Содержание к диссертации
Введение
1. Актин 19
1.1. Структура молекулы актина и стадии образования полимера 19
1.2. Построение различных сетей актиновых филаментов 23
1.3. Механические свойства актинового цитоскелета 26
2. Актин-связывающие белки, образующие различные актиновые структуры 27
3. Основные сигнальные пути, регулирующие построение актиновых структур 31
3.1. Семейство Rho ГТФаз 31
3.2. Rho ГТФазы и актиновый цитоскелет 32
3.3. ERK-MAPK каскад и актиновый цитоскелет 36
3.4. Фосфатазы, выполняющие функцию опухолевых супрессоров 37
4. Контакты фибробластов с внеклеточным матриксом 38
5. Компоненты внеклеточного матрикса 42
6. Межклеточные контакты 46
7. Изоформы актина 49
8. Регуляция экспрессии изоформ актина 52
9. Функции актиновых изоформ 56
9.1 Локализация и распределение изоформ актина 57
9.2. Саркомерные актины 57
9.3. Гладкомышечные актины (SMA) 58
9.4. Цитоплазматические актины (CYAs) 60
10. Реорганизация актина при неопластической трансформации 62
11. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 63
12. МАРК в опухолевой прогрессии з
12.1. Сигнальные каскады МАРК 65
12.2 Роль ERK1/2 сигнального пути при ЭМП III типа 67
12.3 Окислительный стресс, МАРК сигнальные пути и ЭМП 69
13. заключение 72
Основные материалы и методы исследования 73
1. Культивирование клеток и реагенты 73
2. Иммунофлуоресценция. Световая микроскопия 75
3. Фазово-контрастная и интерференционно-отражательная микроскопия 76
4. Морфометрия клеток 76
5. Морфометрия фокальных контактов (ФК) 77
6. Иммунофлуоресценция и Лазерная Сканирующая Конфокальная микроскопия 78
7. Трансфекция малыми интерферирующими РНК (siRNA) 79
8. Трансфекция EGFP- конструкциями и ретровирусными конструкциями онкогенов RAS 79
9. Морфометрия клеток в экспериментах с siRNA 79
10. Прижизненная микроскопия после siRNA трансфекции 80
11. Характеристика антител к изоформам актина 81
12. Электрофорез белков и иммуноблоттинг 81
13. Статистический анализ 82
14. Сравнительное иммуноморфологическое исследование нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека 82
15. Сравнительное иммуноморфологическое исследование нормальной и опухолевой ткани шейки матки человека 84
Результаты и обсуждение 85
Часть 1. Исследование цитоскелетных характеристик и организации адгезионных структур a-SMA - позитивных и a-SMA - негативных культивируемых крысиных фибробластов различного органного происхождения 85
1.1. Морфометрия a-SMA - позитивных и a-SMA - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождения 86
1.2. Цитоскелетные структуры и фокальные контакты (ФК) у a-SMA - позитивных и х-SMA - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождения... 88 1.3. Организация клеточного FN у a-SMA - позитивных и a-SMA - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождении 91
1.4. Прижизненное изучение влияния экспрессии a-SMA на псевдоподиальную активность фибробластов 92
1.5. Обсуждение. Сравнительные цитоскелетные характеристики и организация адгезионных структур у a-SMA-позитивных и a-SMA-негативных клеток в культурах крысиных фибробластов различного органного происхождения 94
Часть 2. Динамическая молекулярная организация контактов клетки с внеклеточным матриксом при модуляциях экспрессии a-SMA . 96
2.1. Роль a-SMA изоформы в эволюции ФК 96
2.1.1. Анализ разнообразия и характеристика категорий ФК 96
2.1.2. Биохимическая характеристика ФК-ассоциированных белков 101
2.1.3. Действие рекомбинантного фрагмента клеточного фибронектина rED-A и блокирующих антител на организацию FN сети и созревание ФК 103
2.1.4. rED-A связывается с полимеризованным FN 103
2.1.5. Влияние актомиозиновой сократимости на структуру стресс-фибрилл и ФК 108
2.1.6. Суперсозревание ФК зависит от повышенной сократимости, связанной с экспрессией -SMA 113
2.1.7. Действие ингибиторов МЕК1 и р38 на полимеризацию FN и экспрессию a-SMA 115
2.1.8. Индукция миофибробластной дифференцировки с помощью митохондриально - направленных антиоксидантов 117
2. 2. ОбсуждениЕ 119
2.2.1. Функция a-SMA связана с модуляцией ФК при дифференцировке фибробластов в миофибробласты 119
2.2.2. Формирование фибрилл FN под действием TGFp 121
2.2.3. Роль р38 в полимеризации FN и модуляции миофибробластов 122
2.2.4. Равновесие натяжения, определяемого актомиозиновым цитоскелетом, и устойчивостью внеклеточного матрикса в суперзрелых ФК 122
Часть 3. Исследование организации и распределения цитоплазматических актинов в немышечных клетках .124
3.1. Характеристика mAbs к р- и y-CYA 124 3.2. Изучение внутриклеточной локализации р- и y-CYA в фибробластах и эпителиальных клетках при распластывании и в стабильном состоянии 126
3.3. Организация цитоплазматических актинов при миграции клеток 132
3.4. Соотношение между сегрегацией актиновых изоформ и актомиозиновой сократимостью 135
3.5. Разная чувствительность цитоплазматических актинов к ингибиторам малых ГТФаз и агентам, меняющим полимеризацию актин 137
3.6. Действие РНК-интерференции р- и y-CYA на морфологию и подвижность...139
3.6.1. РНК интерференция р- и y-CYA в подкожных фибробластах 139
3.6.2. РНК интерференция p-CYA и y-CYA в эпителиальных клетках 145
3.7. Индивидуальные роли p-CYA и y-CYA в регуляции эпителиальных апикальных межклеточных контактов 147
3.8. Изучение реорганизации актинового цитоскелета при неопластической трансформации в различных экспериментальных системах 149
3.8.1. Реорганизация актинового цитоскелета культивируемых фибробластов под действием опухолевого промотора 149
3.8.2. Изменения актинового цитоскелета культивируемых фибробластов, связанные с неопластической трансформацией онкогеном N-RAS 152
3.8.3. Изменения актинового цитоскелета культивируемых фибробластов, связанные с неопластической трансформацией вирусом SV40 153
3.8.4. Изменения актинового цитоскелета культивируемых эпителиальных клеток, индуцируемые скеттер-фактором HGF/SF 154
3.8.5. Изменения актинового цитоскелета культивируемых эпителиальных клеток, связанные с неопластической трансформацией онкогеном N-RAS 157
3.8.6. Организация актинового цитоскелета в культивируемых опухолевых кератиноцитах 157
3.8.7. Фенотипическая нормализация неопластически трансформированных клеток с помощью митохондриально - направленных антиоксидантов: реорганизация актина 161
