Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Объекты, районы и методы исследования. 7
1.1. Объекты исследования 7
1.2. Природные условия районов исследования . 12
1.3. Геоботанические описания местообитаний 23
1.4. Методы исследования... 31
ГЛАВА 2. Биологически активные соединения рода Allium L 33
2.1. Луки как лекарственные растения 33
2.2. Химический состав видов рода Allium L 36
ГЛАВА 3. Основные группы биологически активных веществ изучаемых видов лука 45
3.1. Витамины 45
3.2. Алкалоиды 46
3.3. Стероидные сапонины 46
3.4. Эфирные масла 47
3.5. Минеральные элементы 49
3.6. Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты . 49
ГЛАВА 4. Изучение флавоноидов A. ramosum, A. senescens и A. glaucum . 51
4.1. Выделение флавонол-гликозидов из надземной части Allium ramosum a A. senescens 51
4.1.1. Выделение флавонол-гликозидов из A. ramosum 51
4.1.2. Выделение флавоноидов из A. senescens 53
4.2. Изучение флавоноидного комплекса трех видов лука методом ВЭЖХ 57
ГЛАВА 5. Межпопуляционная изменчивость морфологических признаков видов рода alliums 63
ГЛАВА 6. Изменчивость флавоноидного признака у популяций из различных местообитаний 84
ГЛАВА 7. Взаимосвязь морфометрических показателей растений изучаемых видов лука с уровнем содержания флавоноидов
Выводы
Список литературы
Приложение
- Природные условия районов исследования
- Луки как лекарственные растения
- Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты
- Выделение флавоноидов из A. senescens
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время применение дикорастущих растений в качестве лекарственного сырья и пищевых добавок профилактического назначения становится всё более актуальным. Виды рода Allium L. по праву занимают одно из ведущих мест в ряду широко используемых съедобных растений. Наиболее распространенными видами лука в степных и лесостепных районах Забайкалья являются лук ветвистый — Allium ramosum L., лук стареющий — Allium senescens L. s. str. и лук сизый — Allium glaucum Schrader. Эти многолетние корневищные луки широко используются местным населением в пищу и в качестве лекарственных средств, с давних времен применяются в тибетской и монгольской народной медицине. Однако химический состав забайкальских видов лука остается практически неисследованным. Несмотря на то, что данные виды лука являются одними из самых распространенных растений в степных ценозах южного Забайкалья, их запасы в природе резко сокращаются вследствие распашки и пастбищной эксплуатации угодий. Поэтому успешная интродукция этих видов лука в Новосибирской области (Черемушкина и др., 1992) дает возможность более активного их использования в качестве пищевых добавок и создания на основе этих ценных растений новых лекарственных препаратов. Изучение биологической продуктивности одновременно с содержанием флавоноидов у растений из различных местообитаний позволит выявить наиболее перспективные для использования и введения в культуру природные популяции. Исследование изменчивости флавоноидного признака у растений из природных популяций даст возможность понять особенности накопления этих соединений в зависимости от экологических условий среды, что, в свою очередь, важно для прогнозирования содержания как отдельных флавоноидов, так и суммы флавонол-гликозидов в целом.
Цель работы — изучение химического состава у A. ramosum, A. senescens и A. glaucum в природных условиях для выделения перспективных популяций, имеющих высокую биологическую продуктивность и повышенное содержание флавоноидов.
Задачи: 1. Провести рекогносцировочное изучение химического состава A. ramosum, A. senescens и A. glaucum с целью выявления групп биологически активных соединений, перспективных для углубленного изучения рода Allium L.
СІЬт«рЄу»г
-
Изучить в естественных местах произрастания, различающихся по экологическим условиям, биологическую продуктивность A. ramosum, A. senescens и A. glaucum, установить амплитуду изменчивости морфологических признаков и биологической продуктивности.
-
Изучить качественный состав флавоноидов в надземной части луков A. ramosum, A. senescens и A. glaucum.
-
Разработать методику высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для массовых анализов комплекса флавонол-гликозидов данных видов лука.
