Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Индуцирование множественной овуляции у коров и телок-доноров 18-98
3.1.1. Влияние дозы гонадотропина на уровень суперовуляции и качество эмбрионов 33-41
3.1.2. Влияние серии гонадотропина (СЖК) на уровень множественной овуляции и качество зародышей. 41-46
3.1.3. Влияние дня обработки гонадотропином на уровень суперовуляции и качество зародышей 46-50
3.1.4. Влияние сезона года на уровень суперовуляции и качество зародышей 50-55
3.1.5. Влияние витаминов "А" и йодистого калия на эффективность гормонального вызывания суперовуляции и качество зародышей 56-66
3.1.6. Влияние гонадотропин рилизинг-гормона на уровень суперовуляции и качество эмбрионов 66-71
3.1.7. Синхронизация охоты у доноров и реципиентов. 71-78
3.1.8. Повторные гормональные обработки с целью вызывания полиовуляции у коров-доноров 78-83
3.1.9. Использование высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов 83-90
3.1.10. Технология осеменения коров и телок-доноров с множественной овуляцией 91-94
Глава 2. Методы и результаты извлечения шбрионов у коров и тепок-доноров 99-137
4.2.1. Хирургические методы извлечения эмбрионов 100-111
4.2.2. Нехирургическая техника получения эмбрионов 112-І37
Глава 3. Методы и результаты пересадки зародышей крупного рогатого скота 137-209
5.3.1. Оценка качества зародышей при трансплантации 138-170
5.3.2. Хирургические методы пересадки зародышей 171-180
5.3.3. Методы и результаты трансцервикальной пересадки зародышей 180-201
5.3.4. Применение метода эмбриопересадок с целью получения двоен 201-209
Глава 4. Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота 210-283
6.4.1. Механизм процесса замораживания эмбрионов . 211-216
6.4.2. Механизм процесса оттаивания эмбрионов . 216-218
6.4.3. Криопротекторы при замораживании эмбрионов. 218-238
6.4.4. Подготовка эмбрионов к замораживанию . 239-243
6.4.5. Криотехника для глубокого замораживания эмбрионов 243-251
6.4.6. Режим замораживания, оттаивания эмбрионов и результаты пересадки 251-283
Выводы и предложения 320-324
Список литературы 325-368
- Влияние дозы гонадотропина на уровень суперовуляции и качество эмбрионов
- Влияние гонадотропин рилизинг-гормона на уровень суперовуляции и качество эмбрионов
- Хирургические методы извлечения эмбрионов
- Оценка качества зародышей при трансплантации
Введение к работе
В Постановлении ЦК КПСС о проекте к ХХУІ съезду Коммунистической партии Советского Союза "Основные направления экономического и социального развития СССР на I98I-I985 гг. и на период до 1990 года" определена неотложная необходимость повышения уровня селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных качеств животных, создания новых высокопродуктивных пород, линий и гибридов скота, отвечающих требованиям промышленной технологии.
Среди поставленных задач наиболее важной и актуальной является ускорение темпов воспроизводства животных желательного типа, полученных от высокопродуктивных коров, осемененных спермой выдающихся быков, проверенных по качеству потомства.
В решении данной задачи существенным резервом является генофонд коров-рекордисток. Между тем, традиционные методы воспроизводства выдающихся по продуктивности животных не позволяют обеспечить желаемого влияния их на большие популяции племенного и поль-зовательного скота.
С этой целью в последнее десятилетие разрабатывается, а в ряде стран доведен до возможности практического использования новый метод воспроизведения крупного рогатого скота, связанный с трансплантацией зародышей.
Метод трансплантации эмбрионов в практической селекции может быть использован:
- для быстрого и широкого распространения редких и исчезающих пород;
- для ускоренного создания высокопродуктивных селекционных стад;
- для интенсификации размножения маточного поголовья путем пересадки зародышей известного пола;
- для увеличения выхода телят путем пересадки двух зародышей с целью получения двоен;
- для ускоренного создания выдающихся семейств коров-рекордисток в целях использования их как матерей будущих быков-родоначальников линий;
- для создания банка эмбрионов и накопления генетического материала с последующей транспортировкой и пересадкой их в запланированных стадах.
В ряде стран мира (США., Канада, Австралия и др.) ведется жесткий отбор коров-матерей будущих быков. Этих коров используют в качестве доноров зародышей. Эффективность отбора как коров, так и быков зависит от двух факторов: точности и интенсивности. Точность отбора быков при оценке по качеству потомства можно увеличить до очень высоких показателей путем увеличения числа потомков, например, до 100 при точности 93%. При этом задача состоит в повышении интенсивности селекции, поскольку оценка большого количества быков - дело дорогостоящее.
С коровами - наоборот: легко выбрать одну корову из тысячи или десятка тысяч, но очень трудно точно отобрать. Если отбор проводится по удою, продукции жира или белка, точность отбора по первой лактации составит 50%, по второй - 58%, по третьей - 51% и по четвертой - 63%, Если для получения быков использовать в стаде 3% коров и их потенциал плодовитости увеличить в 5 раз, то даже в этом случае эффект улучшения больших популяций высокопродуктивного скота достигнет 47% (188, 148, 128, 282).
Поэтому ускоренное получение выдающихся быков-производителей, способных быть улучшателями,при создании селекционных стад - это важнейший выход в практику селекции метода трансплантации зароды - 6 шей.
