Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 4
1.1. Морфологическая и функциональная характеристика эмбрионов 9
1.1.1. Морфологические особенности эмбрионов, извлекаемых от проблемных коров-доноров 9
1.1.2. Влияние различных факторов процесса фолликулогенеза, созревания яйцеклеток, оплодотворения и раннего эмбриогенеза на жизнеспособность эмбрионов 11
1.1.3. Эмбриональная смертность 17
1.2. Технология криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота 21
1.2.1. Физико-химические принципы криоконсервирования и процесса оттаивания эмбрионов 22
1.2.2. Криопротекторы 25
1.2.3. Подготовка эмбрионов к замораживанию 28
1.2.3.1. Оценка жизнеспособности эмбрионов 28
1.2.3.2. Кратковременное хранение эмбрионов 29
1.2.4. Криотехника 31
1.2.5. Режимы замораживания и оттаивания эмбрионов 32
1.2.6. Оценка жизнеспособности эмбрионов после криоконсервирования 33
1.2.6.1. Культивирование эмбрионов 33
2. Собственные исследования 37
2.1. Материалы и методика 37
2.2. Результаты собственных исследований 46
2.2.1. Сравнительная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности 46
2.2.2. Эффективность различных способов криоконсервирования эмбрионов 53
2.2.2.1. Жизнеспособность эмбрионов при криоконсервировании в зависимости от продолжительности промежуточного хранения, типа и концентрации криопротектора 53
2.2.2.2. Влияние различных режимов замораживания на качество эмбрионов 57
2.2.2.3. Эффективность технологических элементов криоконсервирования эмбрионов, полученных от коров с различным физиологическим статусом 63
2.2.3. Оценка жизнеспособности эмбрионов после оттаивания 67
2.2.4. Жизнеспособность оттаянных эмбрионов после трансплантации и пути её повышения 73
3.Обсуждение 81
Выводы 89
Практические предложения 90
Библиографический список 91
Приложения 105
- Влияние различных факторов процесса фолликулогенеза, созревания яйцеклеток, оплодотворения и раннего эмбриогенеза на жизнеспособность эмбрионов
- Культивирование эмбрионов
- Сравнительная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности
- Эффективность технологических элементов криоконсервирования эмбрионов, полученных от коров с различным физиологическим статусом
Введение к работе
Актуальной проблемой современного животноводства является увеличение производства молока и мяса как наиболее полноценных продуктов питания. В то же время молочное скотоводство характеризуют как сокращением общего поголовья, так и негативными структурными изменениями, которые не только снижают возможности увеличения производства молока, но и сохранения его на прежнем уровне. Поэтому отечественная экономика диктует необходимость интенсификации селекционной работы с целью ускоренного создания пород, линий, семейств животных для формирования оптимальной структуры совокупного стада крупного рогатого скота, отвечающей потребностям постоянно меняющейся конъюнктуры рынка. В этих условиях придают большое значение мероприятиям по организации процесса воспроизводства поголовья на основе биотехнических методов, позволяющих реально планировать биологические процессы с учётом организационных, технических, морально-экономических и других обстоятельств (47, 22). Без продолжения исследований в области технологии эмбриотрансплантации, которая дополняет метод искусственного осеменения и одновременной реализации достижений в практике селекционной работы решить проблему не представляется возможным (49, 50,12).
Эта точка зрения нашла отражение в концепции развития животноводства страны до 2010 года, одобренной коллегией Минсельхоза РФ в 2001 г. (56).
Наибольшие успехи в области создания оптимальной структуры стада высокопродуктивного молочного скота достигнуты в США и Канаде и лидерство они удерживают в этой области благодаря внедрению в производство метода трансплантации эмбрионов. В странах Европы и Северной Америки около 70% быков-производителей, используемых для
искусственного осеменения, получены методом трансплантации эмбрионов, и доля их продолжает увеличиваться. Из 50-ти лучших быков чёрно-пёстрой породы в США, 64% получены методом трансплантации. Аналогичная картина характерна для Германии и ряда других стран (50,12).
