Введение к работе
Актуальность работы
Большинство сельскохозяйственных растений чувствительны к засолению и засухе, что вызывает существенные потери урожая вследствие действия этих факторов. По данным программы ООН «По защите окружающей среды» приблизительно 70% земель сельскохозяйственного назначения в мире подвержены засолению [Flowers and Yeo, 1995]. На территории Российской Федерации общая площадь засоленных земель составляет 38,4 млн. га т.е. около 20% площадей сельхозугодий. Наибольшее распространение -засоленные почвы получили в Поволжье и Западной Сибири, где их площади составляют 11,6 и 10,2 млн. га, соответственно. В условиях солевого стресса растения, во-первых, испытывают недостаток воды вследствие осмотического шока, и, во-вторых, наблюдаются биохимические изменения в клетках вследствие повышенной аккумуляции ионов (например, Na ) в цитоплазме (токсический эффект).
Долгое время одним из основных направлений повышения устойчивости культурных растений к засолению являлось использование природных генетических механизмов, а именно отбор и дальнейшая селекция наиболее солеустойчивых видов растений. Так, например, известна стратегия отбора солеустойчивых растений путем повторной селекции у перекрестно-опыляемых видов [Dewey, 1962], для самоопыляемых видов предлагается использование линий с мужской стерильностью [Ramage, 1980]; селекция in vitro, широко распространенная в 1980-х годах, однако, не дала каких-либо значимых результатов [Yamaguchi et al., 2005]. Также были предприняты попытки межвидовой гибридизации некоторых важных сельскохозяйственных культур (томат, картофель, пшеница, голубиный горох и т.д.) с дикими солеустойчивыми видами [Yoshida, 2002]. Однако работы в данном направлении не позволили стабильно получать сорта культурных растений, обладающих повышенным уровнем солеустойчивости, которые нашли бы достаточно широкое применение в современном сельскохозяйственном производстве.
Для направленной модификации свойств растений наряду с традиционными методами селекции используются и методы генетической инженерии. В ряде работ было продемонстрировано повышение солеустойчивости растений за счет повышенной экспрессии ключевых ферментов биосинтеза осмолитов, ферментов, нейтрализующих активные формы кислорода. Другой подход основан на стимуляции выведения ионов натрия из цитоплазмы. Активный транспорт ионов определяется градиентом концентрации Н , создаваемым протонными «насосами» и осуществляется за счет последующего обмена ионов, например, по механизму Na /Н -антипортера. Так было показано, что повышенная экспрессия различных протонных насосов, создающих электрохимический градиент на мембранах, увеличивает доступность протонов для Na /Н -антипортера и усиливает
процесс активного выведения токсичных ионов Na из цитоплазмы тем самым, повышая солеустойчивости растений [Sze et al., 1999; Zhang et al., 2001; Apse et al., 1999; Gaxiola et al., 2001]. Так, суперпродукция tghslAVPI, кодирующего вакуолярную пирофосфатазу Arabidopsis thaliana, приводила к повышению засухо- и солеустойчивости трансгенных растений арабидопсиса за счет повышенной аккумуляции ионов Na в вакуолях.
Однако следует отметить, что исследования, проводимые в этом направлении, предполагали экспрессию в трансгенном растении либо его собственного гена, либо гена с той же функцией из другого растения.
Альтернативой является использование для создания трансгенных растений, обладающих повышенной солеустойчивостью, функционально аналогичных растительным ферментам бактериальных мембранных Н -пирофосфатаз, примером которой является пирофосфатаза из фотосинтезирующей бактерии Rhodospirillum rubrum.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось изучение влияния экспрессии гена мембранной Н+-пирофосфатазы из бактерии Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости трансгенных растений табака.
Для этого в работе решались следующие задачи:
Конструирование бинарного вектора, обеспечивающего экспрессию гена мембранной Н+-пирофосфотазы R. rubrum в растениях.
Получение и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген Н+-пирофосфотазы R. rubrum.
Исследование уровня солеустойчивости полученных трансгенных растении, экспрессирующих ген Н+-пирофосфотазы R. rubrum.
Изучение влияния экспрессии гена Н -пирофосфотазы R. rubrum на морфофизиологические характеристики растений табака.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые предложен способ повышения солеустойчивости и улучшения некоторых хозяйственно-ценных признаков растений путем включения в геном растения гена мембранной Н -пирофосфатазы прокариотического происхождения.
Результатом работы стало получение трансгенных растений, экспрессирующих ген мембранной Н -пирофосфатазы R. rubrum, которые обладают повышенной солеустойчивостью. При этом показано, что у полученных трансгенных растений наблюдаются и другие позитивные изменения хозяйственно-ценных признаков, а именно: ускорение роста растений, увеличение длины и массы корневой системы и массы листьев, а также повышение уровня хлорофилла в листьях и биологической продуктивности растений.
В отличие от описанных в других работах способов повышения солеустойчивости, основанных на экспрессии генов вакуолярных пирофосфатаз
растений, предложенный нами способ позволяет не просто обратимо локализовать ионы натрия в вакуолях, но понизить общее содержания натрия в растении за счет его выведения из клетки наружу.
Предложенный способ может быть использован для получения солеустойчивых сортов культурных растений обладающих улучшенными хозяйственно-ценными признаками, такими как ускорение роста, увеличение длины и массы корневой системы и массы листьев, а также повышенной биологической продуктивностью и более высоким уровнем содержания хлорофилла в листьях. Такие культурные растения могут широко применяться в сельскохозяйственном производстве для выращивания на почвах, в настоящее время непригодных из-за засоления.
Апробация работы
Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: The Second International conference on integrated approaches to sustain and improve plant production under drought stress «InterDrought-II» (Италия, 2005), 9-ой и 11-ой Международных Пущинских школах - конференциях молодых ученых (Пущино, 2005, 2007), Четвертом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), IX международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе статья в научном журнале, входящем в перечень ВАК, получен патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы
Диссертация включает: введение; обзор литературы; описание материалов и методов исследования; результаты и их обсуждение; выводы; список литературы.
Работа изложена на 123 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы, 29 рисунков и 174 библиографических ссылок.
Похожие диссертации на Влияние экспрессии гена мембранной H+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости растений табака