При интенсивном использовании коров на фермах и комплексах промышленного типа ежегодно до 30% животных выбраковывается из основного стада по целому ряду причин. Среди этих коров находятся и очень ценные животные. Метод трансплантации зародышей и в этом случае может дать неоценимую пользу, так как позволяет от таких генетически ценных животных получать высокоценных потомков. При этом, если учесть, что от одного донора можно получать зародыши 4-5 раз в год, очевидна реальная возможность уже на современном этапе развития метода трансплантации иметь от коровы-рекордистки не менее 10-12 телят-аналогов (58),
Даже при такой сравнительно небольшой интенсивности использования выдающейся по продуктивности коровы в качестве донора зародышей, всего лишь за два года от нее можно заложить высокоценное семейство и иметь достаточное количество племенных быков.
Несложные расчеты показывают, что только по результатам одного года, используя 20 коров-рекордисток в качестве доноров эмбрионов, можно с помощью метода трансплантации создать высокопродуктивное селекционное молочное стадо коров численностью не менее 100 голов с уровнем продуктивности, определяемым составом коров-доноров. При этом госплемстанции по оценке быков могут быть пополнены таким же количеством высокоценных в племенном отношении ремонтных животных. Обычным путем от такого количества коров-рекордисток за указанный срок можно получить не более 10 телок и 10 быков.
В последнее десятилетие уделяется много внимания пересадке зародышей крупного рогатого скота как средству повышения темпов воспроизводства и ускорения генетического прогресса, а также как одному из фундаментальных биологических методов исследования воспроизводительной функции у животных. Группы животных-аналогов,
- 7 близких по своей наследственности, полученные методом трансплантации, представляют исключительную ценность и позволяют более конкретно анализировать проблемы физиологии, биохимии, генетики, иммунологии воспроизводства, изучать влияние генетических и кормовых факторов на эмбриональное развитие зародыша, определять причины гибели эмбрионов в предимплантационный и имплантационный периоды.
Однако, несмотря на достигнутые успехи в разработке новых приемов гормонального вызывания множественной овуляции у коров-доноров, техники извлечения и пересадки зародышей, совершенно очевидно, что, используя традиционную двух- или трехступенчатую схему (извлечение-трансплантация, извлечение-глубокое замораживание, трансплантация зародышей) этого метода, и в обозримом будущем будут определенные затруднения как в количестве, так и в качестве материала, необходимого для получения большого количества животных,
В связи с этим во многих странах мира и в нашей стране развернуты широкие исследования по культивированию фолликулярных ово-цитов и оплодотворению их вне организма, а также по клонированию зародышей крупного рогатого скота.
Главным направлением совершенствования метода трансплантации является разработка новых способов, обеспечивающих получение наибольшего количества полноценных зародышей с желательным генотипом как за счет вызывания множественной овуляции, так и путем культивирования фолликулярных ооцитов вне организма.
Большое значение приобретают транспортировка и создание банка замороженных зародышей. Создание банка зародышей выведет сам метод трансплантации на реальную основу внедрения в практику животноводства, так как только законсервированные зародыши позволят подбирать спонтанных реципиентов, синхронных по эстральному циклу с
- 8 возрастом зародышей и проводить пересадку их непосредственно в хозяйствах.
На данном этапе разработки метода трансплантации зародышей наиболее важным звеном в этой проблеме является индуцирование множественной овуляции у коров и телок-доноров, определяющим получение достаточного количества зародышей, пригодных для пересадки.
В настоящее время в большинстве случаев вызывание множественной овуляции осуществляется путем инъекции гонадотропина (СЖК) на 8-12-й день полового цикла в дозе 3600-4000 и.е. для коров в сочетании с простагландинами. Одним из недостатков этого способа является высокая степень вариабельности в числе овуляций.
Известные способы вызывания множественной овуляции не дают возможности получать суперовуляцию у 30$ коров, а индуцирование высокой степени множественной овуляции не обеспечивает достаточного выхода нормальных зародышей. При этом снижается индекс оплодо-творяемости доноров и яйцеклеток, увеличивается число дегенериро-ванных зародышей.
Вызывание высокого уровня множественной овуляции (более 10 овуляций на каждый яичник) еще не означает получение достаточного количества зародышей, пригодных для пересадки. Последнее также зависит от биотехники извлечения зародышей у доноров.
В Советском Союзе и в других странах мира с целью увеличения выхода телят пробуют индуцировать двойни путем вызывания двойневой овуляции с помощью гонадотропных гормонов. Первостепенное значение при многоплодной стельности под влиянием гонадотропинов имеет ограничение числа развивающихся плодов до двух, кроме отдельных случаев, но этот процесс не контролируется.
Коровы, имеющие три и более плодов, обычно абортируют раньше пятого месяца стельности, у них отмечаются преждевременные отелы, или они приносят потомство с высокой смертностью в родовой и послеродовой периоды.
В отличие от этого, наиболее регулируемый метод индуцирования двоен может быть достигнут путем пересадки двух зародышей, по одному в каждый рог матки, либо подсадка второго зародыша осемененному реципиенту в рог матки без желтого тела в яичнике.