Низкотемпературное консервирование эмбрионов сельскохозяйственных животных является важнейшим элементом технологии трансплантации эмбрионов и имеет большое практическое значение, так как позволяет обходиться без содержания большого стада потенциальных реципиентов, необходимых для пересадок свежеполученных эмбрионов, значительно упрощает экспорт и импорт эмбрионов (10).
Использование криоконсервирования даёт возможность сохранять эмбрионы от выдающихся животных, а также накапливать генофонд локальных, исчезающих пород. В исторической перспективе это может быть использовано для восстановления некоторых качеств, неизбежно теряющихся породами в процессе интенсивной селекции. Кроме того, применение данного элемента технологии позволяет решать вопросы акклиматизации пород и получения гибридов для создания адаптированных популяций в регионах с экстремальными климатическими условиями (43).
Исследования по экспериментальной эмбриологии млекопитающих вызывают не только практический, но и научный интерес (18). Репродуктивная физиология и патофизиология являются фундаментальным разделом современной биологии. В этом смысле исследования, проводимые по совершенствованию новейших биотехнических методов управления воспроизводительной функцией, относящихся к методу трансплантации эмбрионов, представляют уникальную возможность познания закономерностей сложнейших биологических процессов. Без дальнейшего углубления исследований в области технологических элементов эмбриотрансплантации не возможна реализация в практике скотоводства
результатов таких перспективных направлений как клонирование, получение тотипотентных эмбриональных стволовых клеток с генными конструкциями для создания множественных линий с генетическим разнообразием, получение трансгенных животных, элиминации нежелательных генов, решения проблем эмбриональной смертности и др.
В этих условиях современные исследования в области технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота приобретают ещё большую актуальность и значимость.
Однако, несмотря на достаточно высокий уровень разработанности технологии трансплантации эмбрионов в целом, многие её элементы требуют дальнейшего совершенствования. Определённые издержки не преодолены в таком элементе, как криоконсервирование и долгосрочное хранение эмбрионов. Приживляемость эмбрионов, оттаянных и трансплантированных после криоконсервирования снижается на 25-50% по сравнению с результатами пересадок свежеполученных эмбрионов. Снижение результативности является следствием многократных температурных перепадов, сопровождающих процесс подготовки зародышей к замораживанию и последующему оттаиванию и других выясненных и невыясненных факторов. Производство нуждается в менее трудоёмких способах. Необходим поиск новых криопротекторов и питательных сред (52).
Целью работы явились исследования жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после криоконсервирования, оттаивания и пересадки.
Для этого были определены следующие задачи:
- в сравнительном аспекте определить характерные особенности эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров;
определить эффективность различных способов криоконсервирования эмбрионов, полученных от коров-доноров с различными уровнями продуктивности;
испытать оценку жизнеспособности эмбрионов после оттаивания по морфологическим признакам и методом культивирования;
исследовать жизнеспособность оттаянных эмбрионов после пересадки;
на основе анализа полученных данных сформулировать выводы и дать предложения для практики.
Научная новизна работы заключается в том, что дана
дифференциальная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых
коров-доноров с продуктивностью до 5000 кг молока и свыше 5000 кг
молока за лактацию и проблемных коров-доноров. Данный аспект
определяет степень эффективности различных методов
криоконсервирования эмбрионов, а также способов оттаивания и оценку жизнеспособности эмбрионов после оттаивания. Определены факторы, влияющие на течение эмбриогенеза после пересадки и пути снижения эмбриональной смертности. Приоритет исследований подтверждён А.С. №1739987 СССР, А61 В 19/02, 1990 (Патент №2078549. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 мая 1997 г.).