3.9. Обсуждение. Изучение внутриклеточной локализации и функций р- и y-CYA
в фибробластах и эпителиальных клетках в стационарном состоянии и при
реорганизациях актинового цитоскелета 166
Часть 4. Исследование реорганизации изоформ актина в нормальных и опухолевых тканях человека 173 4.1. Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и
опухолевой ткани молочной железы человека .173
4.1.1. Исследование распределения изоформ актина в эпителиальных структурах нормальной ткани молочной железы 173
4.1.2. Исследование распределения изоформ актина в доброкачественных опухолях и диспластических структурах молочной железы 176
4.1.3. Исследование распределения изоформ актина в злокачественных опухолях люминального типа 178
4.1.4. Актины как цитоскелетные маркеры в диагностике базальноподобного рака молочной железы (РМЖ) человека 179
4.2. Выявление цитоплазматических изоформ актина в клетках нормального экзоцервикса и инвазивного рака шейки матки 185
4.3. Обсуждение 187
4.3.1. Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и опухолевой ткани люминального типа молочной железы человека .187
4.3.2. Иммуногистохимические методы в диагностике морфологических и молекулярно - биологических типов РМЖ .188
4.3.3. Реорганизация изоформ актина и адгезионных контактов при эпителиально-мезенхимальном переходе в клетках цервикальных карцином 191
Заключение 194
Выводы 200 список статей, опубликованных по теме диссертации 201
Список сокращений 204
Список литературы
- Механические свойства актинового цитоскелета
- Фазово-контрастная и интерференционно-отражательная микроскопия
- Биохимическая характеристика ФК-ассоциированных белков
- Соотношение между сегрегацией актиновых изоформ и актомиозиновой сократимостью
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Актины - основные структурные компоненты цитоскелета эукариотических клеток. Актиновые микрофиламенты выполняют различные функции, большинство из которых связано со способностью к сборке и разборке филаментозных структур. Актомиозиновые структуры осуществляют сократительные и двигательные функции клеток. Актиновая система отвечает за клеточную подвижность, которая лежит в основе тканеобразования в процессе эмбриогенеза и дальнейшего развития многоклеточных организмов. Реорганизации актинового цитоскелета необходимы для осуществления нормальных биологических процессов заживления ран, регенерация тканей, иммунного ответа.
Патологическое изменение подвижности клеток с нарушением регуляции актиновой системы происходит при воспалительных, фибросократимых, сердечнососудистых заболеваниях, при опухолевой инвазии и метастазировании. Нарушение в организации актиновой систем приводит к изменению упорядоченности и ориентации, неконтролируемому росту клеток, неправильному ответу на внешние стимулы, опухолевой трансформации (Prasad, 2005; Yamaguchi, Condeelis, 2007). Изучение процессов реорганизации актинового цитоскелета, определяющих клеточную подвижность в норме и при опухолевой трансформации, а также механизмов, специфически регулирующих эти процессы, является фундаментальной научной проблемой, на решение которой были направлены исследования автора.
Высшие позвоночные продуцируют 6 изоформ актина: 4 мышечных и 2 немышечных. Мышечные актины тканеспецифичны, их экспрессия и строгая регуляция в процессе развития и дифференцировки предполагает функциональную значимость изоформ. Функциональная роль -гладкомышечного актина (-SMA), который может экспрессироваться и в немышечных клетках, была изучена недостаточно. В немышечных клетках экспрессируются две основные изоформы- -и -цитоплазматические актины (- и -CYA), различающиеся только по 4 аминокислотам на NH2-конце. Цитоплазматические актины играют ведущую роль в ключевых клеточных процессах, таких как адгезия, миграция, поляризация, митоз. Патологические изменения подвижности клеток с нарушением регуляции актиновой системы происходят при опухолевой трансформации, они приводят к инвазии и метастазированию. Функциональные различия - и -CYA в нормальных и неопластически трансформированных клетках не были изучены. Понимание механизмов селективной регуляции изоформ актина необходимо для поиска новых путей диагностики и избирательного воздействия на инвазивные и метастатические свойства опухолевых клеток, а также направленного воздействия на системы цитоскелета, связанные с другими патологиями и заболеваниями человека.
Степень разработанности темы исследования. Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем. Топографическое распределение и функциональные различия между - и -CYA ранее известны не были. Механизмы построения и реорганизации разнообразных актиновых структур были изучены недостаточно. Известно, что малые ГТФ-азы семейства Rho отвечают за образование различных структур, связанных с клеточным движением. Обнаружено, что актиновые системы, построенные из разных CYAs, находятся под контролем разных малых ГТФ-аз семейства Rho.
В данной работе впервые показана топографическая, структурная и функциональная разница между CYAs в клетках млекопитающих. Характер
подвижности (скорость и направленность движения) нормальных фибробластов, лишенных - или -CYA, различается, т.е. CYAs играют разные роли в клеточной подвижности. С помощью специфического уменьшения экспрессии CYAs методом РНК-интерференции (siRNA) продемонстрирована преобладающая роль -CYA в направленном движении клеток (Dugina et al., 2009). Локализация мРНК -CYA на ведущем крае связывают с направленным движением нормальных клеток (Condeelis, Singer, 2005). У опухолевых клеток та же локализация редуцирует хемотактически зависимую подвижность, инвазивность и метастатический потенциал (Lapidus et al., 2007). С представленными результатами согласуются данные, полученные на клетках нейробластомы: -CYA siRNA блокирует их миграцию (Shum et al., 2011). Угнетение миграционного потенциала эмбриональных фибробластов с выключенным геном ACTB происходит из-за компенсаторной экспрессии -SMA и повышения сократимости, ингибирование которой восстанавливало миграционную способность клеток без -CYA, но с -CYA (Tondeleir et al., 2012).