Результаты отдельных исследований показали, что хирургической пересадкой двух зародышей можно получить высокий процент двойневых стельностей (310, 342, 343, 261, 77, 193). Однако большинство экспериментов было проведено на небольшом числе животных, а результаты были учтены по убою на 30-45-й день после пересадки. Поскольку результаты получены за короткий отрезок стельности, трудно сделать выводы об уровне двойневой стельности и эффективности билатеральной пересадки двух зародышей.
Данный метод нуждается в дальнейшем усовершенствовании и разработке соответствующих приемов аппликации двух зародышей хирургическим и нехирургическим методами. Пересадка двух зародышей или подсадка второго зародыша осемененным животным может быть перспективным методом в деле повышения выхода телят при достаточно внимательном подборе реципиентов и позволяет рассчитывать на высокий процент стельности индуцированной пересадкой.
Большую актуальность и практическую значимость в исследованиях по трансплантации имеют вопросы оценки жизнеспособности зародышей, так как от качества их, в основном, зависит успех пересадки. Вместе с тем, морфологические критерии остаются недостаточно изученными и малодоступными для практического использования их в оценке зародышей.
В условиях пересадки свежих зародышей необходимо немедленное определение их качества по морфологическим признакам. Поэтому в
- 10 проблеме трансплантации придается исключительно важное значение разработке тестов быстрой и объективной оценки зародышей по морфо-функциональным показателям их развития к моменту пересадки. Разработка объективных критериев оценки эмбрионов даст возможность значительно повысить эффективность метода трансплантации.
Одним из главных факторов перевода метода трансплантации зародышей крупного рогатого скота на практическую основу является разработка методов длительного их консервирования, которые упростят подбор по половому циклу реципиентов с донорами, позволят осуществлять транспортировку на дальние расстояния и вести пересадку зародышей в запланированных стадах, а также проводить тестирование родительских пар на продуктивность, наследственные заболевания и другие.
Данные литературы показывают, что уже в настоящее время имеется возможность получать за один половой цикл по 4-5 полноценных зародышей от высокопродуктивных коров-доноров и индуцировать стельность у реципиентов (362, 169, 182).
Однако ряд вопросов, связанных с совершенствованием метода трансплантации зародышей, остаются нерешенными и требуют технической доработки и научного обоснования. К таким относятся: надежное вызывание полиовуляции, низкотемпературное криоконсервирование зародышей, нехирургическое извлечение и аппликация зародышей реципиентам. Вместе с тем, уже сейчас имеется возможность реально ставить задачи и намечать пути их решения по проблеме эмбриогенетики, исходя из накопленных данных по научно-обоснованному подбору родительских пар, что позволит получать зародыши и после пересадки -молодняк с желательным генотипом.
Дальнейшее совершенствование метода, наряду с применением современных достижений генетики, эмбриологии и эндокринологии, по - II зволит в ближайшей перспективе разработать комплексный метод ускоренного создания семейств, типов, линий и селекционных стад высокопродуктивного скота, пригодного к интенсивному использованию на фермах и комплексах промышленного типа.
Цель и задачи исследований. Метод трансплантации зародышей сельскохозяйственных животных, преимущественно у крупного рогатого скота, уже вошел в арсенал средств управления функцией размножения. Однако в биотехнике трансплантации еще много недостатков и нерешенных вопросов, что значительно сдерживает его широкое использование.
К числу нерешенных вопросов следует прежде всего отнести методы вызывания множественной овуляции у коров-доноров. Высокая вариабельность, непредсказуемость реакции яичников на гормональные препараты, проявление отрицательных факторов (отсутствие оплодо-творяемости яйцеклеток, наличие персистирующих и гемморагических фолликулов, высокого процента дегенерированных зародышей и др.) делает известные методы весьма ненадежными и рискованными, особенно при использовании неочищенного нативного гонадотропина.
Все еще остается несовершенной техника извлечения и пересадки зародышей, отсутствует также надежная аппаратура, хотя за последние годы в этом направлении достигнуты определенные успехи.
Пока еще недостаточно объективных критериев ранней морфологической оценки жизнеспособности зародышей перед пересадкой и замораживанием. Кроме того, несмотря на то, что в настоящее время уже получено несколько телят после пересадки замороженно-оттаянных зародышей, технология замораживания их очень трудоемка, а жизнеспособность зародышей после оттаивания и пересадки низкая. Необходимы еще значительные усилия для совершенствования методики, изыскания новых, более эффективных криопротекторов, состава сред, уточнения режима замораживания и оттаивания, и транспортировка зародышей на дальние расстояния.
Осуществление транспортировки зародышей тесно связано с улучшением способов хранения и техники пересадки. Вопросы, связанные с поддержанием жизнеспособности зародышей, являются определяющими.
Разработка простой технологии получения двоен у крупного рогатого скота может иметь большое значение для увеличения производства мяса. Основой дальнейшего развития направления - получение двойневости крупного рогатого скота - будет метод трансплантации зародышей и совершенствование техники ее проведения.
В связи с изложенными наших исследованиях поставлены следующие задачи:
1. Усовершенствовать существующие и разработать новые методы индуцирования множественной овуляции у коров и телок-доноров с использованием отечественных гормональных препаратов. Изучить факторы, влияющие на уровень суперовуляции, оплодотворяемость яйцеклеток и качество зародышей.
2. Разработать методы хирургического и нехирургического извлечения и пересадки зародышей у коров и телок. Сконструировать специальные приспособления и приборы для этих целей.