Практическая значимость. Рекомендуемые методы
криоконсервирования эмбрионов и определение их качества после оттаивания, получаемых от высокопродуктивных здоровых и выбракованных коров, гарантируют повышение жизнеспособности эмбрионов, пригодных для трансплантации. Найдены пути снижения эмбриональной смертности. Данные факторы обеспечивают повышение
эффективности технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в целом, что, в свою очередь, позволяет существенно повысить эффективность реализации селекционно-генетического потенциала высокопродуктивных коров.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и одобрены на международных, союзных, республиканских и зональных конференциях (Москва, Львов, Харьков, Киров, Санкт-Петербург, Боровск, Брест, Минск, 1989-2002 гг.). Научно-теоретические положения и практические рекомендации сформулированные в диссертации используются в учебном процессе НГСХА. Результаты научных исследований опубликованы в 4 печатных работах.
Объем и структура.
Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 1 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений.
Список литературы включает 122 источника, в т.ч. 97 иностранных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-влияние продуктивности коров-доноров на эффективность и результаты криоконсервирования эмбрионов;
-пути повышения жизнеспособности эмбрионов после пересадок.
Влияние различных факторов процесса фолликулогенеза, созревания яйцеклеток, оплодотворения и раннего эмбриогенеза на жизнеспособность эмбрионов
Генетическое улучшение молочных пород крупного рогатого скота, благодаря целенаправленной селекции, привело к значительно возросшей молочной продуктивности. Данное обстоятельство ассоциировалось со снижением репродуктивной активности маточного поголовья (ПО). Наиболее характерное снижение норм плодовитости коррелировало с увеличением удоя, начиная с 5000 кг молока за лактацию (114, 96). Современные исследования показали, что коровы с высоким генетическим потенциалом продуктивности при нормальном чередовании волн активности фолликулярного роста и нормальных характеристиках клинических симптомов индуцированного эструса в отличие от малопродуктивных коров имеют значительное снижение процента оплодотворяемости яйцеклеток (110). В этой связи, необходимо детализировать и уточнить влияние различных экзогенных и эндогенных факторов (в т.ч. и эндокринных и метаболических сдвигов) на качество ооцитов и эмбрионов.
Проведено большое количество исследований по выяснению влияния кормления, связанных с ним эндокринных и метаболических сдвигов, на овогенез и оплодотворяемость (97, 104). Исследования на тёлках, проведённые разными исследователями в этом плане, дали разноречивые суждения. Так, ряд исследователей утверждает, что повышенные нормы кормления ведут к увеличению концентрации прогестерона (96). В противоположность, другие исследователи сообщают об отрицательной корреляции (114). Часть исследователей доказывает, что на уровень содержания прогестерона ни повышение, ни понижение кормовых норм влияния не оказывает (112). Однако детальный анализ подтверждает достоверную отрицательную корреляцию между повышением содержания в рационах сырого протеина и концентрацией прогестерона в сыворотке крови коров, потребляющих эти рационы (86), а также их репродуктивной активностью (87). Известно, что понижение концентрации прогестерона ниже определённого уровня непосредственно после осеменения отрицательно сказывается на показателе оплодотворяемости (89,102).
Было выявлено, что стандартные рационы не обусловливают отчётливых колебаний концентрации прогестерона в сосудах матки (65), в то время, как высокоэнергетические рационы обусловливают существенное возрастание локальной концентрации прогестерона и вместе с этим интенсивное развитие зародышей. Если 100% извлечённых эмбрионов от опытных групп, получивших высокоэнергетические корма, находились на стадии экспандированной бластоцисты, то в контроле (при низкоэнергетическом кормлении), лишь 20% эмбрионов были на стадии бластоцисты, а 80%) на стадии ранней морулы. Следует обратить внимание, что показатели концентрации прогестерона в периферической крови и сосудах матки на 10-ый день беременности выравниваются и это указывает на то, что качество кормления оказывает влияние на жизнеспособность зародышей только на самых ранних стадиях беременности (65, 91, 78).