»«pftm//i«
\ 03 J00f/«irj
5. Оценить степень влияния эколого-ценотической обстановки на изменчивость флавоноидного признака. Защищаемые положения:
-
Качественный состав и количественное содержание флавоноидов у изученных видов лука в местообитаниях близких по экологическим условиям не отличаются; при смене эколого-ценотической обстановки изменяется количественное содержание компонентов, вплоть до полного отсутствия отдельных флавонол-гликозидов.
-
У растений изученных видов рода Allium прослеживается корреляционная зависимость между биометрическими параметрами и содержанием отдельных компонентов флавоноидного комплекса.
Научная новизна:
— определено суммарное содержание алкалоидов, стероидных сапонинов,
аскорбиновой кислоты, эфирных масел и флавоноидов в данных видах лука;
изучены индивидуальные компоненты фенольного комплекса надземной частив, ramosum и A. senescens, установлено наличие флавоноидов и фенолкарбоновых кислот у обоих видов, а также антоцианов в соцветиях A. senescens;
из надземной части A. senescens впервые выделен кемпферол-3-р-неогесперидозид-7-0(2-0-(транс-ферулоил))-Р-В-глюкопиранозид;
разработана методика высокоэффективной жидкостной хроматографии для экспресс-анализа флавоноидного комплекса изучаемых видов лука;
изучена изменчивость компонентов флавоноидного комплекса у растений обитающих в различных экологических условиях;
исследована изменчивость морфологических признаков A. ramosum, A. senescens и A. glaucum в зависимости от эколого-ценотической обстановки для привлечения в интродукцию высокопродуктивных популяций.
Практическая значимость. Богатство химического состава дикорастущих видов лука позволяет рекомендовать их в качестве основы многих пищевых добавок профилактического назначения. Нами была разработана технология изготовления ливерной колбасы «Ароматная» (Анцупова, Батуева, Дорофеева, 1995) с добавлением сухой надземной массы A. senescens. Были выявлены перспективные для дальнейшей интродукции высокопродуктивные по фитомассе и содержанию флавоноидов популяции трех видов лука в условиях юга Забайкалья. Разработанный нами метод изучения флавоноидного комплекса надземной части луков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) предназначен для массового экспресс-анализа данных видов лука, а также для изучения состава флавоноидов других видов рода. Allium L. Одновременное изучение биологической продуктивности, величины морфологических параметров и содержания отдельных флавоноид-ных компонентов имеет существенное значение для практического использования сырья луков.
Благодарности. Данная работа выполнена на приборной базе Восточно-Сибирского государственного университета (г.Улан-Удэ), Центрального сибирского ботанического сада (ЦСБС СО РАН), Новосибирского института
органической химии (НИОХ СО РАН), Новосибирского института биоорганической химии (НИБХ СО РАН) и Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ), за что автор благодарен руководителям вышеназванных институтов и отдельных лабораторий. Автор глубоко признателен д.б.н. Черемушкиной В.А за оказанную помощь, поддержку и консультации. Помимо этого хочется выразить персональную благодарность к.б.н. Танхаевой Л.М., к.б.н. Винокуровой Е.Ю. и д.б.н. Высочиной Г.И. за помощь в освоении отдельных методик.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на отчетных сессиях ВСГТУ (Улан-Удэ, 1995, 1996) и ЦСБС (Новосибирск, 2003), на научной конференции преподавателей, научных сотрудников и аспирантов ВСГТУ (1996), на совещании «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» (Новосибирск, 1998), на конференциях «Исследования молодых ботаников Сибири» (Новосибирск, 2001, 2004) и на XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в азиатской России» (Новосибирск-Барнаул, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ и 2 технологические инструкции.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы и приложения. Содержание диссертации изложено на 129 страницах, включая 21 страницу приложения, 30 рисунков и 12 таблиц. Список литературы содержит 170 источников, в том числе 33 — на иностранных языках.