3. Изучить возможность билатеральной хирургической и нехирургической аппликации зародышей коровам и телкам-реципиентам для целей повышения эффективности воспроизводства телят.
4. На основе анализа собственного материала и известных данных литературы определить наиболее объективные тесты морфологической оценки жизнеспособности зародышей, обеспечивающие максимальный процент стельности от пересадки свежеполученных, культивированных и замороженно-оттаянных зародышей.
5. Разработать технологию глубокого замораживания, длительного хранения зародышей крупного рогатого скота и изучить возможность дальней транспортировки и пересадки их в условиях ферм хирургическим и нехирургическим методами. Сконструировать специальную аппаратуру и приспособления для этих целей.
6. Одной из методических задач было усовершенствование, применительно к конкретным условиям, метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота с использованием отечественных реактивов, питательных сред, приборов и приспособлений, а также животных отечественных пород.
Поставленные задачи решали путем длительных экспериментов на коровах и телках черно-пестрой породы опытного хозяйства "Щапово" Московской области. Эксперименты по оценке эффективности различных доз и серий гонадотропина, схем гормонального вызывания полиовуляции проведены в нескольких повторностях на 970 животных, хирургическому и нехирургическому извлечению и пересадке эмбрионов -на 1291 коровах и телках, оценка качества эмбрионов по морфологическим признакам - на 2082 зародышах, криоконсервирование и оттаивание - на 712 эмбрионах.
Влияние сезона года, дня гормональной обработки, возраста животных на уровень полиовуляций, оплодотворяемость яйцеклеток и качество эмбрионов - на 566 донорах, эффективность простагландинов для синхронизации охоты - на 701 животном.
Научная новизна. Разработаны новые методы вызывания множественной овуляции у коров и телок-доноров. Сконструированы и успешно используются приборы и приспособления к ним для хирургического и нехирургического извлечения и пересадки. Разработана методика морфологической оценки жизнеспособности и кратковременного хранения эмбрионов. Изучено влияние возраста доноров, сезона года, дня гормональной обработки, дозы и типа гонадотропина на уровень суперовуляции, оплодотворяемость яйцеклеток, качество эмбрионов и эффективность эмбриопересадок, методика составления и приготовления сред для вымывания и кратковременного хранения эмбрионов. Внесены новые технологические и технические решения в режим замораживания и оттаивания, кратковременного и длительного хранения эмбрионов, транспортировки на дальние расстояния и пересадки их в условиях ферм. Сконструированы полуавтоматический программный за-мораживатель, устройство и приспособления для обеспечения режимов охлаждения и оттаивания, размещения пробирок и соломинок с эмбрионами при хранении их в жидком азоте. Впервые, в нашей стране, осуществлена дальняя транспортировка свежих и замороженных эмбрионов и пересадка их в условиях ферм. Использование зарубежного опыта и результатов собственных исследований позволило решить ряд вопросов трансплантации эмбрионов на качественно новом, более высоком научном и техническом уровнях. Новизна исследований подтверждена пятью авторскими свидетельствами.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований» Важнейшим выходом метода трансплантации в практику селекции животных является получение достаточного числа однотипных потомков от высокопродуктивных коров, а также получение быков-производителей, способных быть улучшателями при создании селекционных стад. Разработаны методы повышения эффективности гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров эмбрионов, для центров и пунктов, занимающихся трансплантацией, которые обеспечивают индуцирование суперовуляции у 83,9$ коров, получение эмбрионов - у 89,5% животных при числе овуляции от 7,7 до 13,9 и выходе нормальных эмбрионов в среднем 3,9 на донора. Большую практическую значимость имеет разработанная методика оценки качества и кратковремен - 15 ного хранения эмбрионов.
Разработанные методические и технологические условия пересадки 2-х зародышей или пересадки одного зародыша осемененному реципиенту позволяют получать высокий процент стельности и отел двойнями до 50$.
Сконструированный программный полуавтоматический заморажива-тель обеспечивает высокую точность режима охлаждения и оттаивания эмбрионов.
Разработанный метод криоконсервирования зародышей в жидком азоте имеет важное практическое значение и позволяет применять метод трансплантации наиболее эффективно и с минимальными затратами. Так, отпадает необходимость в содержании стада реципиентов, появляется возможность создания банка зародышей от высокопродуктивных, редких и исчезающих пород животных и широко осуществлять транспортировку зародышей на любые расстояния.
Возможность с большей эффективностью использовать увеличение репродуктивных свойств коров-доноров, благодаря гормональному вызыванию полиовуляции и контролю некоторых факторов во всей технологии трансплантации эмбрионов, является значительным потенциалом в проведении научных исследований.
Полученные результаты использованы в инструкции по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота МСХ СССР и в семи методических рекомендациях ВИЖа.
Влияние дозы гонадотропина на уровень суперовуляции и качество эмбрионов
Аналогичные результаты получили у телок мясных пород - в среднем 16,2 овуляций и 8,9 оплодотворенных яйцеклеток (165). После повторных обработок гонадотропином индекс суперовуляции почти не изменяется, но значительно снижается число извлеченных зародышей по сравнению с первой обработкой. В дальнейшем процент извлеченных зародышей не меняется. Так, по данным Uf&-CfvtMtct и др.-(132), у 14 телок суперовуляцию вызывали и извлекали зародыши 5-Ю раз подряд с интервалом в среднем 42 дня. В конце опыта 13 из 14 телок были осеменены и стали стельными.