Мочевину включают в рационы как источник азота для синтеза белка Рубцовыми микроорганизмами. Учитывая, что потребление организмом избыточных норм белка приводит к сокращению показателей результативности осеменений, приходят к выводу о вероятности негативного влияния на оплодотворяемость яйцеклеток избыточного содержания мочевины в кормах (99, 69) и, на этом основании, о возможности определением концентрации мочевины в плазме крови и/или в молоке оценивать качество репродуктивной активности. Имеют место сообщения о разных уровнях оптимальной концентрации мочевины в плазме. Но о конкретных значениях по этим публикациям, как о критериях, достоверно характеризующих определённое физиологическое состояние воспроизводительного статуса, судить трудно из-за большой противоречивости суждений. Так, анализ данных целого ряда серий опытов, в которых сравнивали показатели концентраций мочевины в крови стельных и нестельных коров перед осеменением, не выявил достоверных различий: 4,8±1,1 ммоль/л у стельных коров и 4,9±1,6 ммоль/л у нестельных (82). Таким образом, следовало констатировать, что по показателям концентрации мочевины в плазме крови, приходящимся на период проведения осеменений достоверно прогнозировать показатель оплодотворяемости не представляется возможным. К аналогичному выводу пришли и другие исследователи (80). В исследованиях, где анализировали результативность эмбриопересадок (в трёх группах коров средние значения концентрации мочевины в плазме крови, приходящиеся на момент трансплантации, были достоверно различны (3,2±0,1; 4,9±0,3; 7,1±0,5 ммоль/л), норма стельности для всех групп оказалась одинаковой—43,0% (80). Однако в этих же исследованиях было твёрдо установлено негативное влияние избытка мочевины и сырого протеина кормов на развитие эмбрионов, которое проявляется в отставании развития. Это позволило предположить, что первоначально высокие концентрации мочевины оказывают негативное влияние на ооциты благодаря изменению среды фолликулов и яйцепроводов и вторично—на эмбрионы, благодаря изменениям маточной среды. Увеличение нитрогенов в плазме крови достоверно коррелирует со снижением оплодотворяемости (69, 115, 118). Причём, в соответствие изменениям концентрации мочевины через интервал в несколько часов происходит обратно пропорциональное изменение рН маточной среды (73). Одновременно, увеличенные концентрации мочевины в плазме крови в результате переваривания организмом больших количеств сырого протеина препятствуют нормальному индуктивному воздействию прогестерона на среду матки. Всё это препятствует нормальному развитию эмбриона (120). В исследованиях in vitro культур эндометральных тканей показано, что изменения в матке градиента рН происходит посредством поляризации клеток и увеличения секреции простагландина F2a, что препятствует развитию эмбриона и, в конечном счёте, обусловливает потерю жизнеспособности (71). Вредное влияние повышенных концентраций мочевины на воспроизводительный статус наиболее ярко проявляется у коров отрицательным энергетическим балансом на фоне недокорма, который компенсируют добавками в рационы больших количеств компонентов, содержащих сырой протеин или мочевину (83, 77).
По ряду частных суждений в вышеизложенном, просматривается некоторая непоследовательность, однако безусловно то, что факторы кормления, обусловливающие оптимальный энергетический баланс, являются основными для предовуляторного периода и благотворно влияющими на оплодотворяемость и эмбриогенез. К настоящему времени окончательно доказано, что потребляемые с кормами питательные компоненты в зависимости от количественных соотношений определённым образом либо активизируют, либо угнетают эндокринные и метаболические процессы в организме животных. Однако до сих пор не детализирован и не вполне понятен механизм, благодаря которому эти факторы трансформируют значение показателей оплодотворяемости и жизнеспособности эмбрионов. Исследованиями in vitro были достоверно установлены параметры взаимоотношений между развивающимися ооцитами и средой созревающих фолликулов и колебаниями состава питательных сред. Данное обстоятельство инициировало проведение в этом плане экспериментов in vivo.
Культивирование эмбрионов
После оценки, клетки эмбрионов насыщают раствором глицерина или диметилсульфоксида различной концентрации двумя способами—одно- или многоступенчатым. Как показывают работы многих исследователей, более простым, но жёстким является одноступенчатый способ, который обычно используют при наличии эмбрионов отличного качества и при ограниченном времени хранения после извлечения. При этом способе эмбрионы сразу же помещают в каплю криопротектра необходимой концентрации и выдерживают в нём 15-20 мин. При использовании многоступенчатого способа эмбрионы последовательно помещают в растворы криопротектора с возрастающими концентрациями и выдерживают по несколько минут для уравновешивания осмотического давления (9).
