местонахождение не включено в ареал. A. flavescens. Вид произрастает в Средней (Румыния, Болгария), Восточной (Молдова, Украина) Европе и Сев. (Казахстан, 3. Сибирь) Азии. Границей распространения вида на запад являются Карпаты. На восточной границе ареала заходит на подгорные равнины и в горы Южной Сибири. Единичное, самое северное местонахождение данного вида в окр г. Ишим в Тобольском районе Тюменской обл., не включили в ареал.