Несколько другие данные были получены в исследованиях &. N&w-Сопъё (270). Для определения влияния дозы и серии гонадотропина телок подвергали двум последовательным обработкам. При первой обработке использовали однократную инъекцию (Ж в дозе 1000 или 2000 и.е. на 9, 10, II или 12 день после эструса. Через 48 часов после этого вводили простагландин в дозе 1000 мкг. Животных осеменяли свежеразбавленным семенем. Вторая обработка была осуществлена в среднем через 51,0+2,4 день. В результате было установлено, что доза СЖК вызывала значительное увеличение числа овуляций и остаточных фолликулов. Количество овуляций после второй обработки было намного меньше, чем при первой обработке.
Суперовуляция и извлечение эмбрионов между двумя стельностя-ми не оказывают отрицательного влияния на воспроизводительную способность животных и не происходит удлинения сервис-периода при использовании ЮГ (182).
По данным 7Ї &-(/& (173), индекс овуляции при первой обработке составил 9,4+1,8 и второй В опытах %?. С/ьи иг и др. (134) многократное введение 2000 и.е. гонадотропина в комбинации с простагландином через каждые б недель в течение года удерживало овуляцию на одном и том же уровне у 29,8% коров, снижало число овуляций после 3-5 обработок у 27,7%, после снижения наблюдался подъем числа овуляций у 36,2% коров. Ж.&апас хиГо, (201) при использовании 2000 и.е, ГСЖК получено в среднем после первой обработки 15,6, после второй - 11,3 овуляций на каждого донора. При увеличении дозы ГСЖК до 2500-3000 и.е. уровень реакции яичников снизился до 6,6 овуляций после первой обработки и до 9,6 - после второй (201), Несмотря на общую тенденцию снижения числа желтых тел, с уве личением числа обработок отмечены значительные индивидуальные ко лебания в числе овуляций при всех обработках. Вероятно, повторные инъекции гонадотропина не у всех животных вызывают образование желтых тел на ГСЖК, которые инактивируют его действие. и др. (328) в течение одного года на НО коро вах изучали влияние гормональных обработок на качество получаемы эмбрионов и установили, что процент дегенерированных зародышей на 6-8-й день после осеменения повышался незначительно с увеличением дозы СЖК с 2500 и.е. (32,5$) до 3000 и.е. (31,0$). Уровень овуляции не влиял на качество эмбрионов, У коров с множественной овуляцией, в яичниках которых были только желтые тела, наблюдалось значительно больше дегенерированных зародышей, чем у коров, у которых кроме желтых тел были неовулировавшие фолликулы (44,6 против 26,8$), Таким образом, техника вызывания множественной овуляции в той технологии, в которой она сейчас применяется, в значительной мере еще несовершенна, так как число реагирующих животных, оплодотворенных яйцеклеток на донора вариабельно. Наряду со значительными колебаниями в числе овуляций на одну и ту же дозу СЖК, прослеживается четкая зависимость уровня овуляции от дозы гонадотропина. По мнению отдельных аторов (210), одной из причин неудовлетворительной суперовуляции при применении ГСЖК является несоответствие в соотношении в ней ФСГ к ЛГ-активности для нормального роста и развития фолликулов в яичниках коров и телок-доноров. Как известно, соотношение ЮГ к ЛГ-активности в различных сериях ГСЖК может варьировать в заметных пределах (17), и это обстоятельство является значительным препятствием в точной стандартизации фолликулостимулирующей активности этого гонадотропина. Поэтому в настоящее время все шире применяют для вызывания множественной овуляции у коров и телок очищенные гипофизарные препараты ЮГ. Так, например, очищенный гипофизарный экстракт ЮГ свиней вызывает более точную регуляцию суперовуляции у коров по сравнению с ГСЖК (92). Однако и в этом случае не исключается индивидуальная вариабельность в уровне суперовуляции. Индивидуальные различия в реакции яичников коров на ЮГ, вероятно, могут быть обусловлены колебаниями в уровнях эндогенных гонадотропних и половых гормонов. По-видимому, множественная овуляция у животных сопровождается проявлением комплекса физиологических явлений, отличающихся от таковых при спонтанной овуляции в период естественного полового цикла, что снижает оплодотворяемость яйцеклеток и выход полноценных эмбрионов, пригодных для пересадки. Отмечено заметное изменение в уровне содержания половых гормонов в крови коров после суперовуляции (339, НО, 37), что может быть одной из причин нарушения продвижения яйцеклеток в половых путях (93) и дегенерации зародышей вследствие изменения условий среды в яйцеводах и матке (190). В связи с этим разработка оптимальных схем гормонального вызывания суперовуляции должна, вероятно, основываться на данных изменения уровня гонадотропних и половых гормонов у предварительно отобранных коров и телок для использования их в качестве доноров.
Влияние гонадотропин рилизинг-гормона на уровень суперовуляции и качество эмбрионов
Первые сообщения об успешном применении нехирургического метода извлечения эмбрионов у коров-доноров были сделаны 2.йА-@оиґ-ьп и др. {304) ,.&. & & %- и др. (141). Основываясь на этих работах, ряд исследователей усовершенствовали и предложили инструменты для этих целей (356, 143, 148). Хотя результаты, полученные авторами были обнадеживающими, однако они, по сравнению с хирургическим методом, были значительно хуже.