Природные условия районов исследования
В нашей работе мы привлекали природный материал из популяций трех видов лука, произрастающих в центральных, южных и юго-западных районах Бурятии (Тарбагатайском, Иволгинском, Селенгинском, Джидинском, Кях-тинском и Тункинском) и южных и юго-восточных районах Читинской области (Оловяннинском, Борзинском, Агинском и Калганском). Природные условия данной территории описаны ниже.
Геологическое строение. Большая часть территории Бурятии и Читинской области сложена кристаллическими сланцами, гранитами и гранит-порфирами. В Западном Забайкалье значительную роль играют вулканогенно-осадочные толщи мезозойского возраста, в то время как Восточное Забайкалье отличается развитием отложений морского происхождения: глинистые и кремнистые сланцы, песчаники и конгломераты. Континентальные меловые отложения Забайкалья сложены разногалечными конгломератами, гравийными песчаниками, алевролитами, углистыми и битуминозными сланцами с прослойками бурых углей. Третичные отложения (конгломераты, песчаники, глины) занимают незначительные площади. Мощные толщи четвертичных отложений располагаются по древним и современным речным долинам, на их террасах и в молодых тектонических впадинах (Флоренсов, 1954; Гвоздецкий, Михайлов, 1978).
Рельеф. Селенгинское среднегорье охватывает бассейн р. Селенги и ее притоков (Чикоя, Хилка, Джиды и др.). Преобладают куполообразные возвышенности, расположенные цепями и образующие широкие, слабо выраженные хребты (Малханский, Заганский, Худунский) высотой 1300-1800 м. Они разделяются широкими межгорными котловинами, лежащими на высоте 500-700 м. Отличительные признаки гор этого района — сильная разветвленность хребтов, так что с трудом прослеживается их простирание с юга-запада на северо-восток. Впадины также имеют различную направленность и занимают, по сравнению с увалами, гораздо меньшую площадь.
Восточное Забайкалье — район распространения низких параллельных хребтов с мягкими очертаниями водоразделов и постепенными переходами к межгорным понижениям. Высота хребтов 1000-1200 м, только отдельные вершины имеют отметки около 1500 м. Многочисленные, вытянутые в северовосточном направлении хребты (Кукульбей, Нерчинский, Кличкинский, Аргунский, Урюмканский и др.) занимают меньшую площадь, чем располагающиеся между ними обширные депрессии. Местность вследствие мягких очертаний хребтов и их незаметного понижения представляет пологоволнистую равнину. Наиболее резкие формы рельефа характерны для Прибайкалья, горные хребты которого: Баргузинский, Икатский, Хамар-Дабан, Саяны и другие обрамляют впадину оз. Байкал и сопряженные с ней впадины байкальского типа (Тун-кинскую, Торекую, Мондинскую, Баргузинскую и др.). Днища межгорных котловин лежат на уровне 460-700 м. Высоты хребтов достигают максимума (около 3000 м) у края впадин, а в сторону от них высоты понижаются (Михайлов, 1961). Климат. В основных чертах климат характеризуется как континенталь ный, с длинной холодной малоснежной зимой, короткой засушливой и ветре ной весной, жарким и влажным во второй половине летом, прохладной, часто ясной осенью. Средняя годовая температура колеблется от -1,5С в южной час ти до -4С — в северной, средняя минимальная температура января в южной части -30, в северной 37,5С, средняя максимальная июля 28 и 24С соот ветственно. Среднее годовое количество осадков варьирует от 160 до 360 мм, большая часть их (более двух третей) выпадает летом. Постоянно ощущается дефицит влаги. Сумма положительных температур выше 10С возрастает с за пада на юго-восток. В Предбайкалье — 1400-1700, в Забайкалье — 1600-1900, на крайнем юге, в районе Торейской впадины — более 2000. Такая же законо мерность наблюдается по продолжительности солнечного сияния в часах. В За байкалье составляя около 2300 ч, на юге Восточного Забайкалья достигает наи большей величины — более 2700 ч. При наличии сильно пересеченного релье фа суровый климат Забайкалья создает большую гамму микроклиматов — от довольно умеренных до ультраконтинентальных (Давыдова, Раковская, 1990). Для того, чтобы выявить характерные особенности климата местности, в которой обитали растения изучаемых популяций, его различие или сходство с климатом других местностей, нами был применен метод графического изображения климата путем построения климадиаграмм (Вальтер, 1968). На климадиаграммах отчетливо видны сезонные изменения климатических условий. Температурная кривая и кривая осадков дают представление о характере водного баланса изучаемой территории. Данные о динамике средних и абсолютных минимальных температур, продолжительности безморозного периода позволяют достаточно полно охарактеризовать длительность и режим холодного времени года (рис. 3).