При опухолевой трансформации происходит реорганизация актинового цитоскелета, ведущая к изменению клеточной подвижности. Отмечена корреляция между исчезновением актиновых стресс - фибрилл и повышением миграционной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994; Sahai, Marshall, 2003). Описано изменение мышечных изоформ актина в некоторых опухолях, а также исчезновение -SMA при опухолевой трансформации (Leavitt et al., 1985; Okamoto-Inoue et al., 1990). Дальнейшее исследование изменений распределения и экспрессии изоформ актина, а также их регуляции в нормальных и опухолевых клетках, было важно для понимания функций изоформ.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было установить потенциальные морфологические и функциональные различия изоформ актина в нормальных и неопластически трансформированных фибробластах и эпителиальных клетках. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
-
Сравнить морфологические и цитоскелетные характеристики фибробластов различного тканевого происхождения в зависимости от экспрессии -SMA в стресс-фибриллах.
-
Исследовать изменения актинового цитоскелета и фокальных контактов (ФК) в зависимости от индукции -SMA на модели дифференцировки миофибробластов под действием ростового фактора TGF- в культуре.
-
Получить данные о взаимной пространственной локализации белков ФК, изоформ актина, клеточного фибронектина (ED-A FN), а также рецепторов к фибронектину (FN) – интегринов, с помощью лазерной сканирующей микроскопии (LSM) с последующей трехмерной реконструкцией изображения.
-
Исследовать функциональную роль -SMA в миофибробластах с помощью ингибирования NH2-концевым декапептидом -SMA, а также специфическими ингибиторами актомиозинового взаимодействия.
-
Сопоставить структурное и пространственное распределение - и -CYA в фибробластах и эпителиальных клетках с помощью LSM, используя моноклональные антитела (mAbs) и специфические ингибиторы Rho/Rac сигнальных путей и актиновой полимеризации.
-
Охарактеризовать морфо-функциональные различия между CYAs в фибробластах и эпителиальных клетках с помощью метода siRNA с избирательным уменьшением экспрессии - и -CYA.
-
Исследовать распределение - и -CYA в нормальных и неопластически трансформированных клетках различных моделей в культуре. Провести сравнение взаимной организации CYAs в нормальной и опухолевой ткани молочной железы и шейки матки человека.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость. В результате проведенного анализа организации актиновых структур с использованием LSM и других современных методов клеточной биологии впервые установлены морфо-функциональные различия между изоформами актина в немышечных клетках. Показано, что экспрессия -SMA и включение его в состав пучков микрофиламентов вызывает увеличение размеров ФК (созревание). Впервые описана особая стадия развития ФК – формирование «суперзрелого» ФК. С помощью LSM с 3D реконструкцией изображения исследована и описана структура «суперзрелого» ФК и условия его возникновения. Показана строгая зависимость формирования «суперзрелых» ФК от молекулярного состава стресс-фибрилл и ECM. При образовании «суперзрелых» ФК необходимыми условиями являются синтез и встраивание в пучок -SMA, ответственного за повышенную сократимость.
Впервые показано, что - и -CYA по-разному локализованы в нормальных мезенхимальных и эпителиальных клетках, и что они образуют различные филаментозные структуры. Впервые при сравнительном изучении клеток различной степени неопластической трансформации проведен анализ организации актиновых структур с использованием LSM с применением 3D реконструкции изображения. Полученные результаты не имели аналогов в литературе. Топографическое распределение и функциональные различия между этими двумя изоформами ранее не были известны. Сравнительного морфологического исследования изоформ актина, а именно изменений в распределении и экспрессии CYAs, исследования регуляции CYAs в нормальных и опухолевых клетках ранее не проводилось.
Проведенные в данной работе эксперименты внесли существенный вклад в исследования в данной области. Впервые были проведены функциональные эксперименты с помощью NH2-концевых пептидов, специфических низкомолекулярных ингибиторов, а также метода siRNA с избирательным уменьшением экспрессии одной из изоформ актина при сохранении экспрессии другой изоформы в нормальных фибробластах и эпителиальных клетках. Сочетание функциональных исследований после уменьшения экспрессии CYAs и метода LSM с одновременным использованием нескольких флуоресцентных маркеров дали уникальную возможность исследования динамики и структуры актинового цитоскелета клетки в норме и при патологических изменениях. Использованные подходы по сочетанию молекулярно-биологических и других современных методов клеточной биологии соответствуют мировому уровню.
Впервые показана связь трансформации клетки с реорганизациями CYAs и модуляциями в их экспрессии. Результаты, полученные в условиях культивирования нормальных и трансформированных клеток, а также в иммуногистохимических исследованиях нормальной и опухолевой ткани молочной железы и шейки матки человека позволяют предположить, что уменьшение экспрессии -CYA при сохранении гомогенного распределения -CYA можно считать характерным признаком опухолевой трансформации. Результаты данной работы свидетельствуют о
перспективности дальнейших исследований молекулярных механизмов регуляции цитоскелетных систем, построенных из различных изоформ актина.
Данное исследование имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение. Обнаружена фенотипическая нормализация трансформированных и опухолевых клеток разного происхождения под воздействием митохондриально-направленных антиоксидантов группы SkQ, что позволяет рассматривать вещества этой группы как потенциальные средства превентивной и поддерживающей противоопухолевой терапии.
Результаты исследования предполагают возможность использования специфических mAbs к изоформам актина в качестве дополнительных иммуно-гистологических маркеров для дифференциального диагноза между доброкачественными и злокачественными новообразованиями молочной железы, шейки матки и других онкологических заболеваний.