В исследованиях Л.А.&оА&г и др. (86) было испытано два типа инструментов: жесткий, состоящий из двух металлических трубок, вставленных одна в другую с двумя отверстиями на верхушке и гибкий трехканальный, напоминающий катетер Фоллея. Было получено соответственно 37% и 46% зародышей от общего числа овуляций, или в среднем 3,1 и 2,9 на каждого донора.
Более совершенную модификацию приспособлений для трансцерви-кального извлечения зародышей применил ? Ой.і и др. (278). Был сконструирован жесткий металлический катетер из трубки нержавеющей стали с внешним диаметром 4 мм и внутренним - 2 мм, длиной 50 см с надувным баллончиком на конце катетера. Такая конструкция катетера обеспечивала 100%-ное прохождение канала шейки матки у коров, а также у крупных телок. Процент извлечения зародышей от числа овуляций составил 56,4, или в среднем по 6,5 эмбрионов на каждого донора.
Биотехнический метод бескровного получения эмбрионов должен быть простым и надежным, позволяющим получать эмбрионы в условиях ферм с высокой результативностью. С учетом Q SQVO U oUl /zei (212) предложил каучуковый двухканальный катетер длиной 52 см в виде плотного шланга с отверстиями для введения и выведения жидкости. Катетер имеет металлический наконечник с 4-мя отверстиями и заканчивается шаровидной формой, что обеспечивало прохождение канала шейки матки и уменьшало травмирование слизистой. Для придания жесткости в полость катетера вставляется металлический упругий стилет. В результате этим катетером от 54 коров и телок-доноров было извлечено в среднем по 6,7 зародыша.
Большинство исследователей (У.ЖоА/ъ и др., 184) отдают предпочтение резиновым катетерам, которые, по их мнению, наиболее удобны и дают возможность получать от 4 до 6 эмбрионов, пригодных к пересадке. Однако катетеры такой конструкции иногда бывает трудно провести через цервикалькый канал. Даже после прохождения шейки матки встречаются затруднения в проведении его глубоко в рог матки и контролировать состояние баллончика. Тем не менее, резиновые катетеры имеют свои определенные преимущества перед жесткими металлическими катетерами. При использовании их снижается вероятность повреждения эндометрия. Жесткий катетер позволяет сравнительно легко проникнуть в канал шейки матки, но также и легко можно повредить эндометрий. При этом в промывную среду попадает кровь, что затрудняет поиск эмбрионов.
М.И.Прокофьев и др. (38) модифицировали металлический жесткий катетер, который состоит из трубки нержавеющей стали и съемного гибкого наконечника из пластика с несколькими отверстиями. Для придания жесткости съемному пластиковому наконечнику вовнутрь трубки вводится упругий стальной стилет. При использовании такой конструкции катетера процент удаления введенной среды составлял 93-96%, а уровень извлечения эмбрионов от числа овуляций - 56,6%. Таким прибором от 12 коров и 10 телок было в среднем извлечено по 6,2 и 6,4 зародыша на донора.
Применение модифицированного резинового катетера в опытах &. 5-cki&na и др. (327) обеспечивало получение 51,1$ нормальных эмбрионов от числа овуляций. .Яг&с- и др. (91) получили в среднем по 2%Ь\ТХіпаш и др. (278) - 63%; ГіШе (173) от 40 часто перегуливающих коров - 41%, или по 2,4 эмбриона на донора.
Наиболее подходящей конструкцией оказался прибор л/.о.абесА (292), который состоит из металлического цилиндра диаметром 5 мм и длиной 49,5 см. Вовнутрь цилиндра с помощью специального крючка проводится катетер Фоллея № 14, в верхушке которого сделано 4 отверстия, и в него же вставляется открытая металлическая упругая спираль диаметром 2,5 мм и длиной 5,5-6,0 см. К наружному концу катетера Фоллея прикрепляется три конца пластиковых трубок с двумя двухходовыми краниками для регулирования введения и оттока промывной жидкости. Для придания верхушке катетера упругости вставляется жесткий металлический стилет. Упругая спираль предохраняет от проникновения стилета через боковые отверстия верхушки катетера и стабилизирует рабочую часть верхушки после удаления стилета. Общая длина прибора - 60 см (рис. 3).
Введение прибора в рог матки осуществляется по общему принципу. После расположения катетера в роге матки стилет удаляют и в баллон нагнетают воздух; к катетеру присоединяется система шлангов с двумя 60 мл шприцами. Один из них предназначен для нагнетания, второй - для отсасывания жидкости.
Хирургические методы извлечения эмбрионов
До настоящего времени нет четких критериев оценки качества пересаживаемых зародышей. Морфологическое определение состояния зародышей является частичным методом комплексной оценки. Ее целью является отбор неоплодотворенных яйцеклеток и определение стадии развития зародышей, а также выявление повреждений отдельных блас-томеров или всего зародыша Решающее значение в оценке качества пересаживаемых зародышей имеет, конечно, их жизненность, проверяемая. Нормальное развитие, заканчивающееся рождением нового организма, является окончательным свидетельством полноценности испытуемого зародыша.
Однако в условиях проведения операций по пересадке зародышей требуется определять жизнеспособность сиюминутно и исключительно по морфологическим признакам. При этом учитывают следующие основные морфологические признаки полноценности зародышей: целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность перивителлино-вого пространства, целостность зоны пеллюцида, соответствие стадий развития возрасту зародыша.