Почвенные условия. В юго-западном Забайкалье преимущественно распространены почвы каштанового типа, черноземы занимают подчиненное положение, а лугово-черноземные почвы почти не встречаются. В Восточном Забайкалье все три типа почв занимают примерно равные площади (Ногина, 1954,1964). При этом здесь наблюдается их зональное распределение: в полосе переходной от леса к степи, распространены лугово-черноземные и черноземные почвы, а южнее господствуют каштановые.
Каштановые почвы обычно приурочены к относительно низким абсолютным высотам (500-800 м) и к почвообразующим породам легкого механического состава на высоких древних террасах, предгорных мелкосопочных территориях, широких участках котловин и крутых южных склонах хребтов. Содержание гумуса в них не выше 3%.
Черноземы занимают территории между высотами 800-1000 м и только в отдельных случаях по крутым склонам южной экспозиции могут подниматься до 1100-1200 м ( в лесостепь и даже южную тайгу). Их массивы занимают относительно низкие и южные хребты и обрамляют территории, занятые каштановыми почвами. Содержание гумуса — от 3-4 до 12%. Это самые плодородные почвы данной местности.
Серые лесные почвы встречаются в юго-западных частях Читинской области и Бурятии и формируются на подгорных участках котловин по северным слонам сопок на карбонатных и бескарбонатных породах и содержат 6-9% гумуса.
Под лесостепью на юго-востоке Забайкалья в условиях вечной мерзлоты формируются мерзлотные лугово-лесные почвы. Почвенный покров пойменных участков представлен серыми лесными черноземовидными почвами с тяжелым механическим составом. Содержание гумуса — более 5%. На леднико-во-озерных песках распространены дерново-подзолистые песчаные почвы, в наиболее пониженных частях находятся болотные и засоленные почвы (Макеев, 1954). Под лугами располагаются дерново-луговые черноземовидные и песчано-хрящеватые аллювиальные почвы (Галактионов, 1954).
Луки как лекарственные растения
Как лекарственные растения лук и чеснок известны со времен Гиппократа; лук — в качестве мочегонного и противоцинготного средства, чеснок — в качестве противоглистного и средства от насморка (Землинский, 1958). В китайской медицине чеснок относится к самым ценным лекарственным средствам, так как ему приписывают тонизирующее действие при заболеваниях органов дыхания, пищеварения, при истощении, ревматизме, заболеваниях кожи и называют "перестраивающим" (Ковалева, 1971).
Очень широким было применение видов лука в различных народных медицинах. В первую очередь дикорастущие виды лука употребляли при желудочно-кишечных заболеваниях и в качестве антигельминтных средств. (Алиев и др., 1963; Турова, 1974). Например, в Болгарии свежую подземную часть лука медвежьего (A. ursinum L.) или ее настой применяли при заболеваниях органов пищеварения (Йорданов и др.,. 1976). В монгольской медицине л.победный (A. victorialis) употреблялся при гипофункции желудка (Уткин, 1931), а в индийской медицине считался незаменимым средством при дизентерии и метеоризме лук-скорода {A. schoenoprasum L.) (Chopra et al., 1956).
Свежие и сухие растения лука алтайского (A. altaicum) использовались в монгольской народной медицине для изгнания гельминтов (Хайдав, 1965). В Приамурье для этой цели применяли подземную и надземную части, а также семена лука охотского {A. ochotense Prokh.) (Вострикова, Востриков, 1974). В тибетской медицине при гельминтозах употребляли все растение лука победного {A. victorialis) и семена л. неравно лучевого {A. anisopodium L.) (Варлаков, 1963).