Методология исследования. Изучение структуры и динамики актинового цитоскелета, играющего ведущую роль в клеточной подвижности, проводится в течение многих лет, но отсутствие специфических mAbs к -CYA не позволяло ранее проводить сравнительное исследование изоформ актина. Из предыдущих исследований возникла гипотеза о том, что: 1) спектр актиновых изоформ, мышечных и немышечных, может определять морфологические свойства, тип адгезионных структур и другие параметры, связанные с распластыванием и движением клеток; 2) возможно существование морфо-функциональных различий между изоформами актина. Использование спектра новых специфических mAbs к изоформам актина, методов двумерного (2D) электрофореза и иммуноблоттинга белков, функционально-блокирующих пептидов и специфических ингибиторов, применение LSM позволило детально исследовать эти различия. При исследовании формирования и реорганизации актиновых структур использована прижизненная LSM клеток, трансфицированных плазмидами, несущими ДНК различных актиновых изоформ и белков ФК, соединенных с флуорохромами и классическая имунофлуоресценция с широким спектром Abs. При исследовании регуляции реорганизации CYAs в клетке важные результаты были получены при помощи специфического уменьшения экспрессии CYAs методом siRNA. Иммуноморфлогическое исследование тканевых срезов дополнило данные, полученные в условиях культивирования клеток.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Основные результаты были представлены на всероссийских конференциях: 2-м съезде биофизиков России (1999); “Цитоскелет и клеточная регуляция” (Пущино, 2000); «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2003, 2006); «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006); «Фундаментальная онкология – Петровские чтения» (С.-Петербург, 2006, 2008, 2009); XIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2009); Школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (С.-Петербург, 2009, 2011); на международных конференциях: “Mechanisms involved in tissue repair and fibrosis” (Лион, 1997); 14th Meeting of ECF (Оэрас, 1999); 17th Meeting of ECF (Нион, 2002); Gordon Research Conference on Tissue Repair and Regeneration, 2003; 18th ECF Meeting-EMBO/FEBS (Госау, 2003); «From Cell Biology to Development and Disease», FEBS (Хельсинки, 2004); “Tissue Repair, Contraction and the Myofibroblast” (Нион, 2004); FEBS-ESF “Integrated Approaches in Cytoskeleton Research” (Люксембург, 2005); SGED/SSED Annual Meeting (Берн, 2005); Swiss Biomedical Research SSEB Annual Meeting (Женева, 2006); CIBMG1 (Тунис, 2007);
ASCB-ECF (Дижон, 2007); FEBS “Mechanics and Dynamics of the Cytoskeleton” (Потсдам, 2008); SEB-ECF "The Cytoskeleton in Cell Morphogenesis" (Дюрам, 2009); ECF/EMBO «The Cytoskeleton in Development and Pathology» (Стокгольм, 2010); «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010); International Workshop (Жиф-сюр-Иветт, 2010); ECF “Actin-based motility. From molecules to model organisms” (2011); 37th FEBS (Севилья, 2012); ECF “The cytoskeleton in tissue repair and diseases” (Фрибург, 2013); научных конференциях НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН и НИИ ФХБ им.А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова; Ученом Совете НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова 02.12.2013 г.; Московском семинаре по клеточной биологии в МГУ им. М.В. Ломоносова 02.04.2014 г.
Достоверность полученных результатов подтверждается публикациями в рецензируемых научных журналах, показателями их цитируемости в системах Web of Science (543) и Scopus (634).
По теме диссертации опубликовано 74 печатные работы, из них статей в российских и международных журналах, соответствующих перечню ВАК РФ - 20, обзорных глав в сборниках – 2, тезисов докладов в журналах и материалах конференций – 52.
Непосредственное участие автора заключалось в планировании и организации исследований, методической разработке и постановке экспериментов, компьютерной обработке и анализе результатов исследований, написании статей. Соавторы указаны в публикациях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 235 страницах машинописного текста, содержит 79 рисунков, 9 таблиц. Состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и обсуждение» в 4-х частях, «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Библиография включает 458 ссылок.
Механические свойства актинового цитоскелета
Ключевым нуклеатором для ветвящейся сети актина (Рис.3-5) является Агр2/3 комплекс, состоящий из семи белков. Этот комплекс обнаружен практически на всех уровнях развития эукариот, т.е. очень консервативен. Биохимические и структурные эксперименты in vitro показали, что Агр2/3 комплекс связывается с предсуществующими материнскими филаментами актина и инициирует образование дочерних филаментов, которые ответвляются от материнских под углом 70о. Агр2/3 комплекс был впервые обнаружен как фактор, взаимодействующий с актин-связывающим белком профилином 2, который способствует полимеризации актина. Название комплекса происходит от названия родственных актину субъединиц Агр2 и АгрЗ. Остальные 5 субъединиц (АгрС1-5) отвечают за размещение двух Агр субъединиц на точечном конце дочерних филаментов. Результаты интенсивных структурных, крио-электронно-микроскопические исследований, метода флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), а также данные по сшивке колокализованных белков позволили предположить модель, в которой нуклеация и ветвление филаментов тесно связаны с Агр2 и АгрЗ субъединицами Агр2/3 комплекса. Активаторами Агр2/3 комплекса являются факторы нуклеации (Campellone, Welch, 2010). Кроме того, были открыты несколько классов негативных регуляторов, таких как глиальный фактор созревания, коронин, гадкин и взаимодействующий с С-киназой белок (PICK1).
Вскоре после того, как Агр2/3 комплекс был выделен и охарактеризован, стало ясно, что комплекс сам по себе обладает относительно слабой активностью нуклеации in vitro. Вскоре были обнаружены клеточные кофакторы, необходимые для активации нуклеации и ветвления с помощью Агр2/3 комплекса. Обнаруженные факторы, промотирующие нуклеацию актина, можно разделить на два субкласса (Rotty et al., 2013):
1) Промотирующие факторы 1-го типа характеризуются наличием VCA-домена (=WH2), гомологичного кофилину домена (центральный домен) и кислый домен, состоящий из трех консервативных мотивов, позволяющих связываться с G-актином и Агр2/3. К факторам данного типа относят WASP семейство белков (WAVE; также известное как SCAR), белок Wiskott-Aldrich синдрома (WASP), нейральный WASP (N-WASP), WASP и SCAR гомолог (WASH) и junction-mediating and regulatory (JMY) белок.
2) Промотирующие факторы 2-го типа, такие как кортактин, характеризуются отсутствием полного VCA-домена, но наличием кислого домена на амино-конце, который связывается с Агр2/3 комплексом, а также доменами - тандемными повторами, которые связываются с F-актином. Arp2/3 комплекс собирается и активируется на мембранах факторами, промотирующими нуклеацию, которые представлены белком WASP в сайтах клатрин-актин - опосредованного эндоцитоза и WAVE в ламеллиподии. В присутствии Arp2/3 комплекса, G-актина и предсуществующих актиновых филаментов промотирующие факторы катализируют нуклеацию и образование ветвящихся сетей филаментов (Рис.5), а затем последовательно вовлекаются дополнительные регуляторные белки.
Активность Arp2/3 комплекса может регулироваться и через функциональные взаимодействия с актин-связывающими белками, такими как кеппирующий белок, который промотирует Arp2/3 -зависимую нуклеацию филаментов.
Формины известны как регуляторы актиновой динамики, участвующие в сборке неветвящихся актиновых филаментов (Рис.5). У млекопитающих известно 15 изоформ формина. Общим свойством этих мультидоменных белков является наличие домена форминовой гомологии FH2 (Higgs and Peterson, 2005), который определяет структурные свойства этого семейства и отвечает за большинство эффектов, связанных с актином. Ключевое функциональное свойство данного домена – димеризация. Для всех известных форминов FH2 домен связывается с оперенным концом актинового филамента и продвигается процессивно по мере удлинения этого конца филамента. Это свойство, по-видимому, определяет три эффекта: ускорение полимеризации, изменение соотношения скоростей элонгации и деполимеризации, а также защиту от кеппирования (Higgs, Peterson, 2005). Было показано, что образование филоподий в клетках может происходить при участии mDia2 (Peng et al, 2003; Pellegrin and Mellor, 2005). При сравнении биохимических свойств трех форминов млекопитающих FRL1, mDia1 и mDia2 оказалось, что димерные FH2-содержащие конструкты mDia2 и FRL1 прочно связываются с боковыми частями актиновых филаментов и организуют филаменты в пучки, а mDia1 такими свойствами не обладает (Harris et al., 2006). При этом не наблюдалось количественных отличий при образование пучков филаментов из скелетного мышечного и немышечного актинов. В качестве немышечного актина в экспериментах по полимеризации in vitro использовался фаллоидин-связывающий пул из тромбоцитарного актина.
Сигналы, ведущие к стимуляции клеточной подвижности, часто коррелируют с повышением активности кофилина, тогда как факторы, ингибирующие клеточную подвижность, как правило, вызывают фосфорилирование, т.е. дезактивацию кофилина (Des Marais et al., 2005; Bamburg, 1999). Кофилин играет очень важную роль в динамике актинового цитоскелета: он разрезает филаменты актина, поставляя субстрат для образования ветвящихся актиновых филаментов с помощью Arp2/3-комплекса, а также помогает деполимеризации F-актина, приводя к циркуляции актиновых мономеров и их высвобождению для дальнейшей полимеризации на ведущем крае клетки (Des Marais et al., 2005; Svitkina, Borisy, 1999; Ichetovkin et al., 2002; Bamburg, 1999; Bamburg et al.,1999; Carlier et al.,1997; Lappalainen, Drubin, 1997; Moon, Drubin, 1995). Для опухолевых клеток линии MTC (Sidani et al., 2007) и фибробластов (Dawe et al., 2003) было показано, что кофилин контролирует направленность клеточного движения. Как было показано на клетках рака шейки матки HeLa и нормальных гладкомышечных клетках сосудов VSMC, АФК вызывают активацию кофилина, приводящую к усилению миграции клеток (Kim et al., 2009; Lee et al., 2006; Lee et al., 2008). Значительное повышение активации кофилина через АФК сигналинг коррелирует с повышением локализации Arp2/3 на ведущем крае клетки, увеличением количества свободных растущих концов актиновых филаментов, а также ускорением ретроградного тока в ламеллиподии (Delorme et al., 2007; Taulet et al., 2012). Напротив, ингибирование АФК блокирует полимеризацию актина и редуцирует ретроградный ток в конусах роста нейронов (Munnamalai et al., 2009). Тонкая пространственно-временная регуляция активности кофилина, а также его концентрация на ведущем крае необходима для миграционной активности клетки (Andrianantoandro, Pollard, 2006; Ghosh et al., 2004). В исследованиях in vitro было показано, что активный кофилин при низких концентрациях фрагментирует актиновые филаменты; при более высоких концентрациях – кооперативно связывается с актиновыми филаментами, не вызывая их фрагментации, а при очень высоких концентрациях индуцирует нуклеацию, которая приводит к сборке актиновых филаментов (Andrianantoandro, Pollard, 2006).
Фазово-контрастная и интерференционно-отражательная микроскопия
В основе инвазии и метастазирования опухолевых клеток лежит ЭМП III типа, в процессе которого клетки теряют характеристики, присущие эпителиальным клеткам (выраженная базо-апикальная полярность, адгезионные и плотные контакты), приобретают подвижный мезенхимо-подобный фенотип и способность к деградации базальной мембраны. В процесс развития и распространения опухолей вовлечены рецепторные тирозинкиназы. Они способны активировать клеточные функции, регулирующие инвазивный фенотип, такие как разрушение межклеточной адгезии, протеолиз внеклеточного матрикса и миграцию. ЭМП вызывается разнообразными факторами роста и цитокинами (EGFR, TGFp, FGF). Взаимодействие между TGFp и ERK1/2 сигнальными каскадами индуцирует ЭМП и инвазию эпителиальных опухолей (Janda et al., 2002; Whyte et al., 2009). Было показано, что TGFp регулирует функции клеток не только через Smad, но и при помощи других сигнальных путей, включая МАРК, NF-kB и PI3/AKT сигналлинг (Whyte et al., 2009; Massaque, 2000; Massaque et al., 2010). Активация ERK важна для разных реорганизаций в клетке, ведущих к ЭМП, включая дестабилизацию адгезионных контактов, увеличение активности матриксных металлопротеиназ, изменение актиновых стресс-фибрилл и приобретение инвазивных свойств (Reddy et al., 2003). ERK, активируемая TGFp, регулирует экспрессию генов, важных для подвижности клеток и взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом. Динамика и регуляция актинового цитоскелета играют определяющую роль в миграции клеток. ERK1/2 сигналлинг может активировать киназу лёгкой цепи миозина MLCK, что приводит к повышенному фосфорилированию и усилению миграции клеток (Huang et al., 2004). Было показано, что ERK1/2 - индуцированная миграция может быть блокирована ингибированием активности MLCK (Reddy et al., 2003). ERK1/2 и MLCK в миграции, вызванной повышенной экспрессией EGFR, играют роль в регуляции ранних стадий метастазирования. Протеинкиназа C и Rho ГТФ-аза, действующая через ROCK, в большей степени способствуют поддержанию этого процесса (Reddy et al., 2003).
Тирозинкиназные рецепторы из семейства ErbB/EGFR - основной тип рецепторов, передающих сигналы к ERK1/2. Во многих опухолях они гиперэкспрессируются (амплификация гена ErbB2 обнаруживается в 20-30% опухолей (Navolanic et al., 2003)) или постоянно активированы. Ряд лигандов, включая EGF, амфирегулин, херегулин, связывают EGFR, вызывают его димеризацию, активируют киназную активность, что приводит к активации ERK1/2 и PI3K-AKT пути (Whyte et al., 2009). EGFR может вызвать пролиферацию, уменьшить степень апоптоза и оказать воздействие на выживаемость и подвижность клетки. В ряде культур клеток гиперпролиферация осуществляется при посредничестве EGFR, ErbB-зависимого ERK1/2 сигналинга. ErbB сигналлинг также способствует выживаемости клеток. В культуре клеток MCF-7 (аденокарциномы молочной железы) ErbB2 через ERK1/2 индуцирует экспрессию белков сурвивина и Bcl-2, предотвращающих апоптоз (Siddiqa et al., 2008). В неопухолевых MCF10A клетках повышенная экспрессия ErbB2 через активацию ERK1/2 индуцирует апоптоз. EGFR-ERK1/2 сигналлинг вызывает активацию MMP9. В MCF10A и в ряде линий опухолевых клеток активация или повышенная экспрессия ErbB2 усиливает клеточный рост, инициирует образование опухоли через активацию ERK1/2 и повышенную экспрессию MMP9. Было показано, что для активации ERK1/2 посредством таких факторов роста, как инсулиноподобный фактор роста IGF-1, эндотелиальный фактор роста VEGF, необходим EGFR. Прямое воздействие ERK1/2 на прогрессию опухоли было показано на клетках, пересаженных в жировую ткань. ERK1/2 фосфорилировал и вызывал деградацию белка FOXO3a, подавляющего опухолевый рост (Whyte et al., 2009). Т.о., была выявлена прямая взаимосвязь между активацией EGFR/ErbB, индукцией ERK1/2, повышенной пролиферацией, выживаемостью и инвазией. ERK1/2 также вовлечён в регуляцию выживаемости клеток во время миграции. Есть данные, что ERK1/2 ингибирует апоптоз, вызванный ответом на такие сигналы, как гипоксия, недостаток факторов роста и химиотерапевтические агенты (Reddy et al., 2003). 12.3. Окислительный стресс, MAP-киназные сигнальные пути и ЭМП
В процессе окислительного фосфорилирования и других клеточных процессов, связанных с переносом электронов, образуются реакционно-способные метаболиты кислорода, которые называют активными формами кислорода (АФК). Физиологическая роль АФК важна при модуляции передачи сигнала, экспрессии генов, пролиферации и других клеточных функций. Нормальное содержание АФК поддерживается антиоксидантными системами защиты. Клетка попадает в состояние окислительного стресса, когда АФК, генерируемые в клетке или во внеклеточной среде, превосходят антиоксидантные системы защиты, что приводит к окислительным повреждениям ДНК, липидов и белков. Показано, что длительно поддерживаемый окислительный стресс может вызвать ЭМП (Cannito et al., 2010; Wu, 2006). Известно, что гипоксия-оксигенация вызывает ЭМП в клетках опухоли через генерацию ROS (Cannito et al., 2008). Было показано, что мутации в митохондриальной ДНК способствуют метастазированию через генерацию митохондриальных АФК. Инвазия и метастазирование связаны с повышенными уровнями HIF-la. Клетки с мутациями митохондриальной NADH дегидрогеназы имели высокий уровень экспрессии EGF и HIF-la, приводящий к метастазированию. Такой уровень экспрессии вызывала повышенная продукция АФК. EGF посредством обратной связи увеличивал экспрессию митохондрильных АФК и, в конечном итоге, общее содержание АФК в цитоплазме клетки. EGF значительно усиливает миграцию опухолевых клеток через активацию Racl ГТФазы. Сигнальные роли АФК в мезенхимально-подобном движении опухолевых клеток, вероятно, включают в себя помимо регуляции генов (индукция HIF-la, подавление экспрессии Е-кадгерина, экспрессия NF-kB, АР-1 и ММР) ещё и прямую модуляцию цитоскелетной динамики (Binker et al., 2009).
Биохимическая характеристика ФК-ассоциированных белков
Наши биохимические эксперименты продемонстрировали встраивание винкулина, паксиллина, и a-SMA в нерастворимую детергентом белковую фракцию, что означает при суперсозревании ФК формируется стабильная связь между цитоскелетом и ЕСМ. Данный феномен, возможно, усиливает клеточную жесткость. В процессе формирования суперзрелых ФК происходит образование пучков ED-A FN фибрилл и их соединение с концами актиновых стресс-фибрилл. Наши данные согласуются с моделью тензин-зависимой транслокации FN рецептора из ФК вдоль фибриллярных контактов (Pankov et al., 2000) для инициации FN фибриллогенеза. Согласно этой модели, ФК являются менее динамичными, чем фибриллярные адгезии. Это предположение было подтверждено в экспериментах по ковалентному связыванию FN с субстратом, в результате чего клетки формировали только «классические» ФК (Katz et al., 2000). Из этого следует, что в условиях наших экспериментов фибриллярные адгезии могли отсутствовать по причине повышенной стабильности экстраклеточного матрикса.
Ранее предполагалось (Liao et al., 1999), что специфические аминокислотные последовательности вовлечены в функциональную активность ED-A FN. Кроме того, было показано, что ED-A FN домен способствует интегрин - опосредованной клеточной адгезии (Manabe et al., 1997). Эксперименты in vitro показали, что ED-A фрагмент способствует образованию открытой конформации FN молекулы, тем самым конкурируя с сайтом связывания, вовлеченным во внутримолекулярную упаковку. В процессе этих пространственных изменений открываются важные адгезионные участки (Johnson et al., 1999). В соответствии с этими наблюдениями, мы показали, что рекомбинантный фрагмент rED-A связывается с FN фибриллами (возможно, натянутыми) и ингибирует образование суперзрелых ФК. Ингибитор актомиозиновых взаимодействий уменьшает соединение rED-A и FN.
Роль р38 в полимеризации FN и модуляции миофибробластов
Существуют сильные и очевидные доказательства того, что МАРК сигнальный путь играет важную роль в клеточном ответе на механический стресс (Engel et al., 1999). В данной части работы мы показали, что миофибробластная модуляция требует активации р38, т.к. специфический ингибитор этой части МАРК сигнального каскада SB203580 ингибирует как экспрессию a-SMA, так и ED-A FN. Эти результаты согласуются с результатами ранее опубликованной работы, показывающей, что активация р38 необходима для TGFp-индуцируемой транскрипции FN мРНК (Kucich et al., 2000). Более того, мы показали, что ингибирование р38 редуцирует полимеризацию FN фибробластами. Очевидно, что для FN полимеризации требуется клеточная сократимость (Zhong et al., 1998), и экспрессия a-SMA играет роль в этом эффекте.
Равновесие натяжения, определяемого актомиозиновым цитоскелетом, и устойчивостью внеклеточного матрикса в суперзрелых ФК
Ранее было показано (Bershadsky et al., 1996; Chrzanowska-Wodnicka, Burridge, 1996; Pletjushkina et al., 1998), что актомиозиновая сократимость клетки играет важную роль в преобразовании инициальных контактов в зрелые ФК. Подобным образом, увеличение цитоскелетного натяжения необходимо для сборки суперзрелых ФК. Мы показали, что натяжение (контрактильность) возрастает при повышении количества сшивок в FN матриксе. Фрагмент rED-A дезорганизует сеть FN у поверхности фибробласта и ингибирует образование суперзрелых ФК. Предполагается, что механическая устойчивость FN сети клетки к натяжению этом контексте, в работе Choquet (Choquet et al., 1997) было показано, что покрытые фибронектином бусины, помещенные на дорзальную поверхность фибробластов, отвечают на приложенную силу натяжения локальным натяжением связанного с ними цитоскелета. Вероятно, возрастающая устойчивость сети FN, связанной с поверхностью клетки, приводит к усилению связей между цитоскелетом и экстраклеточным матриксом. Это предположение было подтверждено данными о том, что фибробласты образуют более длинные и стабильные контакты на твердом субстрате, чем на гибком (Pelham, Wang, 1997). В наших экспериментах ингибирование суперсозревания ФК было вызвано инкубацией с рекомбинантным фрагментом rED-A или редукцией актомиозиновой контрактильности (Рис. 2.20 - схема). Таким образом, конечная стадия созревания ФК определяется равновесием актомиозинового натяжения и устойчивостью ЕСМ. Была показана роль миофибробластов в продукции изометрического натяжения как внутри грануляционной ткани in vivo, так и в условиях культивирования (Serini and Gabbiani, 1999). Это натяжение создает необходимое напряжение в месте ФК, который является связующим звеном между клеткой и ЕСМ. Мы показали, что при стимуляции TGF3 ФК приобретают морфологические и биохимические свойства, которые позволяют им лучше передавать натяжение от клетки к ЕСМ и обратно. Наши результаты вносят вклад в лучшее понимание механизма, с помощью которого миофибробласт продуцирует и поддерживает сократимость при заживлении ран и фибросократимых заболеваниях. Кроме того, полученные данные могут быть использованы при планировании фармакологических стратегий, учитывая динамику этих патологических заболеваний.
В основе способности клеток к делению, движению, генерации натяжения и сократимости и поддержанию формы лежат специализированные актин-содержащие структуры. В образовании и функционировании систем актинового цитоскелета принимают участие ABPs. Некоторые ABPs связываются с актиновыми филаментами, образуя сократимые пучки (стресс - фибриллы), другие - связаны с ветвящимися сетями или принимают участие в заякоривании филаментов на плазматической мембране (Winder and Ayscough, 2005).
В этой части работы была исследована внутриклеточная локализация 3- и y-CYAs в неподвижных (покоящихся) клетках и на различных моделях распластывания, миграции, деления и сократимости. Для исследования были вновь получены и тщательно отобраны высокоспецифичные mAbs к изоформам актина. Для изучения возможных сигнальных путей, контролирующих разную организацию - и -CYAs, были использованы селективные ингибиторы малых ГТФаз семейства Rho, путей нуклеации актина и др.
Для исследования функциональных ролей р- и y-CYAs был применен метод малых интерферирующих РНК для избирательного уменьшения экспрессии изоформ. Особое внимание было уделено изучению реорганизации - и -CYAs при неопластической трансформации в различных экспериментальных системах.
Соотношение между сегрегацией актиновых изоформ и актомиозиновой сократимостью
Вероятность того, что цитоплазматические изоформы актина выполняют различные биологические функции, долгое время была под вопросом, несмотря на очевидные предположения о функциональной специфичности мышечных изоформ (Chaponnier, Gabbiani, 2004; Lambrechts et al., 2004). Результаты, представленные в нашей работе, были получены с помощью одновременной специфической иммунодетекции - и -CYA в одной и той же клетке. Впервые было продемонстрировано, что эти изоформы сегрегированны в цитоплазме мезенхимальных и эпителиальных клеток в состоянии покоя, а также при движении и делении. Более того, селективное уменьшение экспрессии этих изоформ с помощью малых интерферирующих РНК показало, что каждая изоформа различным образом принимает участие в организации клеточной морфологии, полярности и подвижности. Два типа структур, которые образуют актиновые филаменты, т.е. пучки и ветвящиеся сети, были ранее охарактеризованы в немышечных клетках с помощью электронной микроскопии (Abercrombie et al., 1971; Small, 1981; Svitkina et al., 1995) и специальных методик иммунодетекции (Svitkina, Borisy, 1999). Пучки микрофиламентов представлены в клетках в виде стресс-фибрилл, филоподий, сократимых колец и структур межклеточных контактных комплексов, в то время как ветвящиеся филаменты формируют кортикальные и ламеллярные/ламеллиподиальные сети (Chhabra, Higgs, 2007; Revenu et al., 2004; Winder, Ayscough, 2005). Наши результаты показывают, что каждая из систем микрофиламентов характеризуется преобладанием одной из изоформ актина: р CYA в пучках и y-CYA в ветвящихся филаментах (Рис.3.27). Селективное распределение наблюдалось во всех изученных типах нормальных немышечных клеток, что указывает на
Схема распределения Р" и y-CYA в подвижном фибробласте. Два цитоплазматических актина организованы в различные структуры: y-CYA в ветвящуюся кортикальную и ламеллярную сеть; /?-CYA в неветвящиеся филаментозные структуры в стресс-фибриллах; /?- и у-CYA колокализованы в ламеллиподии (желтый).
Наши данные частично противоречат более ранним публикациям, в которых экспрессия -CYA обнаруживалась, в основном, на ведущем крае клеток (Gimona et al., 1994; Hoock et al., 1991), а соответствующая мРНК локализовалась в ламелле, проксимально от ламеллиподии, где предположительно имеет место новая трансляция (Kislauskis et al., 1994). Хорошо известно, что доступность эпитопа в высокой степени зависит от условий фиксации-пермеабилизации, что может помочь объяснить некоторые противоречия. После тестирования многочисленных способов фиксации, мы выбрали последовательную фиксацию параформальдегидом и метанолом, что, в результате, привело к регулярному и сильному выявлению -CYA стресс-фибрилл в дополнение к ранее описанной локализации на ведущем крае после фиксации параформальдегидом и пермеабилизации тритоном Х-100. Коммерчески доступные mAbs к -CYA после фиксации параформальдегидом и метанолом вместо параформальдегида и тритона окрашивали стресс-фибриллы подобно нашим антителам. Полученные результаты, впервые выявляющие очевидное включение -CYA в пучки микрофиламентов, продемонстрировали лучшие условия детекции N-концевого эпитопа изоформы актина после фиксации параформальдегидом и метанолом. В соответствии с полученными результатами иммунофлуоресцентных изучений находятся и данные по выявлению локализации -CYA с помощью экспрессии флуоресцентного белка, в котором зеленый или красный флуоресцентный белок находился на С-конце молекулы для сохранения специфичности изоформы. Важно отметить, что p-CYA-GFP встраивается в стресс-фибриллы (Рис.3.16). Для -CYA описанная выше фиксация также является оптимальной, что было подтверждено сравнением различных методов фиксации, а также локализацией экзогенного флуоресцентного белка.
В отличие от -CYA (Gimona et al., 1994; Hoock et al., 1991), распределение -CYA в эпителиальных и мезенхимальных клетках не было ранее описано. Получение новых специфических mAbs позволило провести данное исследование. В лаборатории Эрвасти, где также были получены mAbs к -CYA, было показано, что в клетках скелетных мышц -CYA локализуется в костамере (Hanft et al., 2006). Такая субмембранная компартментализация коррелирует с нашими результатами, показывающими, что дорзальные кортикальные сети состоят, в основном, из y-CYA.
Таким образом, было получено и представлено несколько экспериментальных доказательств, подтверждающих различное распределение цитоплазматических актинов в нормальных немышечных клетках:
1) Эксперименты с использованием малых интерферирующих РНК показали, что в p-CYA-дефицитных клетках сильно редуцировано содержание стресс-фибрилл, тогда как y-CYA-дефицитные клетки не образуют ламеллиподиальные протрузии.
2) Формирование стресс-фибрилл и ламеллиподий регулируется малыми ГТФ-связывающими белками RhoA и Racl, соответственно (Ridley, Hall, 1992; Ridley et al., 1992). Мы показали, что селективные ингибиторы RhoA-киназы и Racl специфически воздействуют на распределение - и -CYA. Интересно отметить, что сайт синтеза -актина, по-видимому, является Rho, а не Rac или Cdc42-зависимым (Latham et al., 2001).
3) Мы также показали, что системы - и -CYA филаментов обладают дифференцированной реакцией на агенты, деполимеризующие актин (цитохалазин Д, CD, и латрункулин А, LatA), при использовании данных веществ в минимальных концентрациях в процессе реорганизации актиновых систем. Предположение о различной чувствительности кортикального актина, по сравнению со стресс-фибриллами, к этим веществам высказывали ранее (Lunn et al., 2000). Тот факт, что цитохалазин Д, кэппируя растущие концы актиновых филаментов (Spector et al., 1989), приводит к деполимеризации стресс-фибрилл, является сильным аргументом в пользу -CYA полимеризации в стресс-фибриллы. С другой стороны, LatA через изоляцию мономерного актина (Spector et al., 1989), по-видимому селективно ингибирует образование -CYA сети, что может означать необходимость этого пула мономерного актина для формирования ветвящихся филаментов.
4) Было обнаружено, что специфический маркер ламеллиподий (белок р34Агс, один из членов семейства белков Агр2/3) колокализован на ведущем крае с -CYA, тогда как р-CYA колокализован с белком VASP в сайтах инициации полимеризации актина.
Важным свойством клеток, связанным с организацией актина, является клеточная полярность, которую можно охарактеризовать как асимметрия клеточной формы, распределения белков и клеточной активности (Yeaman et al., 1999). В эпителиальных клетках плазматическая мембрана и цитоскелетные белки организованы в апикальные и базо-латеральные домены, которые обладают структурными и функциональными отличиями (Nelson, 2003; Yeaman et al., 1999). Наши результаты показали, что в эпителиальных клетках р- и у- CYA сегрегированы в базо-латеральный и апикальный домены, соответственно (Рис.3.28).