В некоторых последних работах, проведенных на сельскохозяйственных животных, была сделана попытка классифицировать качество зародышей. (126) предложили 5-балльную шкалу оценки качества ранних зародышей крупного рогатого скота. Нарастание баллов соответствует повышению их качества, при этом принимаются во внимание компактность расположения клеток зародыша, симметричность, плотность соединения бластомеров.
Для определения жизнеспособности зародышей применяются следующие методы: а) визуальная морфологическая оценка; б) прижизненное окрашивание; в) культивирование вне организма; г) цитологическая и патогенетическая оценка. Наиболее распространенным методом является визуальная морфологическая оценка под микроскопом в проходящем свете или через фазовый контраст.
Показатели морфологической оценки исключительно важны, поскольку видимая морфологическая разнокачественность является выражением внутренней скрытой физической, биологической и физиологической неравноценности зародышей.
Особенно важное значение при морфологической оценке придается колебаниям объема зародыша, их форме, целостности, состоянию прозрачной оболочки и протоплазмы. Полноценными считаются такие зародыши, которые имеют правильную шарообразную форму, гомогенную светлую протоплазму, целостную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомери с определенным характером их расположения (плотность межклеточных контактов) Они должны соответствовать по уровню дробления возрасту от оплодотворения до извлечения.
Неполноценными считаются зародыши с неравномерными по величине бластомерами, лизисом протоплазмы, отсутствием прозрачной оболочки, отставанием в дроблении. Критерий - уровень дробления -особенно важен, потому что отставание в темпах дробления в 90$ случаев свидетельствует о начальных этапах дегенерации зародыша. При оценке по морфологическим показателям поздних зародышей не всегда удается точно определить их полноценность из-за наличия большого числа клеток (морула, бластоциста). Например, крайне сложно визуально отличить партеногенетически дробящиеся яйцеклетки или эмбрионы с фрагментацией протоплазмы от нормальных поздних моруя. Предложено несколько методик проверки полноценности зародышей путем окрашивания: например, синькой Эванса (121), эозином (26), нейтральным красным (97),метиленовой синью (9). Предлагаемые методы прижизненного окрашивания ранних зародышей основаны на свойстве красителей проникать через прозрачную оболочку и окрашивать протоплазму погибающих или погибших клеток. Однако методы прижизненного окрашивания из-за низкой результативности не нашли пока широкого применения. Нередко, зародыши, отнесенные по окраске к полноценным, оказывались впоследствии де-генерированными. Возможно, это связано с неблагоприятным действием на зародыш самого красителя. Определение качества зародышей путем культивирования Си i/cbw - очень трудоемкий и сложный метод, требующий соблюдения полной стерильности. Культивирование зародышей проводят в капле питательной среды, помещенной в пластиковые чашки под слоем минерального масла с определенной газовой средой. Зародыши, проявившие признаки деления в течение 24-48 часов, считаются жизнеспособными. При культивировании темпы развития зародышей несколько замедляются и за непродолжительный срок (24-48 часов) не все потенциально жизнеспособные клетки успевают разделиться. Кроме того, условия вне организма не вполне соответствуют индивидуальной потребности развивающихся зародышей, и вследствие этого часть их может прекратить деление. Существуют также методы определения качества зародышей на фиксированных препаратах. Ценность этих методов состоит в том, что они позволяют выявить тонкие особенности основных структур (цитоплазма, ядро), определяющих биологическую ценность любой клетки. Кроме того, с помощью этих методов можно в ряде случаев установить причины гибели зародышей. В настоящее время широко используется метод тотальных препаратов и воздушно-сухой метод получения хромосомных препаратов (357, 358), которые позволяют оценить состояние основных структур зародышей, а также состояние хроматина в интерфаэных ядрах блае-томеров. Цитологический и цитогенетический анализ ранних зародышей можно использовать для подсчета точного количества бластомеров по числу ядер, для выявления аномалий кариотипа и отдельных хромосом, для изучения целого ряда вопросов биологии размножения, например, формирования гамет и закономерностей процесса оплодотворения, исследования причин эмбриональной смертности. Но эти методы не применимы для изучения зародышей, предназначенных для трансплантации.
В целом ни один из существующих ныне методов определения полноценности и жизнеспособности зародышей не является универсальным. Поэтому, по мнению многих исследователей, работающих в области пересадки зародышей, возникает необходимость выбора адекватных биохимических и биофизических параметров для прижизненной диагностики полноценности и жизнеспособности зародышей.
Оценка качества зародышей при трансплантации
В более ранних исследованиях ХАЛ іїои/доіг и др. (307) получили 3 стельности у трех реципиентов из 14. Стельность у одного реципиента завершилась абортом на 60 дне. Общая стельность после пересадки зародышей составила 14$. При этом зародыши находились в среде с добавлением сыворотки крупного рогатого скота,и после пересадки их в рога матки через цервикальный канал нагнетали газ С0. Однако3. Зге&ігсць и др. (340, 341),применяя аналогичную методику пересадки, не получили стельности ни у одного из восьми реципиентов.