Контроль за проводкой эмбрионов через ряд повышающихся концентраций глицерина выполняют под микроскопом в стерильном боксе при комнатной температуре (33). После выдержки в последнем растворе эмбрионы готовы к замораживанию. Эмбрионы замораживают в стеклянных пробирках, или пластиковых соломинках (паеттах). После заправки пробирку закрывают сверху фольгой, а паетты закрывают специальными пластиковыми пробками. Следует отметить, что одни исследователи предпочитают использовать пробирки, а другие паетты (28, 27).
Ёмкости с эмбрионами маркируют, все данные записывают в специальные журналы (9). Подготовленные к криоконсервированию пробирки (паетты) с эмбрионами помещают в гнездо замораживающей камеры для охлаждения по соответствующему режиму. Оттаивание эмбрионов и подготовку их к пересадке проводят следующим образом. Намеченную пробирку (паетту) с помощью длинного пинцета быстро извлекают из канистры и помещают в водяную баню с температурой 25 или 37С до момента исчезновения льда в контейнере с эмбрионами. Оттаянные эмбрионы переносят на часовое стекло в растворе криопротектора, проверяют под лупой их наличие и проводят предварительную морфологическую оценку. Затем удаляют криопротектор из эмбрионов, помещая их в подготовленные растворы убывающей концентрации. После выдержки эмбрионов в растворе криопротектора низкой концентрации их три раза промывают в свежем растворе ФСБ с добавками и помещают под микроскоп при увеличении в 100-150 раз для окончательной оценки качества (63,14, 23). Ряд исследователей считает, что морфологическая характеристика эмбрионов после криоконсервирования затруднена и не даёт точной оценки жизнеспособности, т.к. процесс криоконсервирования, низкотемпературного хранения и оттаивания накладывает специфические изменения на морфологическую структуру эмбриона. Более точно оценивать эмбрионы позволяет метод культивирования. Биологически полноценные эмбрионы при обеспечении оптимальных условий продолжают своё развитие при культивировании (58, 48,16, 6, 37). Культивирование зародышей крупного рогатого скота было освоено в 1972 г. в синтетической среде (Sintetic Oviduct Fluid), насыщенной смесью газов: 90% Н2; 5% С02 и 5% 02. В последующем, были освоены методы культивирования в средах Бринстера, Виттена, Менезо, Дюльбекко и среде ТС-199 (95). Установлено наличие взаимосвязи между стадией развития зародышей в начале культивирования и результатами пересадок: лучшую приживляемость имеют зародыши, находящиеся на более поздней стадии развития перед культивированием (105).
Как для кратковременного хранения, так и для оценки качества служит методика культивирования зародышей в яйцепроводах кролика. Зародыши культивируют в яйцепроводах до 3-4 дней, затем, перед пересадкой переносят их in vitro. Продолжительность культивирования без потери биологических потенций эмбрионов весьма различна и варьирует от 12 до 95 часов (16).
Одним из наиболее перспективных способов оценки эмбрионов после деконсервации является витальное окрашивание, при котором используются флуоресцентные красители, способные обратимо окрашивать живые объекты, не оказывая на них губительного влияния (45). Этот способ, известен под названием экспресс-метода оценки эмбрионов, так как позволяет осуществить её за 3-5 мин. Метод основан на различной степени проницаемости красителей через прозрачную оболочку живых или погибших эмбрионов. Для окрашивания используют: акридиноранж (АО); флуоресцеин диацетат (ФДА); 4,6-диалино-2-фенил-индол (ДА), 2,7-диамино-этил-ди-фенилфенантрен бромид (ЭБ), 1-анилино-нафталин-8-сульфонат (1,8-АНС). Прижизненную окраску эмбриона выполняют следующим образом. Его помещают на предметное стекло, добавляют соответствующий краситель, проводят инкубацию и исследуют под люминисцентным микроскопом (37, 6). В связи с недостаточной апробированностью данного метода, во всех сомнительных случаях культивирование остаётся на практике единственным методом подтверждения оценки качества эмбрионов по морфологическим признакам.
Сравнительная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности
Анализ результатов собственной работы в области трансплантации эмбрионов и данных литературы показывает высокую вариабельность показателей приживляемости трансплантированных эмбрионов после криоконсервирования всеми известными методами. В ряде случаев, жизнеспособность оттаянных эмбрионов может достигать величины показателей, получаемых после пересадки свежеполученных эмбрионов, т.е. до 67,0% приживляемости, но может не превышать 10,0-17,0%. В процессе проведения исследований было выявлено, что оттаянные после замораживания эмбрионы, получаемые как от здоровых, так и от проблемных высокопродуктивных коров имеют характерную особенность—низкий процент приживляемости, даже в том случае, если после извлечения они были оценены по морфологическим признакам как хорошие и отличные.
В этой связи исключительное значение имеет выяснение факторов, влияющих на жизнеспособность эмбрионов, получаемых от доноров с разным уровнем продуктивности и физиологическим статусом.
В рамках затрагиваемой проблематики мы провели исследования по определению влияния осеменения коров-доноров спермой, оттаянной двумя способами, на оплодотворяемость и эффективность выхода эмбрионов, пригодных для криоконсервации, а также влияния на эти показатели типа гонадотропина, применяемого для вызывания суперовуляции.
В опыте коров-доноров с индуцированной суперовуляцией осеменяли спермой одного и того же быка-производителя, оттаянной с применением лимоннокислого натрия и без него. Применение второго способа определяла задача испытания метода, повышающего эффективность оттаивания замороженного в гранулах семени быков-производителей и других биологических объектов, исключающих применение дефицитного лимоннокислого натрия, а также стеклянных флаконов и ампул.
Полученные данные показали, что оплодотворяемость при осеменении коров-доноров спермой, оттаянной без лимоннокислого натрия в полимерных пробирках, практически не отличалась от результативности осеменения коров спермой быков-производителей, оттаянной с лимоннокислым натрием в стеклянных ампулах (табл. 6). Обобщённый анализ исследований по морфологической оценке показал, что большая часть получаемых зародышей от здоровых коров со средней продуктивностью соответствует своему возрасту и стадии развития на день извлечения. Из общего числа свежеполученных от таких коров эмбрионов, нормальных выделено 68,9%, дегенерированных—20,8%, неоплодотворённых яйцеклеток—10,3%. От высокопродуктивных здоровых и проблемных коров нормальных эмбрионов было получено меньше на 13, 0 и 16,6% и больше дегенерированных эмбрионов—на 4,7 и 4,1%—40,3, соответственно. Оплодотворяемость яйцеклеток у среднепродуктивных коров была выше на 12,6-8,2% (табл. 7). В исследованиях по определению сравнительной эффективности гипофизарных и сывороточных гонадотропинов суперовуляцию вызывали FSH-P-PgF2a по 4-х дневной схеме и rOKK-PgF2a по 2-х дневной схеме, т.е. по схемам, которые называются классическими. В первой и второй частях опыта осеменение коров-доноров проводили спермой оттаянной с использованием и без использования раствора лимоннокислого натрия. Исследования показали, что эффективность ГСЖК несколько ниже относительно количественных показателей суперовуляторной реакции, вызываемой FSH-P (табл. 8). Однако, в обеих случаях очевидно значительное влияние физиологического состояния коров-доноров на качество эмбриопродуктивности. Количество эмбрионов, пригодных для консервирования было получено больше от здоровых коров со средней молочной продуктивностью, в то время как от высокопродуктивных коров эмбрионов отличного и хорошего качества было получено значительно.
Эффективность технологических элементов криоконсервирования эмбрионов, полученных от коров с различным физиологическим статусом
На приживляемость оттаянных эмбрионов влияют многие факторы. Наблюдаются существенные внутренние различия в выживаемости эмбрионов, полученных от разных коров-доноров. Есть доноры, дающие эмбрионы с приживляемостью до 80%. Однако, есть доноры, от которых эмбрионы даже отличного и хорошего качества дают не более 10-30%-ой приживляемости. Данное обстоятельство доказывает, что современные методы оценки жизнеспособности эмбрионов не вполне совершенны, но главное—эмбрионы, имеющие морфофункциональные отклонения, которые не определяют имеющиеся методы оценки жизнеспособности, являются производными отклонений в состоянии здоровья коров-доноров. Специальными методами установлено, что для эмбрионов проблемных коров характерны диплоидные и полиплоидные клетки, наличие аномальных кариотипов, отставание в накоплении сырой массы. В этом плане большую проблему представляют невыясненные особенности развития эмбрионов, обусловленные высокой молочной продуктивностью коров-доноров. Актуальность решения данной проблемы объясняется задачей получения наибольшего числа эмбрионов от высокопродуктивных коров для обеспечения селекционно-генетического прогресса. Специфический обмен веществ, связанный с высокой молочной продуктивностью оказывает негативное влияние не только на эмбриогенез, но и на более раннюю стадию генеративного процесса—овогенез и оплодотворение. В этой связи, большим пробелом является обстоятельство, когда испытания всех известных методов криоконсервирования проводят, как правило, с учётом оценки качества эмбрионов по морфологическим признакам, не принимая во внимание, что на современном этапе, нарушения на ультраструктурном уровне, определяемые спецификой физиологического состояния коров-доноров, этими методами не выявляются. Отсюда—значительные издержки в виде потерь значительного числа эмбрионов, причём наиболее ценных.
Принимая во внимание вышеприведённое, нами проведён комплексный анализ эффективности различных технологических элементов криоконсервирования эмбрионов с учётом физиологического статуса коров-доноров (табл. 18). Приведённый анализ убедительно доказывает, что все испытанные и описанные выше технологические элементы в большой или меньшей степени могут быть приемлемы для криоконсервирования эмбрионов, получаемых от здоровых коров со средней молочной продуктивностью. Выбор технологии в этом случае можно ставить в зависимость от тех или иных непосредственных условий проведения работ (например, условия фермы или лаборатории). В этом случае нет противопоказаний к применению упрощённых технологий.
В противоположность, для работы с эмбрионами от проблемных и здоровых высокопродуктивных коров спектр выбора технологических режимов значительно ограничен: приемлемые результаты могут быть получены только при многоступенчатом насыщении клеток эмбрионов с использованием в качестве криопротектора глицерин 1,4М концентрации. Начало многоступенчатого медленного охлаждения необходимо проводить от +20С до -38С с последующим погружением в жидкий азот для долгосрочного хранения.
Согласно общепринятым методическим рекомендациям и инструкциям по технологии эмбриотрансплантации (32, 34, 33), а также опыту собственной работы в этой области необходимо оценивать жизнеспособность эмбрионов, оттаянных после криоконсервирования. Настоящее требование аргументируется тем, что при любых режимах процесса консервирования имеет место негативное воздействие на биологические структуры жёстких факторов контрастных изменений условий окружающей эмбрион среды. При этом у определённого процента эмбрионов, подвергнутых криоконсервированию и оттаиванию неизбежно снижается степень потенциальной жизнеспособности.
В собственных исследованиях при морфологической оценке качества оттаянных эмбрионов применяли пятибальную шкалу. Эмбрионы отличного качества имели правильную округлую форму и соответствовали своей стадии развития, при хорошем качестве наблюдались незначительные нарушения (отдельные дегенерированные клетки или отклонения формы). Эмбрионы удовлетворительного качества содержали большое число дегенерированных клеток и имели сильно изменённую неправильную форму, сколы оболочек и другие дефекты. Таким образом, тот же спектр признаков качества, что и при оценке свежеполученных эмбрионов в период их подготовки к криоконсервированию (31,17).