Различные виды, луков использовались также при лечении сердечнососудистых заболеваний. A.rubellurn, произрастающий на Кавказе, применялся при болезнях сердца (Роллов, 1908), A. victorialis в монгольской медицине — рекомендовали при атеросклерозе (Уткин, 1931).
В наши дни луки изучаются как растения, обладающие ярко выраженной антимикробной активностью (Chopra et al,, 1956; Алиев и др., 1963). Биологически активные соединения, полученные экстракцией чешуи репчатого лука 70% этанолом, проявили наибольшую антибактериальную активность в отношении четырех штаммов стафилококков и 5 видов энтеробактерий (Компанцев и др., 1991). Было доказано, что серусодержащие вещества лука и чеснока обладают антибактериальным действием (Lang et al., 1981).
Из соцветий (с семенами) лука репчатого, собранных в конце вегетации, получены стероидные гликозиды, обладающие антимикробным действием. Показано, что сумма этих гликозидов подавляет рост тест-культур (Candida albicans, С. krusci, С. rugosa, С. utilis, Saccharomices cerevisiae , Staphylococcus aureus, Escherichia coli) в концентрациях 1000 и 500 гамма/мл (Кинтя и др., 1983). Отмечено ингибирование афлотоксин-продуцирующих грибов экстрактом репчатого лука (Sharma et al., 1979).
Известно, что препараты чеснока (A. sativum L.) повышают секрецию и улучшают моторную функцию желудочно-кишечного тракта, а спиртовая вытяжка из репчатого лука оказывает стимулирующее влияние на секреторную функцию желез пищеварительного тракта (Турова, 1974). Содержащиеся в луке-порее (A. porrum L.) эфирные масла обладают лечебным эффектом: повышают аппетит, улучшают деятельность печени, желудка и кишечника (Воскресенская и др., 1985).
Спиртовая вытяжка из репчатого лука оказывает стимулирующее влияние на сердечную деятельность и обладает антисклеротическими свойствами, в то время как препараты чеснока понижают артериальное давление, увеличивают амплитуду и замедляют ритм сердечных сокращений, расширяют периферические и коронарные сосуды сердца, тормозят активность холинэсте-разы (Турова, 1974).
Желтая форма А. сера содержит простагландини в составе кислой фракции, которая способна снижать артериальное давление. (Attrep et al., 1980).
Из шелухи репчатого лука выделены комплекс флавоноидов и чистый кверцетин,. обладающие диуретическим свойством и повышающие выведение натрия и хлоридов (Kaczmarec, 1961). Высоким содержанием калия в сочетании с другими солями обусловлены диуретические свойства лука-порея (Воскресенская и др., 1985).
Препараты из некоторых видов лука были рекомендованы для применения в официнальной медицине, и в первую очередь это, конечно, лекарственные средства на основе лука репчатого и чеснока.
Из шелухи лука репчатого получен препарат флавоноидов, включающий в себя кверцетин и спиреозид, который снижает уровень холестерола в крови при экспериментальной гиперхолестеринемии (Лисевицкая и др., 1966).
Желчегонным действием обладают многие растения, однако лишь у некоторых выявлен гепатозащитный эффект. Введение препарата из чеснока посевного A. sativum L. (экстракт из луковиц) стимулировало регенераторные процессы в печени (Nakagawa et al., 1985).
К.П. Балицкий и А.Л. Воронцова (1982) приводят ряд данных о противораковых свойствах препаратов чеснока и лука в эксперименте и применении их в клинике при профилактике предраковых и лечении раковых заболеваний. Механизм терапевтического действия чеснока авторы связывают не только с бактерицидным, но и с раздражающим эффектом, индуцирующим асептическое воспаление в области очага поражения.
Э.Е.Бакиной с соавторами (1967) изучено влияние «Флаваллицепа» — нового препарата из чешуи луковиц лука репчатого, содержащего гликозиды кверцетина в количестве около 40%, на проницаемость мембран при лучевых поражениях организма. Было установлено, что препарат обладает выраженным противолучевым действием.
Из лука белоцветного (A. leucantum) получен суммарный препарат сапонинов под названием; "Аллилпонин". Предварительные фармакогаостичес-кие исследования показали, что данный препарат по своему противоскле-ротическому действию не уступает "Диоспонину" (Исмайлов, Тагиев, 1977).
Эфирный экстракт подземной части:A. ursinum (мазь, на вазелине) — уразаллин — был разрешен к применению для лечения гнойных ран, трофических язв, пролежней (Гаммерман и др., 1970).
Экстракты лука стареющего (A. senescens) проявляют противогрибковый і эффект в концентрации ниже 1000 мкг/мл. Суммарные препараты алкалоидов; этого вида задерживают рост такого устойчивого возбудителя-как Candida albicans в концентрации 62,5-125 мкг/мл (Анцупова, Дмитрук, 1991).
Изучаемые: нами забайкальские виды лука применялись в тибетской, монгольской и народной медицине Забайкалья. Так, при бронхитах и гастроэнтерите использовали все растение A. ramosum и A. senescens (Варлаков, 1963; Шретер,1975). Траву и семена A. ramosum в тибетской медицине считают кровоочистительным средством (Шретер, 1975).
Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты
50 г воздушно-сухой надземной массы лука ветвистого, собранного в фазу полного цветения, экстрагировали 70% этанолом на водяной бане с обратным холодильником трижды по 30 мин (соотношение сырье : экстрагент — 1:10). Контроль за полнотой извлечения флавоноидов осуществляли по отрицательной реакции с А1СЬ- Обьединенные экстракты сгущали под вакуумом. Водный остаток обрабатывали в делительной воронке хлороформом с целью удаления липофильных веществ, затем экстрагировали н-бутанолом.
В бутанольной фракции методом двумерной хроматографии на бумаге марки FN-15 установлено наличие не менее 8 веществ флавоноидной природы (рис. 7). Элюирующими системами служили: в первом направлении — н-бутанол — уксусная кислота — вода (40:12:28); во 2-м — дистиллированная вода, в последнем случае хроматографировали дважды. Для препаративного выделения данных соединений использовали бумагу марки FN-8 и те же системы растворителей. С бумаги индивидуальные вещества элюировали 70% этанолом и при необходимости проводили дополнительную очистку на хро-матографическом картоне в системе дистиллированная вода (дважды).
Гидролиз нативного спиртового экстракта л.ветвистого осуществляли 2N соляной кислотой с дальнейшим извлечением агликонов диэтиловым эфиром. Эфирный экстракт хроматографировали на бумаге в системах: 1) уксусная кислота — соляная кислота — вода (30:3:10), 2) 60%-ная уксусная кислота, 3) изопропанол — муравьиная кислота — вода (2:5:5) и на силикагеле (система: толуол — этилформиат — муравьиная кислота (5:4:1)). Хроматография показала наличие трех агликонов, два из которых были отождествлены с кверцетином и кемпферолом.
По данным БХ в бутанольном экстракте преобладали 4 компонента (значения Rf в табл. 7). По окраске пятен в УФ-свете до и после реакции с 10% спиртовым раствором А1С13 они предварительно отнесены к флавонол-гликозидам. Для установления структуры данных соединений был проведен их кислотный гидролиз: 2N НС1 в течение 2 часов на водяной бане, экстракция агликонов диэтиловым эфиром. Продукты гидролиза идентифицировали восходящей хроматографией на бумаге марки FN-15 в сравнении со свидетелями в системах растворителей: уксусная кислота — соляная кислота — вода (30:3:10), 60%-ная уксусная кислота, изопропанол — муравьиная кислота — вода (2:5:5). Проведенные исследования показали, что агликон веществ К1 и КЗ по значениям Rf и окраске пятен до и после обработки АІСІз совпадает со свидетелем кверцетином. В УФ-спектре (нм)С2Н501,Хтах 257, ЗООпл., 370.
Агликон веществ К2 и К4 по спектральным данным (УФ-спектр (нм)С2Н50нХтах 266, 325 пл, 368) и значениям Rf совпадает со свидетелем кемпферолом. Идентичность агликонов изученных веществ кемпферолу и кверцетину была также подтверждена методом ВЭЖХ в сравнении со стандартными образцами.
ВЭЖХ была осуществлена на приборе МилиХром А-02, на колонке заполненной Нуклеосилом С18 с размером частиц = 5 мкм, размер колонки 2x75мм. Время детектирования составило 0,18с, температура колонки 35 С, максимальное давление 3.0 МПа. Градиентное элюирование было проведено: раствор А — 0,1% трифторускусной кислоты в воде» раствор Б — 0,1% трифторуксусной кислотой в 70% ацетонитриле. Скорость потока 150 мкл/мин. Детектирование осуществлялось при длинах волн Я=220, 254 и 360 нм. Время удерживания кверцетина— 11,50 мин, кемпферола —13,50 мин. Идентификацию агликонов осуществляли по временам удерживания и спектральным отношениям в сравнении с аутентичными образцами кемпферола и кверцетина.
Сахарный остаток соединений К1, К2, КЗ и К4 определяли после гидролиза гликозидов и отделения агликонов, методом нисходящей бумажной хроматографии в присутствии свидетелей в системах: н-бутанол — ацетон — вода (2:7:1), н-бутанол — этанол — вода (5:4:1) и восходящей БХ в системе этилацетат — уксусная кислота — вода (3:3:1). Для проявления Сахаров на хроматограмме использовали раствор анилинфталата в н-бутаноле, насыщенном водой. Сахара идентифицировали, сопоставляя значения Rf и по ок 53
раске пятен после обработки реагентом. Оказалось, что сахарами у соединений К1 и К2 служат глюкоза и ксилоза, а у соединений КЗ и К4 к вышеназванным сахарам добавляется еще и рамноза. По данным гидролиза и хрома-тографическому поведению (включая хроматографию в условиях высокого давления — ВЭЖХ) вещества К1 и К2 могут быть предварительно отнесены к биозидам, а соединения КЗ и К4 — к триозидам.
Выделение флавоноидов из A. senescens
Преимущества ВЭЖХ для разделения и аналитического определения различных органических соединений (возможность анализа практически нелетучих веществ, упрощение операций подготовки проб и т.д.) обусловливают широкое применение этого метода. Однако, в современных публикациях основное внимание уделяют выбору оптимальных условий разделения заранее известных веществ (варианты т. н. подтверждающего анализа) (Зенкевич, Косман, 1996; Зенкевич и др., 1996).
Что же касается проблем исследования образцов, содержащих априорно неизвестные компоненты (разведочный анализ), то состояние их разработки значительно хуже. Тем не менее, в последнее время все больше внимания уделяют выбору и систематизации наиболее воспроизводимых аналитических параметров (таких как хроматографические индексы удерживания, коэффициенты относительного поглощения на разных фиксированных длинах волн) для формирования баз данных (Зенкевич, Косман, 1996; Косман, Зенкевич, 1997).
При исследовании комплекса флавоноидов у луков перед нами встала задача по определению качественного состава и количественного содержания отдельных флавоноидов в малой навеске у большого количества образцов. Существующие методики (хромато-спектрофотометрическая и хрома-то-денситометрическая) не отвечали данным требованиям. Поэтому нами была разработана методика определения флавоноидов в изучаемых видах лука с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Навеску воздушно-сухого сырья массой 1 г, взвешенного с точностью до 0,01 г, заливали 25 мл 70%-ного этанола и экстрагировали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Отфильтровывали и под вакуумом упаривали досуха. К сухому остатку приливали 6 мл 96%-ного метанола, тщательно перемешивали и отфильтровывали. Осадок отбрасывали, а метанольный экстракт упаривали под вакуумом досуха. Затем растворяли по мере необходимости в 0,1-0,2. мл метанола и отбирали для анализа аликвотную часть. Исследование компонентного состава флавоноидов надземной части изучаемых видов лука проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Милихром 1» (колонка 2x60 мм, стационарная фаза Лихро-сфер RP-18) в градиентном режиме. В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола и 0,1% уксусной кислоты от 0:100 до 90:10). Скорость элюирования 100 мкл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при пяти длинах волн одновременно (280, 300, 320, 340 и 360 нм), уровень детекции (А) равен 0,01. Количество вводимой пробы во всех случаях составило 2 мкл. В качестве реперных веществ для идентификации пиков на хроматограммах исследуемых экстрактов использовали индивидуальные соединения, выделенные ранее из надземных частей луков ветвистого и стареющего. Пики на хроматограммах экстрактов идентифицировали с использованием двух параметров: 1) время удерживания (время удерживания определяли для каждого вещества в отдельности и в модельных смесях); 2) спектральные отношения, рассчитанные как отношения площадей хроматографических пиков записанных при 280, 300, 320, 340 и 360 нм (спектральные отношения рассчитывали в том числе и по хроматограммам эталонных веществ). Также спектральные отношения были рассчитаны для более чем ЗО флавонолов по их УФ-спектрам. Гомогенность пиков флавоноловых гликозидов на хроматограммах подтверждали: 1) методом многоволновой детекции при 280, 300, 320, 340 и 360 нм с контролем величины спектральных отношений; 2) рехроматографией пиков, отнесенных на хроматограмме экстракта к флавонол-гликозидам после препаративного их выделения. Препаративное выделение гликозидов осуществляли на приборе «Милихром-1», колонка 2x64 мм, стационарная фаза Сепарон С-18 в градиентном режиме. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды (от 30:70 до 50:50) с добавлением 1%-й уксусной кислоты. Скорость элюирования 100 мкл/мин. Детектирование УФ-детектором на 260 и 360 нм. Нами была дана количественная оценка содержания отдельных флаво-ноидных компонентов (Дорофеева, 2001). Количество флавоноидных веществ в пробе оценивали по интегралу площади пика вещества по отношению ко всей сумме разделенных компонентов — такая оценка возможна из-за сходства спектральных параметров флавонол-гликозидов изученных видов. У лука ветвистого на хроматограммах экстракта из надземной части (типичная хроматограмма приведена на рис. 11) присутствовали пики, соответствующие по времени удерживания и спектральным отношениям соединениям 1-6 (табл. 9): два полигликозида кверцетина, триозиды кемпферола и кверцетина, биозиды кемпферола и кверцетина. Лук стареющий на хроматограммах экстракта надземной части имел следующие пики: пик № 2 был отождествлен нами с кемпферол-триглико-зидом (время удерживания = 14,25±0,034), остальные три флавоноида ( далее именуемые флавоноид 1, 2 и 3) можно на основе анализа спектральных данных, на наш взгляд, отнести к флавонол-гликозидам (хроматограмма на рис. 12). У лука сизого на хроматограммах спиртовых экстрактов присутствовало 4 пика флавоноидной природы: из них пик № 2 по времени удерживания и спектральным данным совпадает с таковыми хроматографическими параметрами для стандартного образца кемпферол-тригликозида (см. хроматограмму на рис. 13), остальные пики представляют собой флавоноиды 1, 2 и 3 (по результатам анализа спектральных отношений). Как показал ВЭЖХ-анализ спиртового извлечения надземной части лука ветвистого, преобладающими соединениями в нем служат триозиды кемпферола и кверцетина. Хроматограммы луков стареющего и сизого демонстрируют сходный состав флавоноидов этих видов — для них, в большинстве случаев, характерно преобладание кемпферол-тригликозида.. Следует отметить, что флавоноидный комплекс A. ramosum (данный вид принадлежит к секции Butomisd) значительно отличается от комплекса флавоноидов A.senescens и A.glaucwn, относящихся к секции Rhizirideum. Разработанная методика В ЭЖХ-анализа качественного состава флавоноидов в экстрактах из надземной части трех видов лука предназначена для массовых анализов сырья вышеназванных видов.