В опытах Jteeruui (345) была применена простая методика пересадки зародышей с помощью инструментов для искусственного осеменения длиной 45 см, в который вкладывалась пайетта сечением 0,25 см с эмбрионом. При пересадке соблюдались обычные меры предосторожности в отношении асептики. В опыте было 8 телок-реципиентов, которые были убиты через 40-42 дня после пересадки, стельными оказались 4 (50%). У четырех телок повторная охота была зарегистрирована через 18-20 дней и при убое не было обнаружено признаков инфекции.
В 70-х годах японские исследователи провели ряд работ по совершенствованию нехирургической техники пересадки зародышей. Так, и др. (356) сообщили о трансцервикальной пересадке 83 зародышей 68 реципиентам, из них 17 стали стельными и у 12 (18%) родились нормальные телята. Причиной низкой результативности при использовании японской или кэмбриджской техники явилось, по-видимому, изменение рН среды матки вследствие введения С0.
Большинство сообщений относительно применения нехирургической техники пересадки зародышей крупного рогатого скота свидетельствует о низкой результативности этого метода. Кроме того, данная техника включает ряд сложных манипуляций, такие как введение COg в полость матки или использование приборов для введения зародыша через влагалище в обход шейки матки (354, 307).
При нехирургической пересадке зародышей ЬІЛ Цо/Ль&к (291) использовал три типа металлических катетеров. Один из них приспособлен для введения зародыша до середины, другой - до верхушки рога матки, третий - универсальный, обеспечивающий введение зародыша в любой участок рога матки. Было пересажено 33 зародыша 33 телкам-реципиентам, десять из них оказались стельными (31%).
Полученные результаты оказались ниже, чем в исследованиях Л.(Р жсцга и др. (106), в которых б осемененным коровам-реципиентам было подсажено по I зародышу. Стельными оказались 6 коров и 5 из них растелились двойнями. Авторы пришли к выводу, что высокая чувствительность матки к инфекции в лютеальную фазу и ее повышенная физиологическая активность, вероятно, не являются причинами низкой приживляемости зародышей при нехирургической пересадке.
Для выяснения причин неудовлетворительных результатов при нехирургической пересадке У.&.О&ШЛС и др. (331) осеменили 51 телку. В строго асептических условиях 25 телкам вводили в рога матки специальные приспособления через систему катетеров, чтобы имитировать стельность. Из 26 контрольных телок стали стельными от первого осеменения 54$, а из 25 с ложными пересадками - 48$. Ложная пересадка через цервикальный канал не влияла на результаты осеменения. На основании этого сделано предположение, что основной причиной низкой результативности нехирургической пересадки,является занесение инфекции, а не особенность метода.
Высокие результаты стельности от хирургической пересадки в рог матки на стороне желтого тела в яичнике, вероятно, не влияют на приживляемость зародышей, пересаженных в контрлатеральный рог матки трансцервикальным методом. Трудно объяснить причины плохой выживаемости нехирургически пересаженных зародышей. При этом способе зародыши редко помещаются далее середины рога, тогда как при хирургической пересадке их помещают вблизи верхушки рога матки.
По данным Я-диыКИъ и др. (346) nll.Neufcomi и др. (268), место аппликации зародыша в матке имеет весьма существенное значение, что, возможно, и является причиной неудовлетворительных результатов. Однако многие исследователи считают, что усиление мио-метральной подвижности матки, яйцеводов и яичников является главной причиной неудач при трансцервикальной пересадке эмбрионов (163).
В связи с этим возникли новые теории относительно подвижности генитальных органов самки. Подвижность матки обусловлена тремя факторами: сокращением мышечных волокон и стромы матки; сокращением маточных связок и локальными вариациями кровотока. Подвижность маточной стромы и мышечных волокон матки значительно варьирует в течение эстрального цикла: максимальная - во время эстру-са и в 4-5 раз снижается в лютеальную фазу. Матка чрезвычайно быстро изменяет чувствительность к химическим и механическим факторам. Менее чем за 48 часов действие окситоцина на матку может меняться от I до 100 сокращений (314),
Механические раздражения стенки матки вызывают аналогичные вариации в реакции. Поэтому при нехирургической пересадке зародышей надо избегать чрезмерно медленного и слишком быстрого введения инструмента в рог матки (177).
В исследованиях б- Уш/Ыъ и др. (177) пересадку зародышей осуществляли после инъекции препарата изокеупринлактат (изодрин), понижающего сократительную деятельность матки. При этом уровень стельности достигал 40%.
В опытах R.Nzu/слть и др. (269) было проведено сравнительное изучение выживаемости зародышей при одновременной пересадке их хирургическим и трансцервикальным методами. Зародыши в возрасте 7 дней пересаживали хирургическим методом в рог матки с желтым телом в яичнике, нехирургическим - контрлатеральный рог. Выживаемость зародышей составила соответственно 85 и 35%. После нехирургической пересадки в рог матки с желтым телом в яичнике и хирургической в контрлатеральный, выживаемость зародышей составила 20 и 30% соответственно. Нехирургическая пересадка в контрлатеральный рог не ухудшала результаты хирургической пересадки.
Из сообщений других исследователей после нехирургической пересадки в рог матки с желтым телом в яичнике стельность составляла от 31 до 60% (170, 120, 350) и от 24 до 40% при нехирургической пересадке в контрлатеральный рог предварительно осемененным реципиентам (351). Однако приведенные результаты стельности были получены при убое животных на 30-42-й день после пересадки, что не отражает полностью результативность нехирургического метода пересадки.
Похожие диссертации на Методы получения, пересадка и криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота
