Введение к работе
Актуальность исследования. Род Passiflora L. - крупнейший в семействе Passifloraceae и включает 575 видов (Jorgensen et al., 2012), распространенных, главным образом, в тропиках и субтропиках Нового Света, 22 вида происходят из Юго-Восточной Азии, Австралии и Океании. Почти все пассифлоры являются травянистыми или одревесневающими лазающими лианами, 10 видов представлены кустарниками и невысокими деревьями, ещё реже среди них встречаются однолетние травы (Killip, 1938; Feuillet, MacDougal, 2007). Род богат эндемичными редкими видами (Осатро, 2010). Большой ресурсный потенциал рода Passiflora, включающего декоративные, плодовые и лекарственные виды, до настоящего времени полностью не раскрыт.
Крупные коллекционные фонды ботанических садов являются живым генным банком для выявления и отбора ресурсно-значимых видов растений, проведения биотехнологических работ в области микроклонального размножения и оздоровления, а также для длительного хранения генетического материала in vitro (Litz et. al., 2005; Черевченко и др., 2008). Сегодня микроклональное размножение разработано для небольшого числа видов и сортов пассифлор (Faria, Segura, 1997; Alexandre et. al, 2008; Pinto et. al, 2010; Paikrao et. al, 2012), в том числе, для плодовых сортов P. edulis Sims и красивоцветущих сортов P. 'Guglielmo Betto', P. 'Manta', P. x allardii Lynch, (Pipino et. al, 2008, Braglia et. al, 2009; Pipino et. al, 2010). Основные трудности введения в культуру in vitro связаны с сильной эндофитной контаминацией первичных эксплантов. Поиск приемов, позволяющих уменьшить заражение материнских растений и добиться стабильной стерильной культуры, является ключом к успешному культивированию и длительному хранению in vitro полезных и редких видов пассифлор.
В оранжерейных условиях также имеется ряд трудностей, связанных с поддержанием стабильной культуры пассифлор. Это, прежде всего, отсутствие устойчивости большинства видов к галловым нематодам. Разработка экологически приемлемых методов борьбы с этим вредителем без использования пестицидов (прививка на устойчивые к галловой нематоде подвои) является одним из биотехнологических приемов защиты растений, что особенно актуально в условиях защищенного грунта.
В коллекционных фондах Главного ботанического сада РАН в настоящее время представлены 16 из 17 секций пассифлор (Kirillov, 2013), что даёт возможность использовать коллекционные растения для проведения таксономических исследований. Молекулярно-филогенетические работы, опубликованных за последние 10 лет (Muschner et. al, 2003; Yockteng, Nadot, 2003; Hansen et. al, 2006; Paikrao et. al., 2010; Muschneret. al., 2012), с высокой степенью поддержки показали моно фил етично сть рода и подтвердили его
деление на четыре подрода. Однако отношения на уровне отдельных секций и серий всё ещё остаются неясными.
Цель и задачи. Целью исследования является создание устойчивой культуры видов рода Passiflora L. in vitro и in vivo с использованием живого коллекционного фонда.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
-
Разработка протоколов клонального микроразмножения ресурсных видов.
-
Изучение влияние подвоя на степень эндофитной контаминации интактных растений.
-
Оптимизация биорегуляторов для разработки протоколов микроклонирования.
-
Проведение скрининга видов и сортов пассифлор на устойчивость к галловой нематоде с отбором устойчивых форм и оптимизацией прививочных технологий.
-
Уточнение внутриродовых отношений с использованием высоко вариабельного межгенного спейсера trnH-psbA на основе изучения коллекционного материала.
-
Создание крупнейшей на территории России коллекции видов и сортов представителей рода Passiflora в условиях защищенного грунта и выявление связи между таксономической принадлежностью и устойчивостью к галловой нематоде.
Научная новизна. Установлено, что в роде Passiflora прививка на устойчивые подвои - эффективный способ понижения эндофитной контаминации в культуре in vitro. Впервые получены данные о степени резистентности 65 видов и двух сортов пассифлор к южной галловой нематоде Meloidogyne incognita Kofoid et White и выявлены резистентные особи 9 видов. Впервые проведён филогенетический анализ таксонов рода Passiflora на основе межгенного спейсера trnH-psbA участка хпДНК, включивший 42 вида. Показано, что подрод Passiflora разделяется на две монофилетические группы. В первую входят секции Stipulata Feuillet & J. М. MacDougal, Tacsonia (Juss.) Feuillet & J. M. MacDougal и Calapathanthus Harms, во вторую Tiliifolia Feuillet & J. M. MacDougal, Coccinea Feuillet & J. M. MacDougal, Passiflora, Laurifolia Killip ex Cervi и Quadrangularis Feuillet & J. M. MacDougal. Найден новый для науки вид пассифлоры P. effusa пот. pro vis.
Практическая значимость. Создана крупнейшая в России коллекция видов и сортов Passiflora^ включающая 149 видов, 6 разновидностей и 31 сорт. Получены два новых декоративных сорта пассифлор. Разработана технология размножения in vitro для трёх видов пассифлор, имеющих ресурсное значение или подпадающих под категорию исчезающих видов IUCN. Банк in vitro (ГБС РАН) пополнен редкими и исчезающими видами. Разработана новая технология оздоровления интактного материала путём
прививки на резистентные виды и показано её влияние на дальнейшее развитие растений-регенерантов в стерильной культуре. Оптимизирована методика прививки пассифлор в связи с биоморфологическими особенностями лиановидного стебля. Определено влияние способа прививки и вида подвоя на прохождение фенологических фаз и на морфометрические показатели in vivo. Впервые в России создан банк ДНК пассифлор, представленный 168 образцами.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в докладах на российских и зарубежных конференциях: «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010), «Биоморфологические чтения к 150-летию со дня рождения X. Раункиера» (Киров, 2010), ежегодный конкурс научно-исследовательских работ молодых учёных ГБС РАН (Москва, 2011), «Дендрология, цветоводство и садово-парковое строительство» (Ялта, 2012) и на заседаниях отдела тропических и субтропических растений ГБС РАН (Москва, 2011-2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, включающего 241 источника, в том числе 175 на иностранных языках и приложения. Работа изложена на 152 страницах текста, включая 18 таблиц и 11 рисунков.
Благодарности. Автор выражает искренние благодарности своему научному руководителю Г.Л. Коломейцевой за всестороннюю помощь в проведении исследования, а также О.И. Молкановой, И.Г. Мещерскому, И.В. Ширниной, И.А. Шанцеру, В.Н. Чижову, М.Т. Кръстеву и В.Л. Шелейковскому за ценные советы и помощь в работе. Также мои искренние благодарности Dr. J. MacDougal и Dr. J. Vanderplank за помощь в идентификации пассифлор. Отдельная благодарность моей семье и друзьям за помощь и понимание.
